耳甲電針療法對CUMS誘導抑郁癥大鼠的治療作用及其機制

毛樹文，宗成翠，孫付軍，趙新芝

1 山東中醫藥大學附屬醫院推拿科，濟南 250014；2 沂水縣人民醫院康復科；3 山東省中醫藥研究院藥理研究所

抑郁癥是一種常見的精神障礙，主要癥狀為情緒紊亂、快感缺乏、認知功能障礙等［1-2］。預計到2030年，抑郁癥將成為全球第一大負擔疾病［3］。抑郁癥可嚴重影響患者日常生活和社會功能。雖然抗抑郁藥物（如氟西汀）能夠在一定程度上緩解抑郁癥狀，但仍有約三分之一患者治療反應不佳，并且長期用藥可能會引起一系列不良反應。因此，探索高效低毒的抑郁癥治療方案具有重要意義。耳甲電針療法是治療抑郁癥的一種替代性方法，可改善抑郁癥狀且不良反應較少。但目前耳甲電針療法治療抑郁癥的作用機制尚未完全闡明。有研究報道，蛋白激酶A（PKA）/環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）信號通路異常與抑郁癥的發生密切相關［4］。HOU等［5］研究證實，電針療法能夠刺激PKA/CREB 信號通路，而耳甲電針療法是否通過刺激該信號通路發揮抗抑郁作用尚不清楚。2021 年5 月—2022 年12 月，本研究觀察了耳甲電針療法對慢性不可預知溫和應激（CUMS）誘導抑郁癥大鼠的治療作用及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，SPF 級，6 周齡，體質量（220 ± 20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：SCXK（魯）20190003。飼養環境：溫度23～26 ℃，相對濕度（50 ± 10）%，光照12 h/12 h 明暗交替，保持通風。本研究經山東中醫藥大學附屬醫院動物倫理委員會批準（批件號：2022-0567）。鹽酸氟西汀分散片，購自山東力諾制藥有限公司；異氟烷麻醉劑，購自深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司。無菌針灸針，購自蘇州環球針灸醫療器械有限公司；電子針療儀，購自南京貝登醫療股份有限公司；小動物麻醉機，購自深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司；全波長酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。蛋白激酶A-α（PKA-α）、環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、磷酸化CREB（p-CREB）、GAPDH 一抗，購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組干預 SD 大鼠分籠飼養，自由攝食、飲水。適應性飼養7天，隨機分為對照組、模型組、氟西汀組、耳甲電針組，每組6只。對照組正常群養，每日灌胃生理鹽水2 mL，不予特殊干預，連續35天。模型組、氟西汀組、耳甲電針組孤養，均予CUMS 暴露35 天。CUMS 暴露［6］：每日隨機進行冷水游泳（4 ℃5 min）、夾尾（3 min）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、潮濕墊料（24 h）、晝夜顛倒（12 h/12 h）中的一項刺激，同一種刺激不可連續使用。氟西汀組實驗第14 天開始在CUMS暴露前2 h予1 mg/mL鹽酸氟西汀10 mg/kg灌胃，每日1次，連續21天；耳甲電針組實驗第14天開始在CUMS暴露前2 h，異氟烷麻醉后予電針刺激雙側耳甲神門穴，刺激強度2 mA、頻率20 Hz，每日1 次，每次30 min，連續21 天。SD 大鼠出現糖水消耗量、體質量、活動量明顯下降，即為建模成功。

1.3 抑郁相關指標觀察

1.3.1 體質量 實驗前和實驗第14、35 天，使用電子臺秤稱量大鼠體質量。

1.3.2 自發活動行為和探索行為 實驗前和實驗第14、35天，通過曠場實驗觀察大鼠自發活動行為和探索行為。曠場裝置由一個長80 cm × 寬80 cm × 高40 cm的箱體組成，內壁涂黑，底面平均分成25 個16 cm ×16 cm黑白相間的正方形格子，正上方固定數碼相機，視野覆蓋曠場內部。將每只大鼠置于箱體底部中央，自由運動5 min，記錄穿越格子數和站立次數。穿越格子數越多，表明自發活動行為越多。站立次數越多，表明對環境的好奇心越強，探索行為越活躍。

1.3.3 快感缺失行為 實驗前和實驗第14、35 天，通過糖水偏好實驗評估大鼠快感缺失行為。實驗前對大鼠進行2天糖水適應訓練，實驗前1天禁食禁水23 h。隨后置于籠內孤養，籠內放置兩個分別裝有150 mL 1%蔗糖溶液和150 mL純水的瓶子。1 h后，稱量兩個瓶子的質量，記錄糖水和純水的消耗量，計算糖水偏好指數。糖水偏好指數=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

1.4 PKA/CREB 信號通路蛋白表達檢測 實驗第35 天，其他測試結束后斷頭取腦，分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。采用RIPA 裂解液提取組織總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。然后加入5 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物電轉印至PVDF膜上。1 × TBST室溫封閉，然后分別加入PKA-α（稀釋比1∶2 000）、p-CREB（稀釋比1∶500）、CREB（稀釋比1∶500）、GAPDH（稀釋比1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育60 min。ECL發光，暗室內曝光、顯影、定影。采用Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料服從正態分布且方差齊性，以xˉ ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間體質量比較 見表1。

表1 各組不同時間體質量比較（g，± s）

表1 各組不同時間體質量比較（g，± s）

注：與對照組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，#P＜0.05。

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2.2 各組不同時間自發活動行為和探索行為比較 見表2。

表2 各組不同時間自發活動行為和探索行為比較（± s）

表2 各組不同時間自發活動行為和探索行為比較（± s）

注：與對照組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，#P＜0.05。

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2.3 各組不同時間快感缺失行為比較 見表3。

表3 各組不同時間快感缺失行為比較（± s）

表3 各組不同時間快感缺失行為比較（± s）

注：與對照組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，#P＜0.05。

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2.4 各組海馬組織PKA/CREB 信號通路蛋白表達比較 見表4。

表4 各組海馬組織PKA-α、CREB、p-CREB蛋白相對表達量比較（± s）

表4 各組海馬組織PKA-α、CREB、p-CREB蛋白相對表達量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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3 討論

近年來，隨著社會經濟快速發展，人們的生活節奏逐漸加快，工作壓力日益增大，由此導致的精神心理問題越來越多。抑郁癥是一種全球性的精神疾病，其發病率呈逐年上升趨勢，預計到2030年，將成為全球第一大負擔疾病［3］。抑郁癥不僅會影響患者的日常生活、工作和學習，還會影響患者的心理健康，導致情緒持續低落、興趣喪失，繼而引起一系列身體癥狀，如睡眠障礙、食欲改變［7］。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，是目前治療抑郁癥的一線藥物之一。氟西汀可通過抑制5-羥色胺的再攝取來增加突觸間隙的5-羥色胺濃度，從而發揮抗抑郁作用。但長期應用氟西汀會出現性功能障礙、胃腸道不適等不良反應，并且約三分之一的抑郁癥患者對氟西汀治療無反應。這些問題限制了氟西汀的臨床應用，部分抑郁癥患者因無法耐受而中途停藥。因此，尋找高效低毒的抑郁癥治療方案具有重要意義。

中醫認為，耳與經絡臟腑有著密切聯系，六經雖然不直接于耳，但能通過陽經與耳聯系，其病理生理過程也經此傳達至耳。臨床研究證實，耳針療法對抑郁癥有一定臨床療效，其治療抑郁癥的耳穴均分布于耳甲的迷走神經分布區域［8］。2005年美國FDA批準迷走神經刺激療法用于治療難治性抑郁癥［9］。有研究發現，接受迷走神經刺激療法的抑郁癥患者腦脊液中γ-氨基丁酸的總水平和游離水平顯著升高，而谷氨酸水平顯著降低，這可能是其治療機制之一［10］。耳甲電針能夠激活耳甲腔和外耳道的迷走神經末梢，其傳入纖維到達下神經節的假單極神經元，經傳入神經纖維向內傳入孤束核，而孤束核可與諸多腦區發生聯系。因此，耳甲電針療法對情志疾病具有獨特優勢，如療效好、費用低、不良反應少等。但目前耳甲電針療法的作用機制仍不十分清楚。

本研究通過CUMS 誘導抑郁癥大鼠模型，基于PKA/CREB信號通路探索了耳甲電針療法對抑郁癥的作用機制。本研究結果發現，模型組實驗第14天與第35天體質量、自發活動行為和探索行為以及糖水偏好指數均顯著低于對照組同期，提示抑郁癥模型構建成功。本研究結果發現，耳甲電針組和氟西汀組實驗第35天體質量顯著高于模型組同期，說明耳甲電針和氟西汀治療后均能抑制大鼠體質量降低；耳甲電針組和氟西汀組實驗第35天自發活動行為和探索行為均顯著高于模型組同期，說明耳甲電針和氟西汀治療后均能改善抑郁樣行為；耳甲電針組和氟西汀組實驗第35 天糖水偏好指數均顯著高于模型組同期，說明耳甲電針和氟西汀治療后均能顯著增強大鼠對糖水獎賞的敏感性。耳甲電針組與氟西汀組體質量、自發活動行為和探索行為以及糖水偏好指數比較差異均無統計學意義。表明耳甲電針和氟西汀治療抑郁癥大鼠的效果相當。

已有研究證實，PKA/CREB 信號通路能夠參與調節突觸可塑性和學習記憶，該信號通路的系統性擾動可引起抑郁癥神經病理學的級聯反應，包括區域大腦活動異常、突觸功能改變和神經損傷［11-13］。PKA是一種cAMP依賴性蛋白激酶，能夠磷酸化多種底物蛋白，從而調節細胞內的信號傳導。CREB是一種受cAMP 和Ca2+調節的轉錄因子，能夠參與大腦發育、神經元存活和神經發生。在抑郁癥患者及動物模型中，PKA/CREB信號通路的活性通常受到抑制，導致海馬區神經元的興奮性和突觸可塑性降低。PKA催化亞基解離，入核后磷酸化CREB，p-CREB 進一步參與機體神經元生長、神經保護、細胞修復、記憶功能等［14］。本研究結果發現，模型組海馬組織PKA-α、p-CREB蛋白相對表達量均顯著低于對照組；氟西汀組和耳甲電針組海馬組織PKA-α、p-CREB蛋白相對表達量均顯著高于模型組，但氟西汀組與耳甲電針組海馬組織PKA-α、p-CREB蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義。結果表明，抑郁癥大鼠海馬組織PKA-α 和p-CREB 蛋白表達下調，而耳甲電針和氟西汀治療則可上調海馬組織PKA-α 和p-CREB 蛋白表達，并且耳甲電針與氟西汀的治療效果相當。

綜上所述，耳甲電針療法能夠改善CUMS誘導抑郁癥大鼠抑郁樣行為，其效果與氟西汀相當；激活海馬組織PKA/CREB信號通路可能是其作用機制之一。