動物性別控制技術研究進展

陳虹宇,魏雅婷,李若璽,高留濤*,劉深賀*

(1.河南農業大學動物科技學院,鄭州 450046;2.河南省鼎元種牛育種有限公司,鄭州 450000)

性別控制技術通常與人工授精、體外受精以及胚胎移植等技術相結合來獲得期望的后代性別,是畜牧業中一個具有重要生產實踐意義的研究課題。在哺乳動物中,雄性產生兩種類型精子,一類攜帶X染色體(X精子),一類攜帶Y染色體(Y精子),而雌性產生的卵子只攜帶X染色體。在受精過程中,X精子與卵子結合產生雌性(XX),Y精子與卵子結合產生雄性(XY),即后代的性別是由雄性產生的精子類型決定。根據X精子和Y精子在物理和化學方面的差異,可以實現二者的分離,從而選擇特定類型的精子進行育種工作,實現后代性別控制。本文綜述了用于分離動物精液中X精子和Y精子方法的研究進展,旨在為今后動物性控技術的應用提供理論參考。

1 流式細胞分離法

目前,流式細胞分離法是唯一商業化的性別控制技術[1],能夠分離攜帶X染色體和Y染色體的精子。哺乳動物X精子的DNA含量比Y精子的DNA含量高[2-3],如人的X精子與Y精子的DNA含量差異大約為2.8%[4],而家畜的X精子與Y精子的DNA含量差異更加顯著,平均值高達4%(表1)。基于兩種精子DNA含量的差異,X精子經DNA熒光染料(Hoechast33342)染色后發出更強的藍色熒光,將熒光信號轉化為電脈沖,X精子施加正電荷,Y精子施加負電荷,在電場力作用下,最終分別被收集到相應的容器中,實現分離[5-6]。

表1 不同物種X精子和Y精子DNA含量差異[7]Table 1 The difference of DNA content of X sperm and Y sperm in different species[7] %

對牛精液應用流式細胞儀進行分選,發現在輸入4萬個牛精子的情況下,每秒可分離8 000個精子,每小時大約可分離2 800萬個精子,而每根性控凍精細管中約200萬個精子,即每天僅能生產大約300根細管[8-9],可見該方法分離速度慢,產量低,且性控凍精細管所含的精子數目大約僅為常規凍精細管中精子數目的1/10[10],而且流式細胞術分選設備價格昂貴,需要專業人員操作,難以廣泛應用[11-12]。該方法在分離精子的過程中,精子暴露于各種應激源[8],如熒光染料染色、激光照射、高稀釋、高壓以及培養基成分的變化等,會對精子造成一定程度的損害。Garner 等[2]使用流式細胞儀對分離過程中各步驟的精子存活率進行評估,發現最具有破壞性的因素是分離過程中的機械壓力。自從使用流式細胞術獲得第一根商業性控凍精細管以后,該技術已經進行了多項改進,例如在新一代更快、更高效的精子分選器Genesis中引入了定向噴嘴、數字處理、多頭分選器和自動化[13];在精子處理、分離準備和培養基組成等方面得到的顯著改進,使得性控精液的精子質量和受孕率與常規精液的差距有所減小[6,14];又如,將激光照射路徑的形狀從圓形光束改變為細橢圓形,帶狀光束使用特殊透鏡,最大限度地減少精子暴露在紫外光線照射下的時間[12]。經過不斷的改進和優化后,通過流式細胞術實現牛性別控制的準確率接近85%～95%[2],該方法在養牛生產中已經實現商業化發展[12]。

綿羊和山羊的X精子與Y精子的DNA含量差異分別約為4.1%和4.4%,比牛X精子和Y精子的DNA含量差異(3.8%)更大,理論上使用流式細胞術應有較好的分離效果,但實際上該方法會導致奶山羊精子的生存能力和受精能力下降[11],可見分離效果有一定的物種特異性[15],以后應進一步研究關于羊X精子和Y精子的分離參數。Garner 等[12]探究了優化流式細胞術進行性別控制所需的參數,分選指數用X精子和Y精子的DNA含量差異(%)乘以精子頭部平坦輪廓的面積(μm2)來計算,分選指數表明公牛和野豬的精子非常適合使用流式細胞術進行分離,分別為131和115。然而在養豬生產中,很少用流式細胞術對精子進行分離,可能是因為豬的精子在分選過程中精子細胞膜會遭到破壞,導致其活力、受精能力等參數下降,因而難以應用于生產實踐[16]。

在兼顧流式細胞術準確率的同時,今后的研究應著眼于優化分離過程,機器更新迭代,以提高分離效率[17],減少分離過程對精子的損害;充分利用X精子與Y精子DNA含量的差異性,研究確定不同動物的流式細胞儀分離參數[18],突破物種局限性,擴大應用范圍。

2 免疫學分離法

流式細胞儀既可以應用于分離X精子和Y精子,又可分析X精子和Y精子之間的差異特性,比如兩種精子在蛋白質組學水平上存在的差異[19]。攜帶X染色體和Y染色體的精子表達的基因是由各自性染色體編碼的,盡管大多數基因表達產物通過細胞間橋在兩種精子之間共享[20],使得X精子和Y精子合成蛋白質的數量均等,但并非所有基因產物都可以共享。通過流式細胞儀的分析檢測,發現有些蛋白質僅在X精子或Y精子中積累[19],X精子與Y精子之間的這種差異表達蛋白為分離兩種精子提供了理論依據[21],可用于開發性別控制的免疫學方法。免疫學分離方法的基本原理是基于識別和分離X精子與Y精子之間的蛋白差異,作為標記物,開發出特異性抗體,實現X精子與Y精子的分離[22]。

2.1 激活TLR7/8信號

精子特異性表達的toll樣受體可以與特定的配體發生反應[23-24],假設在一定的條件下選擇性地激活這些受體基因,X精子和Y精子在運動能力上會出現功能性差異[25-27]。Umehara等[27]從小鼠精子的RNA測序數據中發現,有492個基因在X染色體中選擇性表達,其中有18個編碼受體的基因,包含6個具有特定的配體(Ar、TLr8、Gpr174、TLr7、Gpr34、Eda2r)和12個具有共同配體的基因。其中TLr7和TLr8分別在小鼠精子尾部和中段表達TLR7和TLR8蛋白,二者擁有共同的配體R848,用該配體激活TLR7/8后用于培養精液,發現X精子的運動能力被選擇性抑制,而Y精子不受影響,且R848處理不影響精子生存能力和頂體狀態,即經R848處理后的精子仍保持受精能力,當R848撤去后,X精子活性可逐漸恢復。在分別添加R848和R837(TLR7的特定激活劑)的奶山羊精液中,檢測發現X精子的ATP水平隨著時間的延長逐漸下降,且R848處理后的精子其ATP水平低于R837處理組。ATP的產生受線粒體內三羧酸(TCA)循環和β-氧化以及細胞質中糖酵解的調節[27]。因此,Umehara等[27]跟蹤了精子的線粒體活性和糖酵解途徑中限速酶的活性,發現在精子中段表達的TLR8,其定位于線粒體,被R848激活后直接抑制線粒體活性,而位于精子尾部的TLR7被R848或R837激活后僅抑制糖酵解活性。既往研究表明,GSK3α/β磷酸化會降低樹突狀細胞中己糖激酶活性,降低ATP水平[25,28]。Umehara等[27]繼續檢測經R848處理后精子的GSK3α/β磷酸化水平,發現該磷酸化水平隨處理時間的增加而上升,證明激活TLR7/8信號,通過GSK3α/β磷酸化抑制糖酵解過程中關鍵酶(己糖激酶)活性,導致ATP產生減少,X精子運動速度下降。

利用TLR7/8在小鼠X精子上的特異性表達分離X精子和Y精子的機制,為動物性別控制技術提供了一種新方法。研究人員用該方法進行了奶山羊[15]和肉牛[29]的精子分離,結果與小鼠試驗一致。精子依靠細胞間信號轉導系統復雜的相互作用,形成一個信號通路網參與介導精子的運動[30]。在Zhu等[31]和Umehara等[27,32]研究的抑制機制基礎上,Ren 等[15]和Wen 等[29]分別對奶山羊和秦川牛精子的PI3Ks(一種脂質激酶家族)和AKT(PI3K的下游標靶蛋白)的磷酸化水平進行分析,綜合得出結論:即TLR7/8的激活劑(R848)通過TRAF6/PI3K/GSK3α/β磷酸化和TRAF6/NFκB磷酸化路徑,影響糖酵解活性和ATP的產生,進而選擇性抑制X精子的運動能力,而Y精子運動速度不受影響。Umehara等[27]在小鼠試驗中使用的精子是在附睪收集的新鮮精液,在公牛試驗[32]中使用的是解凍后的精子,其細胞膜已部分受損,對R848的滲透性可能與新鮮精子不同,因此在處理新鮮精子時,需要改變培養基中的代謝底物,以及R848的濃度和處理周期[32]。在秦川牛[29]和關中奶山羊[15]試驗中,其R848的處理水平與解凍精子有所不同,成功分離新鮮精子。TLr7/8基因在哺乳動物X染色體上的表達高度保守[33],因此使用R848激活TLR7/8信號通路分離X精子和Y精子有望成為一種新型的,操作簡單的性控技術[34](圖1)。

圖1 激活TLR7/8信號抑制X精子運動能力的作用機制[15, 27, 29]Fig.1 Activation of TLR7/8 signal inhibits X sperm motility[15, 27, 29]

2.2 其他差異蛋白

一般認為成熟精子不能進行轉錄、翻譯以及蛋白質合成[35],因而這些細胞非常適合進行蛋白質組學分析,通過直接比較細胞中的蛋白質水平,識別出導致細胞之間差異的標記物[20]。X精子或Y精子中具有特異性的細胞表面抗原,可作為分離精子的候選標記物。早期確定的精子細胞表面的HY特異性抗原能使Y精子失活[25],然而據Yadav等[21,36]研究發現,HY抗原還存在于X精子細胞表面,以及紅細胞和減數分裂前生殖細胞中,因此HY抗原不能特異性結合攜帶Y染色體的精子。性別決定區Y(SRY)是一個特異性定位在Y染色體上的無內含子基因,通過SRY產生的抗體可以將攜帶Y染色體的精子與攜帶X染色體的精子分開,目前已經嘗試開發針對重組SRY蛋白的抗體[36]。Soleymani等[37]開發了山羊SRY蛋白多克隆抗體(抗rbSRY),通過使用性控精子檢驗山羊抗rbSRYpAb的特異性,結果表明該抗體特異性結合Y精子。同時,針對公牛精液,也制備了針對牛SRY蛋白的單克隆抗體抗rbSRYmAb[38],證實含有SRY基因的Y染色體與mAbSRY特異結合。以上研究證明,SRY在Y染色體上特異性表達,可用于分離X精子和Y精子,但此試驗并未跟蹤洗脫后精子的受孕率數據,因此利用SRY分離精子的準確性還有待深入研究。Chowdhury 等[39]開發了一種針對Y精子的單克隆抗體WholeMom,此抗體能特異性結合在攜帶Y染色體的精子頭部,發生頭對頭凝集,抑制運動能力,而攜帶X染色體的精子自由運動,但該試驗樣本數較少,因此WholeMom分離的適用性和穩定性還有待驗證。

基因的差異表達導致X精子和Y精子的表型變異[21],Chen等[40]使用雙向電泳結合質譜的方法,分析鑒定出42種蛋白質在X精子和Y精子中差異表達,其中牛心臟細胞色素c氧化酶在完全氧化狀態下的鋅離子結合結構(2EIN_R)僅在X精子中表達。差異蛋白與能量代謝、抗逆性、細胞骨架組成等密切相關,造成X精子和Y精子的表型不同。De等[41]使用液相色譜結合質譜的方法對X精子和Y精子進行蛋白質組學研究,發現X精子細胞產生更高水平的3-磷酸甘油醛脫氫酶。Scott等[42]使用數據獨立采集的質譜法對精液中的蛋白質進行提取和分析,發現在X精子中,細胞色素C氧化酶亞基2(COX2)、β型乙酰輔酶A羧化酶(ACACB)等含量更為豐富;Y精子中含有更多有利于精子運動的DNAI2蛋白,因此攜帶Y染色體的精子比攜帶X染色體的精子運動速度更快。張潔等[43]使用高效液相色譜儀和質譜儀分析安格斯牛精子的蛋白質譜,發現在X精子中表達上調的蛋白質多與氧化磷酸化途徑密切相關,而在Y精子中表達上調的蛋白質主要參與各種氨基酸分解代謝。以上蛋白質組學研究發現的X精子與Y精子之間的差異表達蛋白多與應激損傷、細胞骨架結構和能量代謝有關,這些差異進而可影響兩種精子的運動能力。X精子中與能量代謝有關的差異蛋白,如3-羥基異丁酸脫氫酶(HIBADH)和線粒體異檸檬酸脫氫酶α亞基(IDH3A)促進電子傳遞與ATP合成相耦聯[40],而牛心臟細胞色素c氧化酶在完全氧化狀態下的鋅離子結合結構2EIN_R對 ATP合成和細胞色素氧化酶血紅素a起抑制作用[40],使X精子的運動速度降低;此外,X精子中高表達的蛋白質多與應激損傷有關[42],如誘導因子線粒體NADH脫氫酶(泛醌)鐵硫蛋白(7NDUFS7)、NADH 脫氫酶[43]κβ1亞基復合物底物10(NDUFB10)會引起氧化應激損傷,ATP合酶耦聯因子(ATP5PF)、ATP合酶亞基e (ATP5ME)在X精子中高表達導致ATP生成過多,引起一氧化氮(NO)激增,影響X精子的運動。而Y精子中存在谷胱甘肽合成酶(GSS)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTZ1)等許多抗氧化酶,可防止應激損傷(表2、表3)。

表2 Y精子中高表達蛋白及其作用Table 2 The role of highly expressed proteins in Y-sperm

表3 X精子中高表達蛋白及其作用Table 3 The role of highly expressed proteins in X-sperm

質膜蛋白對于細胞黏附、免疫、精子獲能、受精等過程十分重要[44],因此篩選X精子和Y精子細胞表面這一亞細胞結構的差異蛋白是實現免疫學分離的潛在方向。李淑芳[45]使用LC-MS/MS分別對奶牛和奶山羊的精子質膜蛋白進行鑒定分析,發現奶牛X精子和Y精子的膜差異蛋白主要參與精子運動、能量代謝以及有性生殖過程,而奶山羊精子的膜差異蛋白主要富集在粘附連接、疾病以及細胞凋亡等通路。Shen等[46]對奶牛X精子和Y精子膜表面進行蛋白質組學研究,發現X精子中解聚蛋白(DSTN)、肌動蛋白素(CFL1)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)等一系列與氧化應激誘導細胞衰老和凋亡過程相關的蛋白表達較多,推測X精子的免疫敏感性可能高于Y精子,同時X精子可能具有較強的超激活狀態,與免疫敏感性協同作用導致細胞衰老或凋亡加速,使其壽命比Y精子短?？缒そY構預測、亞細胞定位和Western blotting驗證結果表明,與其它差異表達蛋白相比,X精子中高表達的CLRN3蛋白和Y精子中高表達的SAMP1蛋白最有可能用作X精子和Y精子細胞表面的特異性候選抗原。Laxmivandana等[47]使用percoll梯度分離出駝峰牛精子的質膜部分,并經LC-MS/MS檢測,發現Y精子中大量存在支持精子獲能和精子運動速度的蛋白質,而X精子中存在較多與結構分子活性相關的蛋白質(表4)。

表4 X精子和Y精子質膜差異蛋白質Table 4 Differentially expressed plasma membrane proteins between X-sperm and Y-sperm

綜上所述,基于X精子和Y精子及其亞細胞區域的蛋白質組學分析結果,發現重組SRY蛋白的抗體[37-38]和亞細胞區域發現的特異性候選抗原SAMP1、CLRN3[46],以及Chen 等[40]發現在X精子中特異表達的2EIN_R蛋白可作為新的生物標志物,用于分離X精子和Y精子[20],但需要進一步驗證。激活TLR7/8信號分選技術已在小樣本的關中奶山羊[15]和秦川牛[29]上取得了良好的分離效果,有望應用于生產實踐,成為繼流式細胞儀之后的候選技術。

3 pH分離

在不同pH條件下,哺乳動物X精子和Y精子的活力存在差異[48-49]。Muehleis和Long[50]將兔子精液稀釋并培養在pH不同的緩沖液中,用該混合液對雌兔進行授精,檢測發現后代性別比例發生明顯改變。將人的精子置于pH不同的稀釋液中培養一段時間后,上層精液中X精子和Y精子比例發生變化[48,51]。He等[11]將奶山羊的精液在pH為6.2下培養,上層精液中X精子所占百分比為(67.24±2.61)%;在pH為7.4下培養,上層精液中Y精子的比例為(69.53±3.04%);而當pH低于6.2(如pH=5.8)或高于7.4(如pH=7.8)時,X精子和Y精子在上層精液的比例降低。pH與精子活力直接相關,精子在堿性條件下培養時其動力學參數、膜完整性、線粒體活性更高[52-53]。且精子運動受ATP水平調節[27],研究表明ATP產生與GSK3α/β磷酸化和NFκB活化有關[15,27,29],He等[54]在pH為7.4的稀釋液中培養奶山羊精子,發現精子NFκB和GSK3α/β磷酸化水平升高,影響X精子的線粒體活性和攝取葡萄糖的能力,從而降低X精子的活力,使X精子有效富集在下層。目前,這種分離方法僅在小規模奶山羊進行試驗,還需多方面深入研究,彌補奶山羊性控技術在畜牧生產實踐的空缺。

4 微流體和納米技術

Zeta電位是指固體和液體之間形成的膜電荷。Wongtawan等[55]研究發現,Y精子和X精子分別是-16 mV和-20 mV的Zeta電位,此差異影響兩種精子在靜電場下的流動性[56-57],基于此原理,可用于開發磁性納米顆粒和微流控介電泳芯片。磁性納米顆?？膳cY精子結合形成復合物[56],該復合物可被磁鐵吸附,實現分離;微流控介電泳芯片在不使用化學標記的情況下,通過非均勻電場可對細胞進行分類,生物醫學領域中成功對循環腫瘤細胞、紅細胞和血小板實現分離[58-60]。

金納米顆粒通常需要與具有特定功能的生物分子發生作用,從而產生金納米顆粒生物耦聯物[61],Gamrad等[62]研究了牛精液中Y染色體特異性的三聯體序列,利用三聚體形成的寡核苷酸(TFOs)作為配體,雜交獲得納米耦聯物,可鑒定攜帶Y染色體的精子,為分離精子提供一種可行的方法。Domínguez等[57]使用磁性納米顆粒(MNP)分離驢的精液,根據精子Zeta電位的差異,Y精子更易與MNP結合形成復合物。在電場力作用下,該復合物被拉向試管內壁,X精子仍懸浮在培養基中,可被收集。Wongtawan等[63]提出使用基于微流控介電泳的芯片作為分離牛精子的新方法。電解質電泳時,附著在電極上的精子稱為正DEP(pDEP),遠離電極的精子為負DEP(nDEP)。精子表現為pDEP或nDEP取決于施加的電位和頻率[55,64],pDEP精子附著在電極,而nDEP精子漂浮在溶液中,據此可分離X精子和Y精子。Wongtawan等[63]發現大多數Y精子對頻率變化較為敏感,在相同電壓條件下,當施加最低頻率(1 MHz)時,Y精子的pDEP比例較高;當使用最高頻率(20 MHz)時,X精子的pDEP比例較高;而X精子對電壓變化更敏感,增大電壓,X精子pDEP比例明顯增多。X精子和Y精子的pDEP比例差異最大的條件為4 V,1 MHz和8 V,20 MHz,在此條件下可分別收集到X精子與Y精子。但該結果存在個體差異,分選效率與分選周期、流速、電壓和頻率等有關,使用的緩沖液同樣會影響精子質量。Quelhas等[65]討論了免疫學方法在性別鑒定領域的重要性,強調可將免疫學方法和磁激活細胞分選技術相結合,免疫捕獲所需精子。Sringarm等[66]使用Y精子的特異性單克隆抗體scFV耦聯磁珠(PY磁珠)分離X精子和Y精子,PY磁珠選擇性結合Y精子后被強釹磁鐵所捕獲,X精子可單獨收集,實現分離。為了增大X精子富集比例,提高分離效率,Phiphattanaphiphop 等[56]在抗體耦聯磁珠的方法之上,提出采用多層碳納米管(MWCNTs)微流控裝置分離奶山羊精子。精液與單克隆抗體耦聯磁珠在試管中結合后,送入微流控芯片,與單抗抗體耦聯的磁珠帶正電荷,可附著在Y精子上,并將Y精子移動至負極,之后X精子在微通道層流的作用下移動至正極被收集。

5 總 結

以上X精子和Y精子分離方法在不同物種應用效果的分析比較結果如表5所示。李雪梅等[67]收集的荷斯坦奶牛的授精數據中,173頭青年母牛和200頭成年母牛使用性控凍精配種的產母犢率平均為(89.89±1.13)%。奶山羊試驗[15]使用激活TLR7/8信號,得到的X精子占比(80.30±2.91)%,將X精子用于體外受精后,其中雌性胚胎占比為(80.52±6.75)%。在秦川牛精液的分離[29]中,得到下層X精子占比(72.5±2.12)%,但該研究人員未進行體外受精觀察后代胚胎比例。日本黑牛試驗[32]中,經R848處理的下層沉淀物中X精子占比約86.2%,用于體外受精后雌性胚胎占比為(84.2±5.3)%。Huang等[68]使用含R848的弱堿性(pH=7.4)稀釋液培養奶山羊精液,得到X精子在下層富集達(85.57±3.27)%,體外受精得到的雌性胚胎比例為(83.25±2.77)%,人工授精后雌性后代占比約62.79%。He等[11]將在pH=6.2的稀釋液中收集的X精子用于體外受精,經鑒定得到的雌性胚胎占比約(66.67±0.05)%。Sringarm等[66]使用Y-scFV抗體與磁珠耦聯,上層X精子占比高達82.65%;Phiphattanaphiphop等[56]使用單克隆抗體耦聯磁珠與精子在微流體系統中分選,Y精子的分離率約80.12%,通過該技術分離得到的精子用于體外受精的研究較少,暫時無法確定其后代比例。以上數據表明,流式細胞分離法的應用效果最好,是目前發展較為成熟的性控技術;在小樣本試驗中,TLR7/8信號激活分離精子的方法其應用效果僅次于流式細胞術,有望成為流式細胞術的候選技術。

表5 X精子和Y精子分離技術應用效果對比Table 5 Comparison of application effect of X-sperm and Y-sperm separation techniques

6 展 望

隨著分子生物學和細胞生物學的發展,通過分離X精子和Y精子,性別控制技術可以顯著提高雌性繁殖效率,增加生產效益。迄今為止,流式細胞分離法是唯一有效實現性別控制的商業化方法,雖然在分選程序上對精液品質有一定的影響,但隨著研究的不斷深入,分離過程不斷得到優化,對精子的損害也有所減少。新型的性控技術目前尚處于試驗階段,有待進一步完善分選體系。其中免疫學方法較為簡單且易操作,激活TLR7/8信號分選技術已在小樣本的關中奶山羊和秦川牛上取得了良好的分離效果,有望應用于生產實踐,同時隨著蛋白質組學研究的不斷深入,可進一步驗證2EIN_R、CLRN3、SAMP1等差異表達蛋白作為生物標記物分離X精子和Y精子的可行性,發展免疫學分離方法,以期應用于性控精液生產。