高效液相色譜法同時測定橘紅顆粒中3 種黃酮類成分含量

李 霞，易徐航，楊恢檢，熊 毓

（江西省萍鄉市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉 337000）

橘紅顆粒為祛痰劑，由化橘紅、陳皮、苦杏仁、浙貝母等15味中藥組方，有清肺、止咳、化痰功效，可用于治療痰熱咳嗽、痰多、色黃黏稠、胸悶口干等證。組方藥材中化橘紅、陳皮為祛痰止咳常用藥，且均含多種黃酮類成分，其中化橘紅主要含柚皮苷、蕓香柚皮苷、野漆樹苷等成分［1］，陳皮主要含橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷等［2］。黃酮類化合物為最重要的天然低分子量多酚類化合物，以游離態和糖苷的形式廣泛分布于植物體內［3］。現代藥理學研究表明，化橘紅、柚皮苷具有一定的抗氧化［4］及抑制α- 葡萄糖苷酶活性作用［5］，陳皮具有抗炎［3］和抗氧化［6］及抗心肌缺血和保護心腦血管作用［7］。橘紅顆粒現收載于2020年版《中國藥典（一部）》，但該標準僅對其中陳皮進行了薄層鑒別，采用液相色譜法對浙貝母中的貝母素甲、貝母素乙進行了定性鑒別，并對化橘紅中柚皮苷進行了含量測定。且現有報道多僅對制劑中單味藥材進行質量鑒別或分析［8-19］，缺乏對橘紅顆粒進行全面質量評價的報道。鑒于此，本研究中建立了同時測定橘紅顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷3 種黃酮類成分含量的高效液相色譜（HPLC）法，為全面控制該制劑的質量提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；XSR105型、ME204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度分別為0.01 mg 和0.1 mg）；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 試藥

橘紅顆粒樣品（8 批，均為市售產品，編號為S1 -S8，樣品信息見表1）。蕓香柚皮苷對照品（批號為RF220429 - 06，含量99.68%），柚皮苷對照品（批號為AL210915 - 02，含量98.13%），橙皮苷對照品（批號為PR210902 - 11，含量100%），均購自美國Stanford Chemicals 公司；乙腈、冰醋酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min 時5%A →20%A，15～45 min 時20%A →30%A，45～60 min 時30%A →100%A，60～65 min 時100%A →5%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別稱取蕓香柚皮苷對照品10.91 mg、柚皮苷對照品13.34 mg 和橙皮苷對照品11.62 mg，加甲醇制成質量濃度分別為0.435 0，0.523 6，0.464 8 mg/ mL 的單一對照品貯備液；分別精密量取適量，置同一容量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.043 5，0.052 4，0.046 5 mg/mL的混合對照品溶液。取樣品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇15 mL 使溶解，加熱回流30 min，靜置，冷卻至室溫，用甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按橘紅顆粒處方及工藝分別制備缺化橘紅、陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備相應的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗［8］：取2.2 項下4 種溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷色譜峰峰形對稱，與其他雜質峰分離良好，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關系考察：取2.2項下單一對照品貯備液各適量，加甲醇稀釋，制成含蕓香柚皮苷0.017 4 mg/mL、柚皮苷0.524 0 mg/mL、橙皮苷0.093 0 mg/mL 的混合對照品溶液，分別精密吸取2，4，8，10，12，16，20 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得3種待測成分的回歸方程Y1=15.476 27X1+17.935 27（r=0.999 5），Y2= 14.959 32X2+ 205.641 55（r= 0.999 4），Y3=16.097 39X3+63.082 88（r=0.999 7）。結果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的進樣量分別在0.034 8～0.348 μg、1.047～10.47 μg、0.185 9～1.859 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為0.83%，0.70%，1.00%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷峰面積的RSD分別為0.50%，0.45%，0.46%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為220105）適量，共6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的平均含量分別為0.108 0，3.364 2，0.345 6 mg/ g，RSD分別為2.00%，1.99%，1.92%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為220105）約0.5 g，精密稱定，各6 份，分別精密加入蕓香柚皮苷對照品0.043 5 mg、柚皮苷對照品1.047 2 mg 和橙皮苷對照品0.093 0 mg，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 樣品含量測定

取8 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，采用外標法計算各成分含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of three flavonoids in samples（mg / g，n = 2）

3 討論

3.1 指標成分選擇

該制劑中君藥化橘紅配以陳皮，共奏燥濕化痰之功，兩者含有的黃酮類化合物與低分子右旋糖酐作用相似，能促進血液循環，緩解血液淤滯，減少血小板聚集，達到活血化瘀效果。其主要活性成分為黃酮類化合物蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷，故以其作為指標成分進行含量研究。對于本研究結果是否受藥材的來源、炮制方法、制劑工藝等影響有待進一步考察。

3.2 試驗條件選擇

預試驗中分別對供試品溶液進行超聲和加熱回流處理，處理時間分別為10，30，45，60，90 min，結果顯示，加熱回流提取效果比超聲更好，提取30 min 后的含量無顯著差異。黃酮苷元難溶于水或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑和稀堿液中，故預試驗中提取溶劑分別考察了不同體積分數（20%，40%，70%，100%）的甲醇和乙醇，結果純甲醇提取效果最好，各指標成分能提取完全。因此本研究中最終選擇提取條件為加甲醇加熱回流30 min。

3.3 液相色譜條件選擇

采用二極管陣列檢測器對供試品溶液和對照品溶液在210～400 nm 波長內進行紫外光譜掃描，發現在280 nm 波長處各待測成分響應值較高，同時色譜圖基線平穩，噪聲小，因此選擇280 nm 作為檢測波長。預試驗中分別以甲醇- 水、乙腈- 水、乙腈- 0.1%醋酸水溶液3 種不同流動相進行梯度洗脫，結果顯示，流動相中添加少量的酸有利于改善色譜峰的拖尾及分離度。因此，選用乙腈- 0.1%醋酸水溶液作為流動相，其洗脫效果、各色譜峰峰形、分離度及基線效果均更好。但柚皮苷和橙皮苷保留時間間隔較短，后續仍需進一步優化梯度洗脫條件，以獲得更佳的分離效果和靈敏度。

3.4 方法評價

本研究中建立了同時測定制劑中3 種黃酮類成分（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷）含量的HPLC 法。結果三者含量差異較大，柚皮苷的含量遠高于其他2種黃酮類成分。由于各生產廠家投料用的中藥材質量存在差異，質量控制方法和手段也不盡相同。因此，建立橘紅顆粒多成分含量測定方法對于保證制劑質量安全具有積極意義。