轉(zhuǎn)基因水稻感染SRBSDV后對植株營養(yǎng)物質(zhì)的影響

何曉嬋，周小軍，朱麗燕，朱浩，呂仲賢，徐紅星*

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

南方水稻黑條矮縮病(southern rice black-streaked dwarf disease)是2001年在我國廣東首次發(fā)現(xiàn)的一種新的水稻病毒病，主要由白背飛虱(Sogatellafurcifera(Horvth))傳播[1-2]。2009—2011年，該病毒病在我國水稻產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生，造成水稻減產(chǎn)，甚至絕收[3]。受臺風和降雨等影響，該病毒病的介體昆蟲白背飛虱會隨著降雨和暖濕氣流遷飛、定居及蔓延，造成南方黑條矮縮病的流行。明確病毒是否對寄主植物的營養(yǎng)物質(zhì)等產(chǎn)生影響，是直觀解釋介體昆蟲寄主選擇偏好的基礎(chǔ)，有助于進一步理解病毒的傳播機制，從而為培育抗蟲作物品種或制定綜合防治策略提供理論基礎(chǔ)。

已有研究表明，病毒的侵染會改變寄主植株的形態(tài)。如受玉米粗縮病毒(MRDV)侵染的玉米葉肉細胞中葉綠體的數(shù)量減少，細胞器發(fā)生病變以及液泡膜也明顯內(nèi)陷[4]。水稻感染SRBSDV后植株明顯矮縮，分蘗增加，葉片深綠褶皺，后期莖稈上出現(xiàn)瘤狀突起[5]。植物病毒能夠引起植物營養(yǎng)狀況(氨基酸、可溶性糖含量等)的改變，從而影響媒介昆蟲的寄主適應(yīng)性。研究證明，木薯花葉病毒(cassava mosaic virus，CMV)侵染能夠顯著提高木薯植株韌皮部汁液中氨基酸的含量，有利于媒介昆蟲煙粉虱的種群增長[6]；Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，感染SRBSDV的水稻植株體內(nèi)的總氨基酸含量較健康植株提高了31.13%，可溶性糖含量幾乎是健康植株的3倍。而西葫蘆感染黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)后，韌皮部和葉片的糖分、氨基酸比例均顯著下降，從而降低蚜蟲的種群適應(yīng)性[8-9]；張澤龍等[10]研究表明，黃瓜被瓜類褪綠黃化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)侵染后葉片中防御物質(zhì)總酚、單寧的含量降低，同時可溶性糖和游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量也顯著降低。

目前已開展了不少關(guān)于病毒感染對寄主植株的影響研究，但關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻感染病毒的影響研究鮮有報道。因此，本研究以白背飛虱傳播的SRBSDV及轉(zhuǎn)基因水稻(MH63、T1C-19、T2A-1)為研究對象，考察病毒對不同品種轉(zhuǎn)基因水稻株高、可溶性糖、碳氮含量、氨基酸含量等物質(zhì)的影響，從而為病毒對同一生境的昆蟲產(chǎn)生定位寄主趨向和取食趨向的原因提供例證，同時為闡明農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的植物病毒傳播發(fā)生機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種：Bt水稻品系T1C-19(含cry1C基因)、T2A-1(含cry2A基因)和常規(guī)對照水稻品種明恢63(MH63)均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2.1 SRBSDV病株的獲得

將無毒白背飛虱低齡若蟲置于墊有濕濾紙的燒杯中，饑餓2 h后轉(zhuǎn)移至SRBSDV病株上進行飼毒2～3 d，后轉(zhuǎn)移至健康水稻苗上飼養(yǎng)以度過循回期，最后把攜帶SRBSDV的白背飛虱分別接到2葉1心期的T1C-19(含cry1C基因)、T2A-1(含cry2A基因)和常規(guī)對照水稻品種明恢63(MH63)上，進行接毒，檢測后供試驗用。

1.2.2 水稻株高

分別選T1C-19、T2A-1、MH63的正常水稻植株和感SRBSDV病株，每處理隨機取15株，從根部起依次測量水稻植株地上部分的自然高度。

1.2.3 可溶性糖含量測定

經(jīng)溫度處理后的水稻葉片烘干，用粉碎機粉碎均勻后待測。稱取烘干磨碎的樣品0.05 g，置于離心管中，加入1 mL 80%乙醇，85 ℃下保溫水浴30 min，然后3 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入大試管中，將殘渣反復(fù)提取2次，所有上清并入試管，加活性炭吸附色素，之后過濾定容待測。采用蒽酮比色法，取稀釋后糖提取液20 μL，加入700 μL蒽酮試劑，立即搖勻，沸水浴中準確加熱10 min，迅速冷卻至室溫，然后放置于暗處10 min后，取200 μL于酶標板中測D630值。

1.2.4 碳氮含量測定

經(jīng)溫度處理后的水稻葉片烘干，用粉碎機粉碎均勻后，用EURO元素分析儀測定碳氮含量。

1.2.5 稻株氨基酸含量測定

分別取SRBSDV病株和健康稻株的葉鞘，于110 ℃殺青1 h后，60 ℃烘干至恒重。稱取1 g磨成粉末，加0.1%的HCl定容至25 mL，充分溶解后過濾。取2 mL上清液加4 mL 0.1% TFA溶液快速搖勻，用SEP-PAK 柱純化后在Sykam S433D氨基酸分析儀上測定氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用t檢驗進行差異顯著性檢驗，描述性統(tǒng)計值用平均值±標準誤表示，顯著水平設(shè)置為ɑ=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻株高的影響

由表1可知，MH63、T1C-19、T2A-1水稻植株感染SRBSDV 后株高分別為107.33、98.83、109.83 cm，均顯著低于正常水稻植株。

表1 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻株高的影響Table 1 Effect of SRBSDV-infected plants on plant height of transgenic rice

2.2 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株可溶性糖含量的影響

正常水稻植株可溶性糖含量分別為2.10%、2.12%、1.89%，而轉(zhuǎn)基因水稻MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后可溶性糖含量分別為1.90%、2.09%、2.19%(表2)，與正常水稻可溶性糖含量均無顯著性差異。

表2 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株可溶性糖含量的影響Table 2 Effect of SRBSDV-infected plants on soluble sugar contents of transgenic rice

2.3 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株碳氮含量的影響

由表3可知，不同水稻品種感染SRBSDV后對水稻碳氮含量的影響是不同的。正常MH63水稻感染SRBSDV后氮含量顯著提高，碳含量無顯著性差異；T2A-1水稻感染SRBSDV后氮含量降低，碳含量顯著提高；TIC-19水稻感染SRBSDV后氮含量顯著提高，碳含量略有提高。

表3 SRBSDV對水稻植株碳氮含量的影響Table 3 Effects of SRBSDV-infected plants on carbon and nitrogen content of transgenic rice

2.4 SRBSDV對轉(zhuǎn)基因水稻植株氨基酸含量的影響

不同水稻品種感染SRBSDV后植株體內(nèi)氨基酸含量變化見表4～6。轉(zhuǎn)基因水稻MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株體內(nèi)各種氨基酸及總氨基酸含量均提高。

表4 MH63感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 4 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of MH63

MH63感染SRBSDV后其體內(nèi)天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸含量分別增加了0.46百分點、0.15百分點、0.17百分點、0.40百分點、0.13百分點、0.12百分點、0.15百分點、0.06百分點、0.16百分點、0.15百分點、0.18百分點、0.17百分點，總氨基酸含量提高了2.80百分點，均高于正常水稻植株的各種氨基酸含量及總氨基酸含量(表4)。

T1C-19感染SRBSDV后除蛋氨酸含量略微下降，其他15種氨基酸含量均有提高，且除脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸與正常水稻植株含量無顯著差異，其他12種氨基酸含量均顯著高于正常水稻植株(P<0.05)，總氨基酸含量較正常植株提高了0.84百分點，也顯著高于正常水稻植株氨基酸含量(P<0.05)(表5)。

表5 T1C-19感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 5 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of T1C-19

T2A-1感染SRBSDV后天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、總氨基酸含量均顯著高于正常水稻植株氨基酸含量(P<0.05)，其他氨基酸含量與正常水稻植株氨基酸含量均無顯著性差異(表6)。

表6 T2A-1感染SRBSDV后植株內(nèi)氨基酸含量的變化Table 6 Changes in amino acid contents in SRBSDV-infected rice plants of T2A-1

3 討論

寄主與病毒的侵染是一個相互競爭的過程，植物利用細胞壁的物理屏障、RNA干擾等多種方式抵御病毒的侵入，相反，病毒則借助機械損傷或媒介昆蟲完成侵染，且經(jīng)過病毒原質(zhì)體、裝配病毒粒子和編碼沉默抑制子的形成來確保病毒 RNA不被寄主降解。因此，病毒的生命活動過程，通常與宿主蛋白相互作用，從而直接或間接導(dǎo)致易感寄主產(chǎn)生癥狀[11]。如貝殼杉烯氧化酶與RDV互作，抑制 GA 的合成，導(dǎo)致水稻產(chǎn)生矮縮癥狀[12]，生長素調(diào)節(jié)因子(PAP1)與TMV RdRp 互作干擾生長素的合成，使植株產(chǎn)生矮化的癥狀[13]。本研究結(jié)果與前人研究一致，試驗結(jié)果表明，MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株高度顯著下降，呈明顯矮縮狀。另外，病毒還使植株呈花葉、皺縮等癥狀，影響作物光合作用，嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[14]。

游離氨基酸、可溶性糖是植物體內(nèi)基礎(chǔ)的營養(yǎng)物質(zhì)，進而影響媒介昆蟲的生長發(fā)育和生殖能力等生物學(xué)特性[15]。已有研究表明，當植物遭受病原物的侵染時，會誘導(dǎo)體內(nèi)可溶性糖、氨基酸以及碳水化合物含量的變化，其中氨基酸含量的變化會直接影響到植食性昆蟲的取食[16-18]。本研究結(jié)果表明，MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV 后可溶性糖含量與正常水稻無顯著性差異。與丁天波等[19]的研究結(jié)果一致，該研究表明番茄感染ToCV后總糖含量與正常植株無顯著性差異。而閆慧娟等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，感病品種的三葉期玉米植株接種矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus，MDMV)后，葉片可溶性糖含量下降。陳茜等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CMV侵染的煙草葉片中總糖含量較健康煙草略有降低。筆者早期研究發(fā)現(xiàn)，水稻嘉優(yōu)8號在感染RBSDV后植株體內(nèi)的可溶性糖含量則是正常稻株的3倍[22]，與本試驗的結(jié)論均不一致。所以筆者推測可能是由于水稻品種、病毒種類不同等原因造成的。

病毒侵染寄主后也會對寄主植物的碳氮代謝產(chǎn)生影響，進而導(dǎo)致媒介昆蟲生物學(xué)特性的改變。如大豆花葉病毒(SMV)侵染大豆后，病毒明顯地抑制寄主碳水化合物代謝，促進寄主氮化物的代謝，從而有利于病毒的復(fù)制和增殖[23]。本試驗的研究結(jié)果表明，不同品種的轉(zhuǎn)基因水稻感染SRBSDV后碳氮含量影響不一致，MH63、T1C-19感染SRBSDV后水稻植株的氮含量顯著提高，T2A-1水稻感染SRBSDV后碳含量則顯著提高(P<0.05)。

丁天波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，感染ToMV的番茄植株與正常植株總氨基酸及游離氨基酸含量均未達到顯著性差異。而陳茜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CMV侵染的葉片中游離氨基酸的含量顯著升高[21]，PVY 的侵染導(dǎo)致煙草體內(nèi)氨基酸含量增加。本研究發(fā)現(xiàn) MH63、T1C-19、T2A-1感染SRBSDV后植株體內(nèi)各種氨基酸及總氨基酸含量均提高。這與楊熙彬等[25]、何嘵嬋等[22]的研究一致。因此，可以推斷病毒侵染誘導(dǎo)植株營養(yǎng)物質(zhì)的變化趨勢是多樣的，不同傳播方式的病毒，其介體獲毒所需的時間、持毒和傳毒時間均不相同，因此，病毒通過改變寄主植物的營養(yǎng)物質(zhì)、次生物質(zhì)等來調(diào)整介體昆蟲的“去留”以最大限度地把病毒傳播下去。