基于Fas/FasL 信號通路探索舒芬太尼對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡的影響

金成浩，元順女，樸龍一

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院麻醉科，北京100730

急性心肌梗死（AMI）是一種常見的心血管疾病，具有高發(fā)病率和高病死率的特點［1］。AMI 發(fā)生后，由于缺血、缺氧，局部心肌組織壞死，大量心肌細(xì)胞凋亡，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心肌纖維化，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心力衰竭［2］。因此，抑制或減少心肌細(xì)胞凋亡能夠阻止AMI 后的心臟重構(gòu)并改善心功能。脂肪酸合成酶（Fas）/脂肪酸合成酶配體（FasL）信號通路是細(xì)胞凋亡的重要通路，抑制該信號通路激活可抑制心肌細(xì)胞凋亡［3］。舒芬太尼屬于μ型阿片受體激動劑，是一種強(qiáng)效的阿片類鎮(zhèn)痛藥，常用于心臟手術(shù)的輔助麻醉和麻醉誘導(dǎo)。有研究報道，舒芬太尼對心肌缺血再灌注損傷具有心臟保護(hù)作用，可縮小心肌缺血再灌注所致的心肌梗死面積［4］。但舒芬太尼是否通過調(diào)控Fas/FasL 信號通路影響心功能和心肌細(xì)胞凋亡，目前尚不清楚。2022 年10 月—2023 年6 月，本研究基于Fas/FasL 信號通路探索了舒芬太尼對AMI 大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD 大鼠108 只，清潔級，8 周齡，體質(zhì)量（200 ± 20）g，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2020-0005。所有SD 大鼠于SPF 級動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～26 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通風(fēng)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：20220401）。舒芬太尼，購自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司。Fas shRNA 慢病毒和NC shRNA慢病毒，購自山東維真生物科技有限公司。DM IL LED 型熒光顯微鏡，購自德國Leica 公司；SuPerMax 3000FL 型多功能酶標(biāo)儀，購自上海閃譜生物科技有限公司。TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bcl-2、Bax 一抗，購自美國CST 公司；Caspase-3 一抗，購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物分組與干預(yù) 所有SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，隨機(jī)分為對照組、模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組，每組18只。模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 +Fas 慢病毒組通過冠狀動脈左前降支結(jié)扎法制作AMI 模型［5］，對照組除不結(jié)扎冠狀動脈左前降支外，其余步驟與AMI 模型相同。結(jié)扎成功后，肉眼可見結(jié)扎區(qū)域以下組織蒼白或發(fā)紺，搏動減弱，心電圖出現(xiàn)ST 段持續(xù)抬高，即AMI 模型制作成功。舒芬太尼低劑量組和舒芬太尼高劑量組分別于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射0.1、1 μg/kg舒芬太尼［6］。舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組和舒芬太尼高劑量 + Fas 慢病毒組分別于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射1 μg/kg 舒芬太尼和尾靜脈注射200 nmol/kg NC shRNA 慢病毒或Fas shRNA 慢病毒。對照組和模型組均腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 血清肌鈣蛋白T 檢測 術(shù)后72 h，采集大鼠尾靜脈血1 mL，2 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，采用ELISA 法檢測血清肌鈣蛋白T。

1.4 心功能檢測 術(shù)后72 h，采用超聲心動圖檢測大鼠在3 個連續(xù)心動周期中左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）。

1.5 血清TNF-α、IL-6 檢測 待大鼠心功能檢測完成后，腹主動脈取血，2 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6。

1.6 心肌梗死面積檢測 待大鼠采血結(jié)束，斷頭處死，留取心臟。隨機(jī)選擇6 只大鼠的心臟組織，常規(guī)固定、包埋、切片。將切片置于2% TTC 溶液中，37 ℃染色30 min，4%多聚甲醛固定后拍照。采用Image J 軟件分析心肌梗死面積和整個心肌橫斷面面積，計算心肌梗死部分占心肌橫斷面面積的百分比。

1.7 心肌組織病理形態(tài)觀察 隨機(jī)選擇6 只大鼠的心臟組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，脫水、透明，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)變化。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測 取上述石蠟切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，漂洗后加入蛋白酶K 工作液，再次漂洗后加入TUNEL 檢測液50 μL，37 ℃避光孵育1 h。然后滴加DAPI 避光染核10 min，封片液封片。熒光顯微鏡下拍照計數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 細(xì)胞凋亡及Fas/FasL 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 取剩余6 只大鼠的心臟組織，液氮下研磨成粉末，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液冰上裂解，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入1 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、FasL、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌損傷程度和心功能比較 見表1。

表1 各組血清肌鈣蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比較（± s）

表1 各組血清肌鈣蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組血清TNF- α、IL-6 水平比較 見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，± s）

表2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.3 各組心肌梗死面積占比比較 對照組、模型組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組、舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組心肌梗死面積占比分別為0、（32.54 ±3.26）%、（23.58 ± 2.41）%、（8.63 ± 0.86）%、（9.14 ±0.91）%、（27.66 ± 2.77）%。與對照組比較，模型組心肌梗死面積增大（P＜0.05）。與模型組比較，舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組心肌梗死面積減小，并且以舒芬太尼高劑量組心肌梗死面積減小較為明顯（P均＜0.05）。與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，舒芬太尼高劑量 + Fas慢病毒組心肌梗死面積增大（P＜0.05）。

2.4 各組心肌組織病理形態(tài)觀察 對照組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，無明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤。與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞形態(tài)模糊、紋理消失、排列紊亂、心肌間小血管擴(kuò)張、細(xì)胞數(shù)量減少，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，舒芬太尼低劑量組和舒芬太尼高劑量組心肌細(xì)胞形態(tài)、紋理、排列、血管擴(kuò)張、細(xì)胞數(shù)量及炎性細(xì)胞浸潤顯著改善，并且以舒芬太尼高劑量組改善較為明顯。舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組心肌細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則，心肌纖維排列相對整齊，水腫和炎性細(xì)胞浸潤較輕。與舒芬太尼高劑量 + Fas 陰性對照組比較，舒芬太尼高劑量 + Fas 慢病毒組心肌細(xì)胞形態(tài)模糊、紋理消失、排列紊亂、心肌間小血管擴(kuò)張、細(xì)胞數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤明顯。

2.5 各組心肌細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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2.6 各組心肌細(xì)胞Fas/FasL 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表4。

表4 各組心肌細(xì)胞Fas、FasL蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

表4 各組心肌細(xì)胞Fas、FasL蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與舒芬太尼低劑量組比較，△P＜0.05；與舒芬太尼高劑量 + Fas陰性對照組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

AMI 是一種臨床常見的心血管疾病，在世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高病死率的特點。AMI的主要表現(xiàn)為心肌大面積壞死、心肌收縮力減弱，從而導(dǎo)致供血不足及其他惡性并發(fā)癥的發(fā)生。盡管人們在開發(fā)新型心臟保護(hù)劑方面付出了巨大努力，但成果并不理想，迫切需要闡明AMI 的分子機(jī)制，以開發(fā)新的治療策略。

AMI發(fā)生后，心臟的泵血功能會受到影響，主要原因為心肌細(xì)胞缺血缺氧而發(fā)生壞死，導(dǎo)致心肌收縮力減弱，心臟射血功能降低，進(jìn)而影響全身血液供應(yīng)。肌鈣蛋白T是AMI發(fā)生后心肌損傷的生物標(biāo)志物。LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd 主要反映心臟的收縮和舒張功能。有研究報道，在連續(xù)心動周期中，若出現(xiàn)LVEF、LVFS降低，LVEDd、LVESd升高，則提示大鼠心功能出現(xiàn)異常［7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMI大鼠血清肌鈣蛋白T 水平升高，LVEF、LVFS 降低，LVEDd、LVESd 升高，與既往的研究［7］結(jié)果一致，表明AMI 大鼠出現(xiàn)了心功能損傷。AMI 發(fā)生后，先天免疫反應(yīng)被激活，大量炎性細(xì)胞因子被釋放，過度炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致心肌形成大量瘢痕組織和纖維化，引起心室重塑，最終影響心功能。其中，TNF-α、IL-6參與炎癥反應(yīng)，并在AMI 發(fā)生后水平升高。有研究報道，大鼠AMI 發(fā)生后心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6 含量升高，抑制TNF-α、IL-6 則可對AMI 大鼠的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用［8］。此外，過度的炎癥反應(yīng)會引起心肌細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，過度凋亡會被纖維組織及成纖維細(xì)胞取代，從而破壞心肌的結(jié)構(gòu)和功能。有研究報道，抑制AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡能夠顯著改善心功能，阻止心肌損傷［9］。細(xì)胞凋亡過程受多種基因的共同調(diào)控，Bax 是促進(jìn)凋亡基因，Bcl-2 是抑制凋亡基因［10］。Caspases 家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Caspase-3 是Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的促凋亡蛋白，是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子［11］。有研究顯示，促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)、抑制Bax 表達(dá)能夠在一定程度上減輕心肌細(xì)胞凋亡，有助于改善左心室功能以及減輕心室重塑［12］。本研究結(jié)果顯示，模型組血清TNF-α、IL-6 水平和心肌細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示AMI 發(fā)生后可引起炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡。

阿片類麻醉劑在AMI 動物模型中具有心肌保護(hù)作用，不僅能緩解心肌梗死癥狀、減少心肌梗死面積、減輕心肌缺血損傷，還能改善心臟微循環(huán)障礙，促進(jìn)心功能恢復(fù)。舒芬太尼是一種在心血管手術(shù)中廣泛應(yīng)用的新型μ型阿片受體激動劑，具有良好的鎮(zhèn)痛效果。此外，舒芬太尼的血流動力學(xué)穩(wěn)定，可發(fā)揮心臟保護(hù)作用［13］。據(jù)報道，舒芬太尼可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡和自噬［14］。舒芬太尼能夠提高缺血再灌注心肌細(xì)胞的增殖活性，降低細(xì)胞凋亡率［15］。本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼可降低AMI大鼠血清肌鈣蛋白T 水平，升高LVEF、LVFS，降低LVEDd、LVESd和心肌梗死面積，表明舒芬太尼能夠改善AMI大鼠心功能。此外，舒芬太尼干預(yù)后，AMI大鼠血清TNF-α、IL-6 水平和心肌細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，提示舒芬太尼可抑制AMI 大鼠心肌炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，具有心臟保護(hù)作用。

Fas/FasL信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一條重要途徑，該信號通路可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌，激發(fā)炎癥反應(yīng)，從而參與免疫逃逸、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等過程［16］。Fas 是一種典型的死亡受體，而FasL 是結(jié)合Fas 的Ⅱ型膜蛋白，兩者均屬于腫瘤壞死因子家族。Fas 與FasL 的相互作用可導(dǎo)致pro-Caspase-8 裂解激活Caspase-8，再通過介導(dǎo)的Caspase 級聯(lián)反應(yīng)激活Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。FasL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與多種病理生理過程密切相關(guān)。AMI 發(fā)生后，心肌細(xì)胞因缺血缺氧而壞死，這可能觸發(fā)了Fas/FasL信號通路的激活，一旦Fas與FasL 結(jié)合，它們將啟動凋亡信號的傳導(dǎo)，進(jìn)一步加劇心肌細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞凋亡還能影響心肌細(xì)胞的修復(fù)和再生，從而影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。據(jù)報道，正常心肌組織Fas、FasL蛋白表達(dá)較低，AMI 發(fā)生后其表達(dá)明顯上升，抑制Fas、FasL 蛋白表達(dá)，可減少Caspase-8、Caspase-3活化［17］。另有研究報道，下調(diào)Fas、FasL 表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善左心室重塑［18］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)as、FasL 在模型組心肌組織中高表達(dá)，舒芬太尼可顯著下調(diào)Fas、FasL 表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。Fas 慢病毒轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。提示舒芬太尼可能通過下調(diào)Fas、FasL 表達(dá)而抑制AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，舒芬太尼可改善AMI 大鼠心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，并且1 μg/kg 舒芬太尼的作用效果要優(yōu)于0.1 μg/kg 舒芬太尼；抑制Fas/FasL 信號通路激活可能是舒芬太尼改善AMI 大鼠心功能的作用機(jī)制之一。但舒芬太尼調(diào)控Fas/FasL 信號通路的具體分子機(jī)制仍不十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。