口腔扁平苔蘚患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平與病損程度及Th17/Treg失衡的關系

李玲玲，梁偉騰，后珉紅

天津市第四中心醫院口腔科，天津300140

口腔扁平苔蘚（OLP）是口腔黏膜常見的一種慢性炎癥性疾病，全球患病率約為1.01%，好發于30～60歲女性［1］。OLP大多數為良性病變，但仍有0.8%～1.5%患者可惡變為口腔癌，從而嚴重影響患者生活質量甚至威脅生命安全［2］。目前，OLP 的發病機制尚不完全清楚。普遍認為，CD4＋T 細胞介導的免疫炎癥反應可參與OLP的發生、發展，而輔助性T細胞17（Th17）/調節性T 細胞（Treg）失衡在免疫炎癥反應中發揮重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）是一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，能夠在翻譯水平上調控基因的表達。miR-155-5p 是一種高度保守的miRNA，具有調控T 淋巴細胞增殖、分化及功能的作用［4］。有研究報道，在OLP 組織中miR-155-5p高表達［5］。細胞因子信號傳導抑制蛋白1（SOCS1）是細胞因子信號傳導過程中的負性調節因子，亦可參與調控T 淋巴細胞增殖、分化等。HU 等［6］研究發現，在OLP 組織中SOCS1 低表達。但OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平與病損程度及Th17/Treg失衡的關系仍不清楚。鑒于此，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021 年1 月—2023 年7 月天津市第四中心醫院口腔科收治的OLP 患者76例（觀察組）。OLP 診斷依據《口腔扁平苔蘚診療指南（修訂版）》［2］，其中非糜爛型 28例、糜爛型 48例（輕中度糜爛29例、重度糜爛19例）。納入標準：①符合OLP診斷標準；②初診；③年齡≥18 歲；④病歷資料完整。排除標準：①伴其他口腔疾病者；②伴類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、銀屑病等其他免疫炎癥性疾病者；③合并急慢性感染或惡性腫瘤者；④合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；⑤近3個月內使用免疫抑制劑、糖皮質激素或抗生素者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。其中，男17例、女59例，年齡22～58（48.19 ±6.20）歲。同期隨機另選在天津市第四中心醫院體檢健康的志愿者50例（對照組），男11例、女39例，年齡18～55（48.02 ± 6.07）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經天津市第四中心醫院倫理委員會批準（批件編號：IRM-DWLL-2019139），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 表達檢測 觀察組入組次日、對照組體檢當日，采集空腹外周靜脈血4 mL，待血液自然凝固后，取上清液，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按PrimeScript RT Master Mix 說明將總RNA 逆轉錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix EX Taq? Ⅱ說明進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：miR-155-5p 上游引物5'-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'、下游引物 5'-TTGGGTACCTTAAGTCAAGAG-3'，內參U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；SOCS1 上游引物5'-GCCCTTAGCGTGAAGATGG-3'、下游引物5'-TGTGCGGAAGTGGTGTGTGT-3'，內參GAPDH 上游引物5'-CTTTGGTATCGTGGAAAGACTC-3'、下游引物5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'。PCR反應體系共25 μL：2 × SYBR Green Master PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板5 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 補足至25 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s共40 個循環。PCR 擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 或GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 外周血Th17、Treg 比例檢測 觀察組入組次日、對照組體檢當日，采集空腹外周靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝并等體積稀釋后，加入異硫氰酸熒光素標記的小鼠抗人CD4抗體培養30 min。然后分別加入代表Th17 的抗IL-17A 抗體和代表Treg 的抗叉頭盒蛋白P3 抗體，避光孵育20 min。采用MACSQuant流式細胞儀檢測Th17、Treg 細胞占CD4 細胞比例（即Th17、Treg 比例），計算Th17/Treg。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。相關性分析采用Pearson 或Spearman 相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較 見表1。

表1 兩組血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較

2.2 不同類型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較 見表2。

表2 不同類型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較

2.3 OLP 患者血清miR-155-5p 水平與SOCS1 mRNA 水平的關系 Pearson 相關分析顯示，OLP 患者血清miR-155-5p 水平與血清SOCS1 mRNA 水平呈負相關關系（r＝-0.809，P＜0.01）。

2.4 OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg 的關系 OLP患者血清miR-155-5p 水平與外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈正相關關系（r/rs分別為0.819、0.820，P均＜0.05），與Treg 比例呈負相關關系（r=-0.735，P＜0.05）；血清SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈負相關關系（r/rs分別為-0.770、-0.790，P均＜0.05），與Treg 比例呈正相關關系（r=0.733，P＜0.05）。

3 討論

OLP 是發生于口腔黏膜的自身免疫性、非感染性、慢性炎癥性疾病，其發病與口腔局部刺激、感染、免疫等因素有關［2］。OLP 不僅會損害口腔黏膜，口腔局部炎癥反應還能通過血液循環引起全身炎癥反應，導致心血管疾病、神經系統疾病、消化系統疾病等，同時因口腔黏膜損傷遷延難愈還會增加口腔癌的發生風險［7］。目前，對于OLP 臨床尚無根治辦法或特效治療藥物。因此，深入探索OLP 的發生機制對提高其診治水平具有重要意義。

有研究表明，CD4＋T 細胞功能異常能夠引起細胞免疫功能紊亂，通過攻擊口腔黏膜細胞導致口腔黏膜慢性炎癥反應，從而促進OLP 的發生、發展［3］。Th 細胞是CD4＋T 細胞被激活分化而來，能夠分泌多種細胞因子，在維持機體正常免疫功能方面發揮重要作用。其中，Th17可通過分泌IL-17A～IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等促炎細胞因子，促進炎癥反應；Treg通過分泌IL-10、IL-35、叉頭盒蛋白P3、轉化生長因子β 等抗炎細胞因子，抑制炎癥反應，具有很強的免疫抑制活性。正常免疫狀態下，Th17/Treg 處于動態平衡，Th17/Treg 失衡則會引起CD4＋T 細胞功能異常，從而導致OLP的發生、發展［8-9］。本研究結果顯示，OLP患者外周血Th17 比例和Th17/Treg 明顯升高，二者隨著病損程度增加而逐漸升高；而外周血Treg 比例明顯降低，并且隨著病損程度增加而逐漸降低。結果表明，OLP 患者外周血Th17/Treg 明顯失衡，并且Th17/Treg失衡與OLP病損程度增加有關，與既往研究［8-9］報道一致。

miRNA 是一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，可通過與靶mRNA 的3′非翻譯區特異性結合而抑制mRNA 翻譯或促進其降解［10］。miR-155-5p 屬于miRNA 家族成員之一，定位于人染色體21q21.3。既往研究發現，miR-155-5p 在激活的免疫細胞中高表達，如巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞等，而敲除miR-155-5p 則會導致免疫細胞功能破壞，提示miR-155-5p 對維持機體免疫功能十分重要［11］。ZHENG 等［12］研究報道，上調miR-155-5p表達能夠促進CD4＋T 細胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，導致慢性牙周炎患者外周血Th17/Treg 失衡。ZHU等［13］研究發現，沉默miR-155-5p 表達能夠抑制CD4＋T 細胞向Th17 分化，并促進其向Treg 分化，進而減輕炎癥性腸病患者外周血Th17/Treg 失衡。本研究結果發現，觀察組血清miR-155-5p 水平明顯高于對照組，與其在OLP 組織中的表達變化一致［5］。本研究結果還發現，非糜爛型OLP 及糜爛型OLP 輕中度糜爛、重度糜爛患者血清miR-155-5p 水平逐漸升高，提示血清miR-155-5p 水平升高與OLP 病損程度增加有關。進一步研究發現，OLP 患者血清miR-155-5p水平與外周血Th17 比例和Th17/Treg 呈正相關關系，與Treg 比例呈負相關關系，提示血清miR-155-5p 水平升高可能通過誘導外周血Th17/Treg 失衡參與OLP 的發生、發展。究其原因，血清miR-155-5p 水平升高能夠誘導初始CD4＋T 細胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，從而導致外周血Th17/Treg失衡。

SOCS 家族是一類能夠反饋性阻斷細胞因子信號傳導的負性調節因子，包括SOCS1～SOCS7及CIS等成員。SOCS1 在T 細胞分化、發育的各個階段均有表達，SOCS1 缺失可導致T 細胞分化和發育異常［14］。既往研究報道，SOCS1 能夠抑制CD4＋T 細胞向Th17分化并促進其向Treg分化，而SOCS1缺陷或缺失則會導致Th17/Treg 失衡［15］。因此，SOCS1 對CD4＋T 細胞分化發育具有重要的調控作用。本研究結果發現，觀察組血清SOCS1 mRNA 水平明顯低于對照組，與其在OLP 組織中表達變化一致［6］。本研究結果還發現，非糜爛型OLP 及糜爛型OLP 輕中度糜爛、重度糜爛患者血清SOCS1 mRNA 水平逐漸降低，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低與OLP 病損程度增加有關。進一步研究發現，OLP 患者血清SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17 比例和Th17/Treg呈負相關關系，與Treg 比例呈正相關關系，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低可能通過誘導外周血Th17/Treg 失衡而參與OLP 的發生、發展。究其原因，血清SOCS1 mRNA 水平降低能夠誘導初始CD4＋T 細胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，從而導致外周血Th17/Treg失衡。本研究還發現，OLP患者血清miR-155-5p 水平與血清SOCS1 mRNA 水平呈負相關關系，提示miR-155-5p 和SOCS1 可能通過調節外周血Th17/Treg 平衡而參與OLP 的發生、發展。近年研究表明，miR-155-5p 與SOCS1 具有靶向調控關系，如在系統性硬化癥、風濕性關節炎中，miR-155-5p高表達能夠靶向下調SOCS1表達而導致Th17/Treg 失衡［16-17］。最近CHENG 等［18］研究亦指出，miR-155-5p 能夠通過靶向抑制SOCS1 表達而誘導口腔黏膜上皮細胞分泌炎癥因子，進而促進OLP的發生、發展。但二者在OLP 發生、發展中的具體作用機制及靶向調控關系仍需進一步研究。

綜上所述，OLP患者血清miR-155-5p水平升高、血清SOCS1 mRNA 水平降低，二者水平變化與病損程度加重和Th17/Treg失衡密切相關。