腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7表達(dá)變化及其臨床意義

許海，魏民，楊德福，張恒柱

1 揚(yáng)州大學(xué)附屬江都人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇揚(yáng)州 225202；2 揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)外科

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高病死率等特征。在我國(guó)腦膠質(zhì)瘤的年發(fā)病率為5/10 萬(wàn)～8/10 萬(wàn)，5 年病死率僅次于肺癌和胰腺癌［1-2］。但目前腦膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）雖然不具有蛋白編碼功能，但其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3］。乳腺癌抗雌激素耐藥基因4（BCAR4）是近年發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA。有研究報(bào)道，lncRNA BCAR4異常表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)［4］。基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）是一種分泌型蛋白，能夠通過蛋白水解作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等［5］。郭秀蓮等［6］研究報(bào)道，上調(diào)MMP-7表達(dá)可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲并抑制其凋亡。但目前l(fā)ncRNA BCAR4、MMP-7表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不完全清楚。鑒于此，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年2 月—2020 年8 月?lián)P州大學(xué)附屬江都人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤患者98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷為腦膠質(zhì)瘤；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③接受腦膠質(zhì)瘤次全切除術(shù)或全切除術(shù)；④臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦轉(zhuǎn)移瘤者；②合并顱內(nèi)其他疾病者；③合并其他部位惡性腫瘤者；④合并急慢性感染者；⑤合并免疫或血液系統(tǒng)損害者；⑥年齡＜18 歲者。其中，男55 例、女43例，年齡23～82（60.54 ± 8.54）歲，腫瘤位置：額部41 例、顳部57 例，腫瘤最大徑：＜3 cm 48 例、≥3 cm 50 例，組織分化程度：低分化37 例、中高分化61例；WHO 分級(jí)［7］：Ⅰ級(jí)22 例、Ⅱ級(jí)34 例、Ⅲ級(jí)26例、Ⅳ級(jí)16 例。本研究經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬江都人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2017 倫字1223），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取術(shù)中切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織及其配對(duì)的瘤旁組織（經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確為正常組織），液氮下速凍后研磨成粉末。采用TRIzol 法提取組織總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按TaKaRa RNA PCR Kit 說(shuō)明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 5 s。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列由上海劍鈍生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。lncRNA BCAR4 上游引物5'-GCCACAGGAGCTAGAGCAGT-3'、下游引物5'-GCAGAGTATTCAGGGTAAGGGT-3'，MMP-7 上游引物5'-GAAGGGCCGAAGAGCTCAAT-3'、下游引物5'-GGCTCGCAAAGTGTCTGTTG-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'、下游引物5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板1 μL，2 × Hieff?PCR Master 8 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，RNase-free ddH2O 5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s 共40 個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 腦膠質(zhì)瘤患者出院后通過電話或門診復(fù)查形式定期隨訪3年，第1年每3個(gè)月隨訪1次，之后每半年隨訪1次。隨訪截至2023年8月31日，終點(diǎn)事件為患者死亡或至隨訪截至日期，統(tǒng)計(jì)患者生存時(shí)間。以腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA相對(duì)表達(dá)量的均值為臨界值，將患者分為lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 高表達(dá)者與低表達(dá)者，分析腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用多因素Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與瘤旁正常組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 表達(dá)比較 腦膠質(zhì)瘤組織與瘤旁正常組織lncRNA BCAR4 相對(duì)表達(dá)量分別為2.42± 0.67、1.13 ± 0.22，MMP-7 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.17、0.54 ± 0.10。腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于瘤旁正常組織（t分別為18.094、22.594，P均＜0.01）。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA表達(dá)的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4 相對(duì)表達(dá)量與MMP-7 mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.810，P＜0.01）。

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，98例腦膠質(zhì)瘤患者失訪4例、死亡45例，3年生存率為54.08%，平均生存時(shí)間為26.596 個(gè)月。lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA高表達(dá)者分別有48、51例，其低表達(dá)者分別有50、47例。lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA高表達(dá)者平均生存時(shí)間分別為22.047、22.234個(gè)月，其低表達(dá)者分別為30.148、30.609個(gè)月。lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 高表達(dá)者平均生存時(shí)間均低于其低表達(dá)者（Log-rankχ2分別為11.357、11.666，P均＜0.01）。

2.5 腦膠質(zhì)瘤患者死亡的危險(xiǎn)因素 腦膠質(zhì)瘤患者死亡者與存活者臨床資料比較見表2。以年齡（＜60 歲=0，≥60 歲=1）、組織分化程度（中高分化=0，低分化=1）、WHO 分級(jí)（Ⅰ、Ⅱ級(jí)=0，Ⅲ、Ⅳ級(jí)=1）、lncRNA BCAR4 表達(dá)（原值錄入）、MMP-7 mRNA 表達(dá)（原值錄入）為自變量，以隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，以生存狀態(tài)（存活=0，死亡=1）為因變量，納入多因素Cox 回歸模型。結(jié)果顯示，組織分化程度低分化和WHO 分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)以及l(fā)ncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 表達(dá)升高為腦膠質(zhì)瘤患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見表3。

表2 腦膠質(zhì)瘤患者死亡者與存活者臨床資料比較［例（%）］

表3 腦膠質(zhì)瘤患者死亡的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顱內(nèi)惡性腫瘤，以顱內(nèi)壓增高、神經(jīng)功能障礙和癲癇發(fā)作為主要臨床表現(xiàn)。迄今為止，腦膠質(zhì)瘤的病因尚不完全清楚，可能與高外顯率基因遺傳突變、高劑量電離輻射、細(xì)菌或病毒感染等因素有關(guān)［1］。近年來(lái)，盡管以外科手術(shù)、放療、化療為主的綜合治療取得了一定進(jìn)步，但由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高度增殖和侵襲特征，很難達(dá)到根治效果，并且復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后仍然較差，尤其是WHO 分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者［8］。目前，腦膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，深入探索腦膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)尋找腫瘤特異性治療靶點(diǎn)至關(guān)重要［9］。

表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。lncRNA 作為新興的表觀遺傳調(diào)控因子，能夠通過直接或間接調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。lncRNA BCAR4定位于人染色體16p13.13，最初于乳腺癌抗雌激素耐藥基因篩查時(shí)被發(fā)現(xiàn)，后進(jìn)一步研究證實(shí)其與乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA BCAR4 還可在其他惡性腫瘤中發(fā)揮致癌作用，如lncRNA BCAR4 能夠靶向miR-181c-5p 上調(diào)LIM 和SH3 蛋白1，從而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［11］；lncRNA BCAR4還能靶向大腫瘤抑制激酶2促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移并抑制其凋亡［12］。但目前l(fā)ncRNA BCAR4 與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4 表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)變化與組織分化程度和WHO 分級(jí)有關(guān)。結(jié)果表明，lncRNA BCAR4 高表達(dá)能夠參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，lncRNA BCAR4 表達(dá)上調(diào)可激活膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2，而膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2是腦膠質(zhì)瘤的重要致癌基因，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［13］。

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞微環(huán)境的核心組分，可為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)和機(jī)械支持，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲等生物學(xué)過程。細(xì)胞外基質(zhì)的降解則會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致癌變，同時(shí)變薄的細(xì)胞基底膜還會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［14］。MMP-7 是MMPs家族中最小的成員，其激活后可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。MMP-7 還能切割多配體蛋白聚糖-1-白細(xì)胞介素8復(fù)合物介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。例如，MMP-7 能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［16］；MMP-7 還能通過蛋白激酶B/核因子κB 信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移［17］。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織MMP-7 mRNA 表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)變化與組織分化程度和WHO 分級(jí)有關(guān)。結(jié)果表明，MMP-7 高表達(dá)能夠參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，與既往研究［6］報(bào)道一致。究其原因，MMP-7 高表達(dá)能夠加速細(xì)胞外基質(zhì)破壞和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展［18］。

本研究Pearson 相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4 相對(duì)表達(dá)量與MMP-7 mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，提示lncRNA BCAR4 與MMP-7可能共同參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。最近WANG等［4］研究亦證實(shí)，lncRNA BCAR4能夠靶向miR-2276上調(diào)MMP-7 表達(dá)，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)論。本研究結(jié)果還顯示，lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 高表達(dá)者平均生存時(shí)間均低于其低表達(dá)者，并且lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 表達(dá)升高為腦膠質(zhì)瘤患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果提示，lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良密切相關(guān)，有可能成為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織lncRNA BCAR4、MMP-7 mRNA 表達(dá)顯著升高，二者表達(dá)變化與組織分化程度、WHO分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)。