氮素水平對秈粳雜交稻產量和貯藏蛋白的影響

孫建龍，張新城，任韻，王豐穎，陸鴻英，錢偉紅，馬善林*

(1.吳興尹家圩糧油植保農機專業合作社，浙江 湖州 313000；2.湖州市農業科學研究院，浙江 湖州 313000；3.湖州市農業種質資源創新與應用重點實驗室，浙江 湖州 313000；4.吳興區農業技術推廣服務中心，浙江 湖州 313000)

近年來，水稻育種目標從高產為主到高抗、優質和高產并重，育種理念也從高產優質逐步提升為“少投入、多產出、重環保”[1]。秈粳雜交稻具有營養生長旺盛、莖稈粗壯、穎花數多、庫容量大、增產潛力大等特點[2]。然而其產量潛力的充分實現通常依賴高氮投入，高氮不僅對粒型有影響，同時改變蛋白組分比例，給稻米品質改良帶來不利影響[3-4]。

施用氮肥是提高水稻產量最常用的栽培措施。研究表明，產量通常先隨施氮量增加而增加，隨后呈下降趨勢，最佳施氮量因品種而異[5-7]。水稻粒型包括粒長、粒寬和粒厚，決定著千粒重大小，并以此來影響水稻產量。水稻籽粒依據粒長，可分為特長粒(>9.1 mm)、長粒(8.1～9.0 mm)、中長粒(7.1～8.0 mm)和短粒(<7 mm)4 類；依據長寬比，可分為細長形(>3.1)、橢圓形(2.21～3.0)、卵圓形(1.8～2.2)和短圓形(<1.8)4 類[8]。粒長與粒寬的比值(長寬比)不僅是籽粒形狀的一種表現形式，而且會影響水稻品質[3，9]。

過量施氮或氮肥后移會顯著增加籽粒蛋白質，導致米飯變硬，降低稻米食味品質[6，10-11]。不同穗型秈粳雜交稻的直鏈淀粉含量差異不大，而蛋白質含量差異較大，是決定食味品質的關鍵因子[12]。優良食味水稻品種籽粒蛋白質含量通常較低，且隨著氮素水平的增加而上升，各蛋白組分含量與食味品質的相關性因水稻類型而異[13]。蔣晶晶等[14]也發現，超級稻弱勢粒中蛋白質含量高于強勢粒，硬度增大，口感較差，通過優化栽培模式可以提高弱勢粒食味品質，從而提升整穗品質。研究進一步發現，秈粳雜交稻弱勢粒中醇溶蛋白含量顯著高于強勢粒，而谷蛋白無顯著差異，兩種蛋白組分隨施氮量增加而增加，醇溶蛋白是稻米食味變差的主要原因[3]。

隨著蛋白質或蛋白組分含量在蒸煮食味品質研究中逐步得到重視，對強弱勢粒分別研究有助于為大穗型超級稻的遺傳改良和高效栽培提供理論依據。然而，以往研究多集中在靜態樣品(成熟期)，對強弱勢粒蛋白組分積累動態及其對氮素的響應關注并不多，蛋白質在胚乳中的分布也鮮見報道?；诖?，本研究以大穗型超級稻甬優12和甬優17為材料，比較了不同氮肥水平下產量、粒型、粒重動態、強弱勢粒的蛋白組分積累動態和蛋白質分布差異，研究結果可為秈粳雜交稻高產優質栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料種植

本試驗以秈粳雜交稻甬優12和甬優17為材料，均由寧波市種子有限公司育成。試驗于2018年在浙江大學長興試驗站進行，土壤為黏壤土，全氮含量1.05 g·kg-1，速效磷含量20.43 mg·kg-1，速效鉀含量102.5 mg·kg-1。5月20日播種，6月20日移栽，栽插密度為30.0 cm×16.5 cm，雙苗移栽。設置4個氮肥水平，即對照(N0，不施氮)、低氮(LN，100 kg·hm-2)、中氮(MN，200 kg·hm-2)、高氮(HN，300 kg·hm-2)，3個重復。常規管理按當地高產栽培方式管理。

1.2 樣品獲取

于抽穗旺盛期對開始抽穗且大小基本一致的穗子進行掛牌標記，記為花后0 d，并對標記的穗子于花后7、14、21、28、35、42 d進行動態取樣，共取6次。按Zhang等[3]的方法分為強弱勢粒樣品，烘干至恒重，測定粒重，隨后將樣品手工去殼后磨粉用于蛋白組分分析。成熟期收獲水稻籽粒，自然晾干，部分樣品用于測定稻谷長寬，去殼脫糙，少量糙米用于考馬斯亮藍染色觀察和蛋白質組分測定，部分精研后用于測定精米長寬。

1.3 產量分析

成熟期調查每穴穗數，每個小區調查 30 穴，取代表性材料3穴進行考種，得到穗數、每穗粒數、結實率和千粒重，并計算理論產量。

1.4 粒型測定

將10粒稻谷和精米首尾相連或背腹緊密相連，用尺子測量長度和寬度，并計算平均粒長、粒寬和長寬比。

1.5 蛋白組分測定

4種蛋白組分按照清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的順序依次提取，參考Zhang等[3]方法。

1.6 切片染色觀察

先將成熟糙米浸泡在2.5%戊二醛固定液中12 h，用剃須刀切開種子，樣品繼續固定48 h。樣品用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，然后用梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)連續脫水，再用梯度樹脂(25%、50%、75%、100%×2)滲透樣品，包埋在倫敦白膠樹脂中。60 ℃聚合48 h，用徠卡超薄切片機切成2 μm的半薄切片，將切片放置1%的考馬斯亮藍R250中染色20 min，隨后用7%的乙酸溶液清洗掉表面的染液，并用蒸餾水清洗干凈，低溫烤干，置于光學顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數據分析

試驗數據采用Excel 2019軟件進行整理與計算，并用 SPSS17.0軟件進行統計分析，采用Duncan法進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 氮素水平對產量及其構成因子的影響

施氮顯著提高兩品種的產量，品種對氮素的響應存在差異，甬優17對氮素響應較甬優12更敏感。甬優17產量隨施氮量的增加而增加，而甬優12在氮素處理間無顯著差異(P>0.05)，在低氮條件下就能獲得較高的產量(表1)。隨施氮量的增加，兩品種穗數均顯著提高(P<0.05)。與對照(N0)相比，甬優12和甬優17在高氮條件下分別增加45.54%和71.90%，但兩品種平均穗數基本相當。氮素水平對穗粒數和結實率均無顯著影響，但品種間存在顯著差異(P<0.05)。甬優12每穗粒數高達459.6，顯著高于甬優17的373.7，而甬優12的結實率(82.0%)則顯著低于甬優17(88.3%)。方差分析表明，穗數主要受氮素調控，穗粒數、結實率、千粒重主要由基因型決定，千粒重亦受氮素調控(表1)。

表1 氮素水平對產量及其構成因子的影響Table 1 Effects of different nitrogen treatments on yield and its components

2.2 氮素水平對粒形和籽粒灌漿的影響

甬優12稻谷粒長和長寬比分別為7.80～7.89和2.41～2.45，分別屬于中長粒和橢圓形；甬優17為8.40～8.52和2.66～2.70，分別屬于長粒和橢圓形。不論是精米還是稻谷，甬優12的粒長均顯著小于甬優17，而粒寬反之，從而導致較小的長寬比(表2)。低氮對粒長和粒寬沒有顯著影響，中高氮處理差異顯著(P<0.05)，但幅度較小，導致長寬比和粒重輕微下降，但氮素均未能引起粒型變化(表2)。就平均粒重而言，強勢粒顯著高于弱勢粒，甬優17略高于甬優12。在灌漿前17～18 d，粒重幾乎呈線性增長，28 d后幾乎不再增加(圖1中 a和b)。方差分析也表明，粒型主要由基因型決定，同時受氮素調控，但影響較小。

a圖表示甬優12，b圖表示甬優17。SG表示強勢粒；IG表示弱勢粒；YY表示甬優。圖2同。圖1 強、弱勢粒增重動態以及成熟期強、弱勢粒醇溶蛋白和谷蛋白含量Fig.1 Grain weight during grain filling stage，prolamin and glutelin content of superior and inferior grains at maturity

表2 氮素水平對精米和稻谷粒型的影響Table 2 Effects of different nitrogen treatments on grain types of milled rice and paddy

2.3 氮素對貯藏蛋白最終含量和籽粒積累動態的影響

強弱勢粒間，甬優12除醇溶蛋白含量在低氮條件和谷蛋白含量在高氮條件下差異顯著外(P<0.05)，其他處理均不顯著；甬優17醇溶蛋白含量在4個氮素處理中均差異顯著，而谷蛋白含量僅在中高氮條件差異顯著(圖1中 c和d)。氮素處理間，甬優12貯藏蛋白(醇溶蛋白和谷蛋白)含量僅在高氮條件顯著升高，而甬優17在低氮條件就顯著提高(P<0.05)，表明甬優17更易受氮素影響，尤其是弱勢粒。值得注意的是，甬優12強勢粒醇溶蛋白含量高于甬優17，而弱勢粒反之，谷蛋白含量甬優17高于甬優12。

甬優12醇溶蛋白積累量呈現先上升后下降再上升的波浪趨勢，而甬優17在花后28 d或35 d達到峰值后呈下降趨勢(圖2中a和b)。與甬優12不同的是，甬優17弱勢粒中醇溶蛋白積累量在施氮條件下明顯上升，縮小了與強勢粒的差距(圖3)，主要與其含量顯著提高有關(圖1中 c)。有趣的是，兩品種間谷蛋白積累的模式恰好與醇溶蛋白積累模式相反，盡管達到峰值的時間略有差異(圖2)。

a和c圖表示甬優12；b和d圖表示甬優17。圖2 強弱勢粒醇溶蛋白和谷蛋白積累動態Fig.2 Prolamin and glutelin contents of superior and inferior grains

a～d和i～l表示胚乳中心，e～h和m～p表示胚乳外層。圖3 強弱勢粒不同部位的蛋白質分布Fig.3 The protein distribution in different parts of superior and inferior grains

2.4 氮素對強弱勢粒中蛋白質積累部位的影響

經考馬斯亮藍染色后，可以清晰看到甬優12內胚乳中蛋白質積累在強弱勢粒間差異不明顯(圖3中a～d)，而在胚乳外層弱勢粒明顯高于強勢粒，且施氮促進蛋白質積累(圖3中e～h)。甬優17在不施氮條件下，強弱勢粒間內胚乳中蛋白質積累差異不明顯(圖3中i～j)，而弱勢粒胚乳外層略有增加(圖3中m～n)。在高氮條件下，內胚乳中和胚乳外層蛋白質積累均明顯增加，且胚乳外層尤為突出。以上結果表明，貯藏蛋白主要富集在籽粒胚乳外層，弱勢粒蛋白質濃度高于強勢粒，甬優17對氮素響應較甬優12更敏感，印證了以上結果(圖1中c～d)。

3 討論

3.1 產量與粒型對氮素的響應

施用氮肥是提高產量最主要的栽培措施。眾多研究表明，產量先隨施氮量增加而增加，隨后呈下降趨勢，最佳施氮量因品種而異[5-7]。本研究中，施氮顯著提高了產量，主要由穗數的大幅提升引起(表1)，與前人結果一致[15-16]。產量在高氮條件(300 kg·hm-2)下未曾下降，可能與秈粳雜交稻營養生長旺盛、穎花數多、庫容量大、耗氮量大等特點有關[2]。粒重主要由粒型(包括粒長、粒寬和粒厚)決定，且與灌漿程度有關，遺傳力為 40%～60%，遺傳穩定，受外界環境因素影響較小[8]。本研究中，稻谷的粒長、粒寬和長寬比在中高氮條件下雖略有下降，但幅度不大，仍未能引起粒型變化，從而導致粒重變化也不大(表1和表2)，證明了粒型和粒重的高遺傳力[8，17]。然而，強弱勢粒間粒重差異顯著，這主要是由于灌漿程度不同引起(圖1中a～b)。千粒重不僅取決于籽粒庫容量(粒型)也取決于其充實度(灌漿)。通常，弱勢粒灌漿起步遲，灌漿不充分，大穗型超級稻中尤為突出[18]。因此，整穗粒長或粒寬在高氮條件下有所下降，可能與弱勢粒比例大幅增加有關[3]。

3.2 蛋白組分積累動態與分布特征

眾所周知，施氮顯著增加蛋白質含量[6，10-12，19]。多數研究表明，弱勢粒中蛋白質含量顯著高于強勢粒[3，20-21]，但Ma等[22]研究結果與之相反，這可能與研究材料不同有關。本研究結果與前人基本一致[20-21]，另外還對蛋白積累動態進行檢測發現，醇溶蛋白與谷蛋白積累模式呈互補狀態(圖2)，稻米中蛋白質的合成處于動態平衡狀態，當某一貯藏蛋白被抑制，其他貯藏蛋白則會相應增加[23]。水稻強弱勢粒間貯藏蛋白(醇溶蛋白和谷蛋白)濃度在品種間存在差異，甬優12差異較小，而甬優17弱勢粒顯著高于強勢粒，且甬優17對氮素更敏感。另外，不論強弱勢粒還是施氮與否，甬優12蛋白質積累在內胚乳中均沒有明顯差異，而甬優17在高氮下，內胚乳中蛋白質積累顯著增加，弱勢粒中尤為明顯，這也正好解釋了甬優17稻米食味品質在高氮下急劇下降的原因[3]。再則，貯藏蛋白主要富集在胚乳外層，表明碾磨程度大，將會去除大量蛋白質，有利于食味品質的提升，但會犧牲部分精米產量。

4 結論

施氮均能顯著提高產量和蛋白質積累量，但品種對氮素響應存在差異。甬優12在低氮下就能獲得較高產量，有望實現高產優質的平衡。高氮能影響粒長或粒寬，但無法改變粒型。醇溶蛋白和谷蛋白積累存在互補效應，有利于維持貯藏蛋白的相對平衡。弱勢粒蛋白質濃度盡管高于強勢粒，但因其粒重小導致總積累量仍然低于強勢粒。貯藏蛋白主要富集在籽粒胚乳外層，甬優17對氮素響應較甬優12更敏感。