香連止瀉片對惡唑酮誘導潰瘍性結腸炎小鼠的治療作用及其機制

田驕，王婷婷，2，徐意，蘇芮，王晶

1 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2 北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠；3 中藥復方新藥開發國家工程研究中心

潰瘍性結腸炎（UC）是一種以腹痛、腹瀉、便血以及里急后重等為主要特征的腸道慢性炎癥性疾病［1］。UC 的病因目前尚不明確，可能是多種因素共同作用的結果，包括免疫因素、遺傳因素和環境因素等［2］。有研究認為，Th1/Th2 免疫軸失衡在UC 的發生、發展中發揮重要作用，Th1/Th2 免疫軸失衡可導致腸道炎癥加重，加速病情進展［3］。目前，UC主要采取藥物治療，如氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑等［4］。但這些藥物長期大量使用對機體胃腸道的影響較大，易誘發多種不良反應［5］。中醫學上并無“潰瘍性結腸炎”這一病名，根據其臨床特征，本病歸屬中醫“痢疾”“泄瀉”“便血”和“腸風”等范疇。中藥能夠通過抑制炎癥反應及保護腸道黏膜等途徑改善臨床癥狀，不良反應相對較輕。香連止瀉片原方出自清代沈金鰲《沈氏尊生書》中的“香連化滯丸”，具有清熱祛濕、化滯止痢之功效。盡管已有研究證實，香連止瀉片對UC具有較好的臨床療效［6-7］，但對其作用機制的研究報道較少。香連止瀉片的主要成分有木香烴內酯［8］、小檗堿［9］、黃連粗多糖［9］、黃連總生物堿［10］、環氧橙皮油素［11］、白芍總苷［12］，這些成分能夠有效改善UC小鼠結腸組織病理損傷，進而改善UC 癥狀。本課題組前期研究發現，香連止瀉片對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導UC小鼠的治療效果較好，可緩解其體質量減輕、稀便、血便及結腸長度縮短等癥狀或體征，并可修復結腸組織病理損傷［13］。但DSS價格昂貴，其誘導的炎癥反應在動物個體間存在一定差異。惡唑酮為半抗原誘導劑，價格便宜，小鼠直腸給藥后能夠引起小鼠嚴重的便血、稀便等癥狀，同時還能誘導Th1/Th2 免疫軸失衡。2022 年8 月—12 月，本研究探討了香連止瀉片對惡唑酮誘導UC小鼠的治療作用，并基于Th1/Th2免疫軸探討了其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性BALB/c 小鼠48 只，SPF 級，8 周齡，體質量20～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠于北京中研同仁堂醫藥研發有限公司動物房內飼養，自由攝食和飲水。飼養環境：溫度（23.0 ±2.0）℃，相對濕度40%～70%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通風。本研究經北京中研同仁堂醫藥研發有限公司動物倫理委員會審查（倫理審查編號：YJY-2022-082301）。香連止瀉片，購自北京同仁堂科技發展股份有限公司。香連止瀉片研磨粉碎，溶解于超純水中，使其終濃度為10 mg/mL，按體表面積折算法換算，香連止瀉片中劑量為臨床等效劑量，香連止瀉片高、低劑量分別為臨床等效劑量的2、1/2倍。美沙拉嗪緩釋顆粒，購自上海愛的發制藥有限公司。美沙拉嗪緩釋顆粒用羧甲基纖維素鈉溶解，使其終濃度為2 mg/mL，按體表面積折算法換算，美沙拉嗪給藥劑量為臨床等效劑量。惡唑酮，購自美國BioLegend 公司。流式細胞儀，購自美國Agilent公司；酶標儀，購自美國BioTek 公司。TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒，IFN-γ、IL-4 一抗，HRP 標記親和純化山羊抗兔IgG 二抗，APC anti-mouse IFN-γ 抗體、PE anti-mouse IL-4 抗體、PerCP anti-mouse CD4 抗體，購自美國BioLegend公司。

1.2 動物分組與干預 所有BALB/c 小鼠適應性飼養1 周，按隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組以及香連止瀉低、中、高劑量組，每組8 只。模型組、美沙拉嗪組以及香連止瀉低、中、高劑量組采用惡唑酮誘導UC 模型［14］。空白組正常飼養，不予惡唑酮誘導UC 模型。自建模第1 天開始，美沙拉嗪組予美沙拉嗪0.31 g/kg 灌胃，香連止瀉低、中、高劑量組分別予香連止瀉片0.68、1.36、2.72g/kg 灌胃，空白組和模型組予等量超純水灌胃，連續灌胃7天。

1.3 疾病活動指數（DAI）評估 灌胃期間，每日評估DAI。DAI評分標準：0分，體質量不變，大便正常；1 分，體質量下降＜5%，輕微稀便，輕微血便；2 分，體質量下降5%～＜10%，少量稀便，少量血便；3 分，體質量下降10%～＜15%，大量稀便，大量血便；4分，體質量下降≥15%，嚴重腹瀉，血液充滿整個結腸。DAI評分=（體質量下降評分+大便性狀評分+血便評分）/3。

1.4 結腸長度測量和脾臟指數計算 末次灌胃結束，稱量小鼠體質量。麻醉后剪開腹腔，分離脾臟并稱質量，計算脾臟指數。脾臟指數=脾臟質量/體質量。分離結腸，測量整段結腸長度。

1.5 結腸組織病理形態觀察 取小鼠結腸組織，用生理鹽水沖洗腸內容物，去除黏膜表面的糞便和分泌物，截取同一位置病變結腸或正常結腸，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片。切片常規脫蠟至水，高碘酸溶液氧化，Schiff染色，蘇木素染核，常規脫水透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察結腸組織病理形態變化，計數結腸黏膜杯狀細胞數量。

1.6 結腸組織IL-1β、TNF-α 含量檢測 取部分結腸組織，置于冰上勻漿，4 ℃下5 000 r/min 離心20 min、離心半徑10 cm，留取上清液。采用ELISA法檢測結腸組織上清液IL-1β、TNF-α含量。

1.7 結腸組織IFN-γ、IL-4 蛋白表達檢測 每組取3 只小鼠結腸組織，剪碎，加入組織裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。加入5 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至NC 膜上。5% BSA 室溫封閉1 h，分別加入IFN-γ、IL-4、β-actin一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP 標記親和純化山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育1 h。ECL 發光，暗室內曝光、顯影、定影。采用Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

1.8 Th1、Th2 細胞比例檢測 末次灌胃結束，將小鼠麻醉后取血，置于含EDTA 的離心管中，用PBS 將抗凝血液稀釋一倍，輕輕混勻。向離心管中加入3 mL 淋巴細胞分離液，將稀釋的血液平鋪在淋巴細胞分離液上層，室溫下低速離心，吸出淋巴細胞層，離心收集細胞，RPMI 1640 完全培養基重懸，加入Human TruStain FcX?室溫孵育10 min。收集細胞，加入CD4 抗體室溫避光孵育15 min，細胞固定液室溫避光固定，細胞破膜液破膜，分別加入IFN-γ、IL-4抗體室溫避光孵育30 min，上機檢測，分析Th1 細胞和Th2細胞的比例，計算Th1/Th2。

1.9 統計學方法 采用SAS8.2統計軟件。計量資料經Shapiro-Wilk 正態性檢驗符合正態分布且方差齊性，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間DAI評分比較 見表1。

表1 各組不同時間DAI評分比較（± s）

表1 各組不同時間DAI評分比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，△P＜0.05。

?

2.2 各組結腸長度和脾臟指數比較 見表2。

表2 各組結腸長度和脾臟指數比較（± s）

表2 各組結腸長度和脾臟指數比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉中劑量組比較，▲P＜0.05。

?

2.3 各組結腸組織病理形態觀察和結腸黏膜杯狀細胞數量比較 空白組結腸黏膜上皮完整，黏膜杯狀細胞排列規則，形態完整，數量正常，無空泡，內含糖原物質正常；與空白組比較，模型組結腸黏膜上皮不完整，黏膜杯狀細胞排列不規則，數量減少，頂部呈空泡狀，內含糖原物質減少；與模型組比較，香連止瀉低、中、高劑量組和美沙拉嗪組結腸黏膜上皮完整，黏膜杯狀細胞排列規則，形態完整，數量正常，頂部部分呈空泡狀，內含糖原物質趨于正常。空白組、模型組、美沙拉嗪組及香連止瀉低、中、高劑量組結腸黏膜杯狀細胞數量分別為（172.75 ± 15.37）、（47.50 ± 5.29）、（159.18 ± 20.61）、（86.85 ± 8.37）、（103.75 ± 9.57）、（135.66 ± 12.50）個。與空白組比較，模型組結腸黏膜杯狀細胞數量顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組及香連止瀉低、中、高劑量組結腸黏膜杯狀細胞數量均顯著增加（P均＜0.05），以美沙拉嗪組和香連止瀉高劑量組杯狀細胞數量增加較為明顯，幾乎趨近于空白組。

2.4 各組結腸組織TNF-α、IL-1β含量比較 見表3。

表3 各組結腸組織TNF-α、IL-1β含量比較（pg/mg，± s）

表3 各組結腸組織TNF-α、IL-1β含量比較（pg/mg，± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，▲P＜0.05。

?

2.5 各組結腸組織IL-4、IFN-γ蛋白表達比較 見表4。

表4 各組結腸組織IL-4、IFN-γ蛋白相對表達量比較（± s）

表4 各組結腸組織IL-4、IFN-γ蛋白相對表達量比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

?

2.6 各組全血Th1、Th2 細胞比例及Th1/Th2 比較 見表5。

表5 各組全血Th1、Th2細胞比例及Th1/Th2比較（± s）

表5 各組全血Th1、Th2細胞比例及Th1/Th2比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，▲P＜0.05；與香連止瀉中劑量組比較，▽P＜0.05。

?

3 討論

近年來，我國UC患病例數逐漸增多，患病人群呈年輕化趨勢，多見于20～40歲人群。UC病情輕重不等，多呈反復發作的慢性病程，并且隨著病程延長，其癌變概率逐漸升高。UC 不僅會嚴重影響患者生活質量，還會給患者和家庭帶來沉重的經濟負擔［15］。

中醫學認為，外感濕邪、飲食不潔、情志內傷等是UC 病情加重的主要原因，而腸道濕熱、氣滯不通則為其基本病機。香連止瀉片原方出自清代沈金鰲《沈氏尊生書》中的“香連化滯丸”，具有清熱祛濕、化滯止痢之功效，主要用于治療腸中蘊熱引起的紅白痢疾。研究發現，香連止瀉片的主要有效成分能夠不同程度改善UC 癥狀。例如，木香烴內酯可改善UC 小鼠腸道菌群狀態，調節Th1/Th2 免疫軸平衡［8］；黃連粗多糖聯合小檗堿對UC 小鼠腸黏膜屏障具有保護作用［9］，黃連總生物堿對UC 大鼠腸黏膜損傷具有明顯抑制作用［10］，環氧橙皮油素可降低UC小鼠結腸黏膜損傷指數以及結腸組織TNF-α 含量［11］，白芍總苷可減少UC 大鼠結腸組織TNF-α、PGE2等炎癥因子表達［12］。盡管已有研究證實，香連止瀉片對UC 具有較好的臨床療效［6-7］，但對其具體作用機制的研究報道較少。

本研究采用惡唑酮誘導UC小鼠模型，探索了香連止瀉片對UC小鼠的治療作用，并基于Th1/Th2免疫軸探討了其作用機制。本研究首先通過DAI評分初步評估了UC 小鼠疾病嚴重程度，結果發現，模型組各時間DAI評分均顯著高于空白組；香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組在灌胃給藥3 天后DAI 評分開始顯著降低。UC模型動物因持續腹瀉和便血，會導致結腸長度縮短。脾臟是機體重要的免疫器官，而脾臟指數能夠在一定程度上反映機體免疫功能和炎癥反應程度。本研究結果發現，模型組結腸長度顯著小于空白組，脾臟指數顯著高于空白組；香連止瀉高、低劑量組和美沙拉嗪組則能顯著抑制UC小鼠結腸長度縮短，香連止瀉高、中劑量組和美沙拉嗪組則能顯著降低脾臟指數，從而改善小鼠結腸炎癥狀態。本研究PAS染色進一步觀察了結腸組織病理形態變化和結腸黏膜杯狀細胞數量及其分泌狀況，結果發現，模型組結腸組織病理損傷明顯，結腸黏膜上皮破裂，內含糖原物質明顯減少，結腸黏膜杯狀細胞數量顯著降低；香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組結腸組織病理損傷減輕，杯狀細胞排列較規則，形態較完整，內含糖原物質基本趨于正常，杯狀細胞數量顯著增多，從結腸組織病理學角度上進一步印證了香連止瀉片治療UC的有效性。Th1、Th2細胞由CD4+T細胞分化而來，正常情況下機體中Th1/Th2免疫軸處于平衡狀態。Th1/Th2 免疫軸失衡會導致CD4+T 細胞過度活化，從而促進腸道炎癥進展［16］。Th1細胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等，具有促炎作用。IFN-γ能夠重新激活CD4+T細胞向Th1細胞分化，從而參與細胞免疫反應。Th2細胞可分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有抑炎作用。IL-4可使CD4+T細胞向Th2細胞分化，活化B 細胞，從而介導體液免疫和超敏反應［17］。作為UC 患者體內重要的促炎因子，TNF-α 可誘導趨化因子，激活腸道上皮細胞，使腸道中性粒細胞聚集，從而促進UC的發生、發展。TNF-α還可損傷結腸血管內皮細胞，使血管通透性增加，進一步引起結腸黏膜損傷［18］。促炎因子IL-1β在UC的病理生理過程中扮演重要角色。UC患者結腸黏膜中分泌大量IL-1β，促進中性粒細胞浸潤，進而刺激腸道黏膜，加重腸道炎癥反應。本研究結果發現，模型組結腸組織TNF-α、IL-1β 含量顯著高于空白組，提示UC 小鼠腸道炎癥反應明顯。同時，模型組結腸組織IFN-γ蛋白表達以及全血Th1細胞比例和Th1/Th2均顯著高于空白組，結腸組織IL-4蛋白表達和全血Th2 細胞比例顯著低于空白組，提示UC模型小鼠Th1/Th2免疫軸處于失衡狀態，腸道黏膜出現明顯炎癥。與模型組比較，香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組均能降低結腸組織TNF-α、IL-1β含量及IFN-γ蛋白表達，提高IL-4蛋白表達，降低Th1 細胞比例和Th1/Th2，提高Th2 細胞比例，糾正Th1/Th2免疫軸的失衡狀態。本研究以美沙拉嗪作為陽性對照藥物，其主要成分是5-氨基水楊酸，臨床主要用于治療UC。本研究結果顯示，與美沙拉嗪組比較，香連止瀉各劑量組在部分指標上展現出了更好的效果。例如，香連止瀉中劑量組能夠顯著降低結腸組織IFN-γ蛋白表達；香連止瀉中、高劑量組降低Th1細胞比例的效果優于美沙拉嗪組；香連止瀉低劑量組升高Th2細胞比例的效果優于美沙拉嗪組。

綜上所述，不同劑量香連止瀉片對惡唑酮誘導UC小鼠均有一定治療作用，以香連止瀉片高劑量（2倍的臨床等效劑量）效果最佳；糾正Th1/Th2免疫軸失衡，減輕腸道炎癥，可能是香連止瀉片的作用機制之一。