PEG-6000模擬干旱脅迫對冬黑麥生理指標的影響

烏日力嘎，鄧宇*，孫墨可

(1.長春大學 園林學院，吉林 長春 130022；2.白城市農業科學院，吉林 白城 137099)

黑麥(SecalecerealeL.)是禾本科黑麥屬栽培作物，有春黑麥和冬黑麥之分，冬黑麥可以在東北地區種植且越冬生長[1]，抗逆性較強，廣泛種植冬黑麥可以提高冬季地表覆蓋，對提高糧食單產和保證糧食安全均有一定的積極作用[2]。冬黑麥富含膳食纖維、蛋白質、維生素、不飽和脂肪酸等生理活性成分，具有很高的營養價值和經濟價值，在人類生活中具有重要意義[3]。干旱是嚴重影響植物生長發育的非生物脅迫之一，并且影響廣泛而深遠。中國作為農業大國，在世界上屬于水資源短缺的國家之一，再受全球氣候變暖的影響，旱災更是頻繁發生，水資源短缺的矛盾也日益突出，對農業生產帶來嚴重危害，甚至會直接危害到糧食安全問題[4]。干旱脅迫下，植物會產生活性氧，導致細胞膜系統的代謝紊亂，損壞細胞功能，使細胞保水能力下降，導致植物無法正常生長發育甚至死亡。通過測定冬黑麥葉片各項生理指標可以反映出其在干旱脅迫條件下的生長規律等。目前，科研人員對冬黑麥研究多以抗寒為主，采用PEG-6000模擬干旱脅迫及分子生物學水平研究較少，因此，本試驗以俄羅斯冬黑麥BK01為研究對象，采用15% PEG-6000對水培冬黑麥模擬干旱脅迫，測定各脅迫時期冬黑麥葉片多項生理指標，明確干旱脅迫下冬黑麥的生理特性，為進一步干旱脅迫下冬黑麥轉錄組測序研究及探究其抗旱分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

俄羅斯冬黑麥BK01由吉林省白城市農業科學院保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 冬黑麥脅迫處理

選擇健康、顆粒飽滿的冬黑麥種子，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡消毒15 min，將消毒后的種子平鋪于培養皿中濕潤的濾紙上，置于25 ℃培養箱中暗培養2 d至種子發芽。將發芽的冬黑麥種子轉入含1 L霍格蘭德營養液的培養盤中并移至光照培養室繼續培養(25 ℃，光照16 h，黑暗8 h)，營養液每天更換1次。將冬黑麥水培至三葉一心后，利用15% PEG-6000模擬干旱脅迫，處理時間為0(CK)、3、6、9、12和24 h，每組處理重復3次，收集冬黑麥葉片，用于生理指標測定。

1.2.2 冬黑麥生理指標的測定

分別采用烘干稱重法測定相對含水率(RWC)，采用TBA法測定丙二醛(MDA)含量[5]，采用蒽酮法測定可溶性糖(SS)含量[6]，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白(SP)含量[6]，采用比色法測定脯氨酸(Pro)含量[7]，采用可見光法測定過氧化氫酶(CAT)活性[8]，采用比色法測定過氧化物酶(POD)活性[9]，采用羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[10]。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對冬黑麥葉片相對含水率的影響

相對含水率通常能夠直觀地表現出植物的有效含水量。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下隨著時間的延長冬黑麥葉片的相對含水率呈現下降趨勢。與0 h相比，冬黑麥葉片在干旱脅迫3、6、9、12、24 h的RWC極顯著降低，在脅迫24 h時RWC達最低，為59.028%(圖1)。因此，干旱脅迫導致冬黑麥葉片失水，相對含水率下降，對植物造成損害。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 干旱脅迫對冬黑麥葉片相對含水率的影響Fig.1 Effects of drought stress on RWC content of winter rye leaves

2.2 干旱脅迫對冬黑麥葉片丙二醛含量的影響

丙二醛含量能夠反映出膜脂過氧化的程度，也能間接反映抗旱能力的強弱。在15%PEG-6000模擬干旱脅迫下隨著時間的延長冬黑麥葉片的丙二醛含量呈現上升趨勢。在干旱脅迫時間達24 h時，冬黑麥葉片丙二醛含量最高，為7.741 μmol·g-1，且9、12、24 h的丙二醛含量與0 h相比極顯著升高，6 h的丙二醛含量與0 h相比顯著升高(圖2)。隨著干旱脅迫時間延長，冬黑麥葉片丙二醛含量的累積，使膜脂過氧化，導致細胞膜流動性降低，透性增強。

“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。圖3～8同。圖2 干旱脅迫對冬黑麥葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on MDA content of winter rye leaves

2.3 干旱脅迫對冬黑麥葉片可溶性糖含量的影響

在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片可溶性糖含量變化呈先上升后下降趨勢，當脅迫時間達9 h時，冬黑麥葉片可溶性糖含量最高，為8.536 μg·g-1。冬黑麥葉片在干旱脅迫3、12 h的可溶性糖含量與0 h相比顯著升高，脅迫6和9 h葉片的可溶性糖含量與0 h相比極顯著升高(圖3)。干旱導致冬黑麥葉片細胞失水，可溶性糖含量升高能夠降低細胞失水性，維持新陳代謝正常進行。

圖3 干旱脅迫對冬黑麥葉片可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of drought stress on soluble sugar content in winter rye leaves

2.4 干旱脅迫對冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白與可溶性糖是植物重要的滲透調節物質，在干旱脅迫中起到提高植物保水能力的作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下，冬黑麥葉片可溶性蛋白含量變化，呈先上升后下降的趨勢。冬黑麥葉片在干旱脅迫處理3、6 h的可溶性蛋白含量與0 h相比顯著上升，9、12、24 h的可溶性蛋白含量與0 h相比極顯著上升。當脅迫時間達9 h時冬黑麥葉片可溶性蛋白含量達最高，為17.702 mg·g-1(圖4)。冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的增加能夠提高細胞保水能力，增強抗旱性。

圖4 干旱脅迫對冬黑麥葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of drought stress on soluble protein content in winter rye leaves

2.5 干旱脅迫對冬黑麥葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物重要的滲透調節物質，在干旱脅迫中會主動積累。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片脯氨酸含量呈上升趨勢，在24 h達到最高，為66.985 μg·g-1。冬黑麥葉片在干旱脅迫處理6、9 h的脯氨酸含量顯著高于0 h，12、24 h的脯氨酸含量與0 h相比極顯著上升(圖5)。隨著干旱脅迫時間延長，冬黑麥葉片脯氨酸含量逐漸升高，能夠減緩葉片組織失水。

圖5 干旱脅迫對冬黑麥葉片脯氨酸含量的影響Fig.5 Effects of drought stress on proline content in winter rye leaves

2.6 干旱脅迫對冬黑麥葉片酶活性的影響

在干旱脅迫條件下植物體內產生大量活性氧，保護性酶可以有效地清除積累的自由基，起到保護細胞的作用。在干旱條件下CAT和POD活性的作用是分解代謝中產生的H2O2，以避免H2O2積累對細胞的氧化破壞作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片CAT活性隨著干旱脅迫時間的延長，呈先上升后下降趨勢，9、12、24 h的CAT活性與0 h相比極顯著上升，且干旱脅迫處理9 h時冬黑麥葉片CAT活性達到最高，為9.109 U·mg-1，6 h的CAT活性與0 h相比顯著上升(圖6)。

圖6 干旱脅迫對冬黑麥葉片過氧化氫酶活性的影響Fig.6 Effect of drought stress on CAT activity in winter rye leaves

在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下，冬黑麥葉片POD活性變化，隨著干旱脅迫時間的延長，冬黑麥葉片POD活性呈先上升后下降趨勢。當脅迫12 h時，冬黑麥葉片POD活性達到最大值，9、12、24 h時的POD活性與0 h相比顯著上升(圖7)。

圖7 干旱脅迫對冬黑麥葉片過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effect of drought stress on POD activity in winter rye leaves

在逆境脅迫條件下，SOD可以有效地清除植物的自由基，減少活性氧的含量，起到保護細胞的作用。在15% PEG-6000模擬干旱脅迫下冬黑麥葉片SOD活性變化，隨著干旱脅迫時間的延長，冬黑麥葉片SOD活性呈先上升后下降趨勢，脅迫處理9、12、24 h的SOD活性與0 h相比極顯著升高，在9 h時冬黑麥葉片SOD活性達到最高。冬黑麥葉片脅迫6 h的SOD活性與0 h相比顯著上升(圖8)。干旱脅迫導致冬黑麥葉片細胞內活性氧積累，SOD能夠減少活性氧積累。

圖8 干旱脅迫對冬黑麥葉片超氧化物歧化酶活性的影響Fig.8 Effect of drought stress on SOD activity in winter rye leaves

3 討論

干旱脅迫下相對含水率能夠表明植物的水分狀況的生理意義，能夠表現出植物的有效水分含量。劉碩等[11]以甘蔗為實驗材料探索抗旱品種選育，發現干旱1 d時葉片相對含水率變化不明顯，但隨著干旱加劇，葉片相對含水率顯著降低，干旱9 d時云蔗05-51和粵糖93-159的葉片相對含水率僅為11.64%和8.89%，復水10 d后雖有所回升，但仍顯著低于對照。一些研究[12]發現在干旱脅迫期間，細胞的膨脹壓力降低，這減少了芽長、生物量和植物生長。干旱會導致葉片枯萎，植物生長減少，花蕾形成減少，葉和葉面積減少，Rollins等[13-14]研究發現，干旱脅迫是植物鮮重和干重、葉片數、總葉面積、相對含水量、氣孔大小和頻率降低的原因。本研究中冬黑麥相對含水率呈逐漸下降趨勢，在干旱脅迫0 h時達最高，24 h時最低，與上述結果相似。

干旱脅迫時，膜脂過氧化導致MDA積累，使蛋白質和核酸變性，導致膜脂流動性降低，透性增強。MDA含量的高低在一定程度上能反映膜脂過氧化作用水平和膜結構的受害程度，MDA含量越高品種抗旱能力越弱[7]。王曉雪等[7]研究表明，燕麥生長早期根系抗氧化酶活性和脯氨酸含量隨干旱脅迫程度增加而增加。張翠梅等[15]研究干旱脅迫對不同抗旱苜蓿品種根系生長特征及生理特性的影響發現，干旱脅迫顯著增加了供試苜蓿根系的MDA含量和質膜相對透性，說明供試苜蓿的膜脂過氧化水平均隨干旱脅迫程度增加而顯著增加。本實驗結果與上述結果相似，隨著干旱脅迫時間的延長，在24 h時葉片MDA含量達到最高值，在干旱脅迫下葉片受到傷害，反映了干旱脅迫下冬黑麥葉片逆境損傷，產生了大量的MDA。

可溶性糖是植物體內重要的滲透調節物質和代謝產物，在干旱脅迫中，可溶性糖類是參與滲透調節的重要物質[16]。可溶性糖含量與植物葉片生理代謝調節能力和光合作用有關，葉片中可溶性糖含量隨著干旱脅迫時間的延長而增加，抗旱品種的可溶性糖含量高。蘇瑋娟等[17]研究表明，隨脅迫時間的延長，可溶性糖含量總體呈上升趨勢，在脅迫72 h時達到峰值，青引1號和定燕2號的可溶性糖含量較高，甜燕麥的可溶性糖含量最低。隨著脅迫時間的進一步延長，脅迫96 h時可溶性糖含量稍微降低。本研究中，冬黑麥可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢，9 h時可溶性糖含量達最高，通過升高細胞液的滲透勢吸收水分，隨著脅迫時間的延長，可溶性糖含量開始下降，自我調節能力下降。可溶性糖含量升高說明干旱脅迫下，冬黑麥通過可溶性糖含量的增加，降低細胞失水性，使自身新陳代謝能夠正常進行。

可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質。在干旱脅迫中，可溶性蛋白的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。在干旱脅迫下可以通過植物中可溶性蛋白含量這一指標來反映植物的抗旱性。很多研究證明，可溶性蛋白含量的變化與干旱強度有直接關系，隨著干旱脅迫強度的增加可溶性蛋白的含量表現為先增強后減弱；干旱脅迫對蛋白含量的影響各異，抗旱性強的品種能誘導基因更強的表達以適應干旱脅迫，而抗旱性較弱的品種可能減弱或喪失其自我調節能力[6]。本實驗冬黑麥葉片可溶性蛋白含量9 h最高，自我調節能力最強，隨著脅迫時間調節能力下降，表明冬黑麥葉片細胞通過增加可溶性蛋白含量使細胞保水能力提高，使得適應性增強，這與上述結果相似。

脯氨酸是植物細胞內重要的滲透調節物質，在逆境條件下脯氨酸會主動積累，受干旱脅迫的植物在植物的葉子、芽和根尖等區域表現出較高的脯氨酸濃度。植物中脯氨酸的積累可引起細胞滲透勢下降，提高細胞的吸水能力或使水分外滲，有助于細胞和組織的持水，使植物能夠吸收水分進行生長和代謝[18]。Nasrin等[19]研究發現，水稻品種BRRI Dhan-24在干旱脅迫下脯氨酸積累量增加。許多抗旱研究將脯氨酸含量的積累量作為植物抗旱指標之一，本實驗中冬黑麥的脯氨酸含量隨著脅迫時間的延長呈上升的趨勢，24 h時達最高，與上述研究相似。脯氨酸含量升高說明了干旱脅迫下冬黑麥細胞通過增加脯氨酸的含量，使細胞滲透勢降低，阻止水分喪失，使自身新陳代謝能夠正常進行，響應了干旱脅迫。

逆境條件下植物細胞會產生過氧化物，導致細胞膜系統代謝紊亂，損壞細胞功能。此時植物會產生CAT、POD、SOD、APX等保護酶，減少活性氧的含量，起到保護細胞的作用。蘇瑋娟等[17]研究表明，除甜燕麥的SOD活性隨脅迫時間的延長一直上升外，其余材料的CAT、POD及SOD活性均隨脅迫時間的延長呈先升后降趨勢。本實驗中冬黑麥葉片的3個酶活性隨脅迫的加劇均呈先上升后下降趨勢。其中，CAT與SOD活性在9 h時達到最高，POD活性在12 h時達到最高，與上述研究結果相似。結合本實驗，在干旱脅迫初期葉片內的過氧化物被CAT、POD和SOD活性分解或清除，緩解氧化的速度，隨著脅迫時間的延長冬黑麥葉片活性氧清除功能逐漸降低。