外源維生素E和硒調控動物精液品質的研究進展

魏雅婷,徐澤君,陳虹宇,王獻偉,陳其新*,劉深賀*

(1.河南農業大學動物科技學院,鄭州 450046;2.河南省畜牧技術推廣總站,鄭州 450008)

優良的公畜精液是實現高質量育種和提高后代生產力的基礎。然而,當低溫、應激、疾病等不良因素造成動物機體或精子本身的氧化與抗氧化系統失衡時,易產生氧化應激,損傷睪丸功能、精子質膜、DNA完整性和線粒體功能,導致精液品質降低[1]。畜禽機體內具有一定的酶類抗氧化物質,通過清除過量產生的ROS保護精子細胞結構和功能的穩定,主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px),SOD的活性反映了機體清除自由基的能力,GSH-Px主要存在于線粒體中用于清除過氧化氫和脂質過氧化物(lipid peroxidation, LPO)[2]。抗氧化劑具有調節各種抗氧化酶,清除過量的ROS,改善精液品質的作用[3],因此,各種外源抗氧化劑被添加到動物日糧或精液稀釋液中,其中維生素E和硒作為常見的兩種抗氧化劑被廣泛研究和使用[4-5]。本文綜述了單獨或聯合使用維生素E和硒在調控公畜(禽)精液品質上的應用效果及調控機制,旨在為維生素E和硒的產業化應用提供理論依據和現實參考。

1 維生素E和硒的生理功能

維生素E又名生育酚,具有抗氧化、調節免疫系統、誘導細胞凋亡、參與鐵代謝和甾體生成等功能[6]。維生素E苯環上存在一個可提供單電子具有還原性的羥基,當過量產生的ROS引發細胞膜多不飽和脂肪酸發生脂質氧化時,維生素E能夠阻斷ROS的鏈式反應,發揮抗氧化作用[7-8]。硒是GSH-Px的重要組成部分,每分子中含有4個硒原子,該酶對于機體抗癌、抗氧化、免疫和衰老起著重要調控作用[9]。硒通過各種含硒酶及硒蛋白發揮效應,參與細胞抗氧化的硒酶主要有GSH-Px,此外抗氧化酶還包括SOD、過氧化氫酶(catalase, CAT)和硫氧還蛋白過氧化物酶等[10]。

維生素E和硒能構建一個完整的抗氧化系統,二者在生理功能上存在協同關系(表1)。在細胞中,硒對維生素E的再生有促進作用,Ebeid等[11]試驗證明0.3 mg·kg-1有機硒和250 mg·kg-1維生素E組合使用時,有機硒促進維生素E在獺兔機體內再合成。維生素E再生涉及的一些酶,如GSH-Px的合成依賴硒的參與,硒是GSH-Px表達的輔助因子之一[12-13],硒含量較低時GSH-Px的活性會快速下降,GSH-PxmRNA的表達量也隨之下降,反之mRNA的表達量升高[10]。此外,硒是胰腺維持正常生理功能必需的微量元素,胰腺分泌的胰蛋白酶和胰脂肪酶可消化脂肪,間接促進脂溶性維生素E的吸收[14]。維生素E與硒有相似的生理功能,但二者作用部位不同,不可相互替代,維生素E主要在細胞外阻斷ROS的鏈式反應,硒則以GSH-Px作為進入睪丸細胞的載體,清除進入細胞內的ROS以及細胞自身過量產生的ROS,故維生素E相當于機體抗氧化系統的第一道防線,硒則為第二道防線[15]。維生素E和硒在保護細胞生物膜免受氧化應激損傷、減緩睪丸氧化應激和清除自由基方面具有協同作用[16],但如果一種供給量低于臨界值,另一種即使過量也不能緩解氧化應激癥狀[14]。

表1 維生素E和硒協同作用關系Table 1 Synergistic relationship between vitamin E and selenium

2 外源維生素E和硒調控動物精液品質應用效果

2.1 稀釋液中添加維生素E和硒調控畜禽精液品質

動物精液具有抗氧化應激系統,包括酶促和非酶促抗氧化劑[17],精清中含有CAT、SOD、GSH-Px、維生素A、維生素E、維生素C、尿酸、谷胱甘肽及類胡蘿卜素等天然抗氧化劑[18],然而精液在凍精生產過程中,低溫平衡和精液凍融時精子代謝會產生大量的ROS,原精進行稀釋后導致精清中天然抗氧化劑濃度降低,內源性防御系統不足以對抗過量產生的ROS,造成精液品質下降,甚至使其喪失正常受精能力,精子氧化應激是造成凍后精子活力下降的重要原因[19]。

大量研究證明,在稀釋液中添加維生素E和硒能夠降低精液冷凍保存過程中ROS 的生成,并維持精液抗氧化系統的平衡,提高精液冷凍保存的質量。例如,陳曉英等[20]在娟姍牛精液稀釋液中添加0.03 mg·mL-1維生素E,在4 ℃的環境中保存48 h后,娟姍牛精子活力、精子頂體完整率顯著提高。Zhu等[21]在兔的精液稀釋液中添加200 μm·mL-1維生素E類似物,抑制凍融過程中過量產生的ROS,提高精子凍后活力、質膜和頂體的完整性。然而,郭良勇等[22]研究發現稀釋液中添加維生素E對精液的保存質量無明顯改善,但可顯著減少丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和增強精液中總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)。Espina-vila[23]等試驗表明,在5 ℃冷藏環境中,精液稀釋液中添加10 mg·mL-1維生素E對精子質膜完整性和通透性有保護作用,但對精子運動性無明顯影響。在精液生產中,硒和維生素E對精液品質的作用效果相似,Nateq等[24]證實公羊精液稀釋液中添加1 μg·mL-1納米硒溶液能夠顯著提高精子活力和質膜完整性,并降低MDA含量。Khalil等[25]指出,公牛精液稀釋液添加0.5或1 μg·mL-1納米硒能夠改善精子活力、質膜完整性以及精漿抗氧化應激的能力,使精子的畸形率顯著下降。同樣,維生素E和硒聯合添加也具有提高畜禽精液品質的作用效果。例如,楊文瑾[26]在牛精液常規卵黃冷凍稀釋液中添加 0.5、0.75、1 μL·10 mL-1亞硒酸鈉+維生素E制劑,凍融后的精子畸形率下降,添加1 μL·10 mL-1時精子頂體完整率上升,低劑量(<1 μL·10 mL-1)添加時顯著改善精子存活率,使精子在體外37 ℃環境中的存活時間由7 h延長至8.5 h。Kowalczyk等[4]試驗證明,大松雞精液稀釋液中添加1 mg·mL-1有機硒和8 mg·mL-1維生素E,相比于對照組,在4 ℃條件下保存24 h后,精液活精子百分比提升2.3%。

當維生素E和硒過量添加時會對精液品質造成危害。例如,當在山羊鮮精中添加3 mg·mL-1維生素E時,高水平維生素E可能抑制了銅、鐵的性能進而影響精子活力和密度[27]。同樣,公牛精液中添加1.5 μg·mL-1納米硒不僅降低精清中GSH-Px活性,而且增加了LPO水平和硒毒性[28],當超過一定限度后,硒添加濃度越高對精液的危害越大[29]。通過在不同動物品種的精液稀釋液中,添加不同濃度的外源維生素E和硒進行濃度梯度試驗及添加效果的比較研究(表2),發現雖然最適添加水平不盡相同,但二者單獨或聯合使用均可緩解精子氧化應激,主要表現在提高精子活力、保護精子頂體膜的完整性。

表2 精液稀釋液中添加外源維生素E和硒對動物精液品質的影響Table 2 Effects of adding exogenous vitamin E and selenium in semen diluent on semen quality

2.2 日糧添加維生素E和硒改善畜禽精液品質

2.2.1 維生素E 睪丸內精子發生和甾體形成產生的少量ROS對精子獲能、頂體反應和精卵結合是有利的,但過量ROS生成會降低膜的流動性、損傷蛋白質,危害睪丸正常的生理功能[37]。日糧中添加維生素E可增強睪丸細胞膜和線粒體膜的抗氧化能力,抑制睪丸內ROS的過量產生,進而改善睪丸生理功能。例如,Yue等[38]在綿羊日糧中添加200 IU的維生素E后睪丸細胞膜和線粒體膜中SOD、GSH-Px活性增強、MDA水平降低。在附睪抗氧化系統中維生素E同樣發揮著重要作用,小鼠體內缺乏維生素E導致附睪中氧化應激相關基因的表達降低,補充維生素E后附睪內谷胱甘肽s-轉移酶(GST)、GSH-Px的表達增加了50%以上[39]。Zhu等[40]研究發現,波爾山羊日糧中添加80和320 IU·kg-1維生素E使其睪丸重量增加,生精細胞的數量和密度以及曲精細管和附睪小管的直徑都相應增加,表明日糧中適量添加維生素E促進動物睪丸的發育和精子發生,類似的結論在公豬[41]、小鼠[42]、雞[43]等其他動物上也得到了證實(表3)。

表3 日糧中添加或皮下注射維生素E和硒改善畜禽精液品質的應用效果Table 3 Effect of dietary supplementation or subcutaneous injection of vitamin E and selenium on improving semen quality of livestock and poultry

2.2.2 硒 硒對公畜睪丸功能、精子發生、性激素合成及抗氧化酶的活性有著重要影響[44-45]。大鼠日糧缺硒導致精子在附睪中成熟發生缺陷,附睪中精子尾部表現出一系列鞭毛缺失現象以及線粒體鞘過早終止[46]。Mojapelo和Lehloenya[47]給薩能山羊仔畜飼喂亞硒酸鈉后,使其更早達到初情期,單次射精量、精子活力、精液密度、山羊體重及睪丸尺寸顯著增加。Chen等[48]在公雞含250 mg·L-1氯化汞日糧中添加10 mg·kg-1的亞硒酸鈉,可抑制氧化汞應激產生的ROS,降低MDA水平,使血睪屏障支持細胞的膜表面蛋白表達增加,睪丸SOD、GSH-Px以及T-AOC水平也相應增加。應注意,日糧中硒過量添加會沉積于動物附睪中,破壞附睪和精細胞的微觀結構,由于硒的毒性及其進入血液循環和組織的速度使得其應用受到限制[49],因此毒性更小、更有益的納米硒顆粒成為當前的研究熱點。

2.2.3 維生素E和硒聯合應用 Jerysz和Lukaszewicz[50]對3歲齡的公鵝每千克飼糧補飼0.3 mg硒和100 mg維生素E,相比于對照組,試驗組的公鵝射精量增加1.5倍,精子密度提高1.7倍,精子畸形率降低4.3%～50%,LPO水平降低12倍。金海峰[10]飼喂30日齡公羔羊,每千克飼糧添加0.3 mg硒和 100 IU維生素E降低了精子畸形率,GSH-Px和T-AOC水平顯著高于對照組,并增強了精漿抗氧化酶系活性。皮下和(或)肌肉注射維生素E和硒對畜禽精液品質也具有改善作用。例如,Mahmoud等[51]對1.5～2歲的公羊1周兩次皮下注射維生素E和硒聯合制劑(450 mg維生素E,5 mg硒),顯著增加了公羊左右睪丸的寬度和長度,附睪和陰囊的周長,且提高了公羊射精量、精子活力和密度,并降低精子畸形率。Ozer Kaya等[52]對公羊肌肉注射維生素E 300 mg·kg-1和硒5 mg·kg-1,精液中異常精子率下降,這與Safa等[53]在公雞上得出的結論一致。此外,公羊精漿精氨酸酶活性、精液體積、精子活力和濃度較對照組均提高,精漿一氧化氮水平和精液pH降低。綜上所述,一定劑量的維生素E 和硒聯合使用可提高畜禽生殖性能。

當公畜(禽)處于熱應激狀態時,嚴重影響其生殖性能,表現為性欲減退、射精量減少、精子活力降低、畸形率升高以及精子質膜完整性下降等[54-55]。日糧中聯合添加維生素E和硒可緩解熱應激造成的公畜精液品質下降。例如,施力光等[56]在海南黑山羊熱應激狀態下,每千克飼糧補飼硒 0.5 mg和維生素E 100 mg,與對照組相比,添加二者并沒有顯著影響山羊射精量,但能顯著提高山羊的精子密度和精子活力,極顯著降低精子畸形率,精漿中GSH-Px、CAT、T-AOC的表達活性增強,精子代謝過程中MDA的產生量減少,顯著降低了精漿熱休克蛋白HSP70和HSP90 mRNA的表達水平。Hosny等[12]在日糧含硒 0.34 mg·kg-1的基礎上額外添加0.3 mg·kg-1納米硒,大幅度緩解了公兔熱應激,提高了公兔抗熱應激能力和繁殖性能。Ebeid[55]證實單獨飼喂公雞0.3 mg·kg-1有機硒或200 mg·kg-1維生素E提升了熱應激狀態下精子密度和活力,降低了死精率,當二者組合飼喂顯著提高了精漿GSH-Px活性,提升了精液品質。Butt等[57]試驗發現,熱應激下每天飼喂公牛6 000 IU維生素E和3 g硒,可改善公牛精液品質和提高睪酮水平,但其代謝產熱并沒有降低。基于以上研究,表明飼糧中添加維生素E與有機硒具有協同作用,可改善精漿抗氧化能力,從而緩解熱應激造成動物精液品質的下降[58](表3),但二者組合最適添加劑量目前沒有確切定論。

3 維生素E和硒抗氧化調控機理

睪丸功能障礙是造成精液品質下降的主要原因,ROS引起的氧化應激可激活抗氧化酶防御系統,同時調控多種抗氧化信號通路、離子通路,保護細胞免受氧化損傷。

3.1 CATSPER離子通道

CatSper(cation channel of sperm)基因是編碼離子通道蛋白的基因家族之一,包括成孔蛋白CATSPER1-4和多個輔助亞基。CatSper是精子細胞膜上最重要的鈣離子通道,在人、馬、鼠、羊、豬精子中特異性表達,主要分布在精子頸部、尾部和細胞質滴上,對于調節精子運動和受精過程起著重要作用[61-63]。CatSper1和CatSper2定位于精子尾部的線粒體上,對精子運動起重要作用[64]。CatSper3和 CatSper4定位于精子頭部,影響精子超活化和頂體反應等功能[65]。CatSper是哺乳動物精子細胞膜上實現精子超激活的重要Ca2+通道,通過對生理配體的響應來調節精子的關鍵生理過程,包括精子獲能、超激活、頂體反應和趨化性[66-67]。鎘誘導細胞產生過量ROS,鎘處理的小鼠體內CatSper離子通道的電流降低,CatSper亞基的表達水平下降,說明氧化應激抑制了CatSper亞基表達水平[68]。硒和維生素E可通過調節CatSper基因表達,抵抗衰老小鼠體內過量產生的ROS,改善老年鼠精液品質。Mohammadi等[69]在老年鼠腹腔注射維生素E 106 mg·kg-1,收集老年鼠左側睪丸和附睪尾檢測CatSper基因的表達情況,發現精子頭部和精子中部CatSper1和CatSper2染色強度增加,維生素E上調了老年鼠的CatSper1和CatSper2基因表達,提高了精子的活力、數量、存活率且降低畸形率。同樣老年鼠腹腔中注射0.2 mg·kg-1亞硒酸鈉也具有上調CatSper基因表達、提高精子活力、改善精子形態和存活率的作用[70]。目前對于CatSper的研究正處于探索階段,已知CatSper1和CatSper2對男性生育能力是不可或缺的,剔除CatSper1和CatSper2后影響精子的活力和運動性[71],CatSper基因可作為精子運動和精子功能的候選基因,從而用于選擇優良種公畜。下一步應深入研究CatSper離子通道在調節精子運動、獲能和頂體反應的作用及機制,為后續抗氧化劑的開發研究及治療公畜不育提供重要的理論基礎。

3.2 Nrf2-keap1-ARE通路

Nrf2(nuclear factor erythroid related factor-2,Nrf-2)是機體抗氧化和細胞防御系統的關鍵調節因子,通過激活細胞內解毒酶和一些抗氧化蛋白調節機體抗氧化系統[48]。Nrf2對于血睪屏障和睪丸組織功能有重要作用,如糖尿病小鼠的精子發生障礙與其睪丸中Nrf2的表達降低存在密切關系[72]。在機體穩態狀態下,Nrf2與其抑制劑Keap1(kelch-like ech-associated protein 1,Keap1)結合位于細胞質中,當發生氧化應激時,ROS刺激Nrf2與keap1分離,Nrf2被磷酸化后進入細胞核中與抗氧化元件(ARE)結合,調節ARE啟動子的基因表達,上調抗氧化基因、II期解毒酶(如GST)的轉錄和合成,從而維持細胞氧化還原穩態和蛋白質穩態[73-75]。

李可欣等[76]在體外培養的綿羊睪丸間質細胞中添加2 μmol·L-1的亞硒酸鈉,睪丸間質細胞中GSH-Px和SOD的活性增強,并激活Nrf2通路以抵抗氧化應激。隨著亞硒酸鈉濃度的升高,Keap1活性及其mRNA和蛋白的表達水平下降,促使Keap1釋放Nrf2進入細胞核與ARE結合。當亞硒酸鈉添加量為8 μmol·L-1時,細胞中Nrf2、血紅素加氧酶(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO-1)的mRNA和蛋白表達呈升高趨勢,表明亞硒酸鈉可通過激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路調控綿羊睪丸間質細胞的抗氧化能力[77](圖1)。Fang等[74]研究表明維生素E抑制鎘誘導的氧化應激,保護大鼠肝臟功能并激活Nrf2通路抵抗ROS。Liu等[78]證實,維生素E促進大鼠血睪屏障支持細胞相關蛋白ZO-1、Occludin、N-cadherin和β-catenin的表達,激活Nrf2通路以緩解PM2.5引起的氧化應激損傷。維生素E和硒協同促進抗氧化途徑Nrf2-Keap1-ARE的表達機制目前還存在爭議[74,79],部分學者認為維生素E和硒通過激活Nrf2,上調下游基因NQO1、HO-1、谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLM)、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLC)的表達,刺激顆粒細胞增殖和甾體生成,減少細胞凋亡、緩解內質網應激[80]。相反,Burk等[81]研究發現,乏硒會影響Nrf2-Keap1-ARE誘導的抗氧化酶表達,但是缺乏維生素E卻不會,由此認為維生素E和硒的氧化防御機制是相互獨立的。Nrf2的激活可作為治療睪丸功能障礙的靶點,由于血睪屏障阻礙了Nrf2激活劑進入睪丸發揮作用,未來納米載體的抗氧化物質(如納米硒)在穿越血睪屏障方面具有巨大潛力,下一步應著力研究不同抗氧化劑之間是否具有協同通路以及二者發揮作用的機理。

紅線為下調作用,黑色箭頭為上調作用The red lines indicate down-regulation, and the black arrows indicate up-regulation圖1 維生素E和硒調控Nrf2-Keap1-ARE通路抵抗氧化應激[72, 81]Fig.1 Vitamin E and selenium regulate the Nrf2-Keap1-ARE pathway against oxidative stress[72, 81]

4 展 望

日糧或稀釋液中單獨或聯合添加維生素E和硒均對調控動物精液品質有著積極作用。維生素E和硒在日糧和稀釋液中最佳添加劑量一直存在爭議,可能是由于不同動物品種遺傳因素、個體差異、精子結構差異、動物體內抗氧化劑的基礎濃度或狀態、添加物的物理狀態差異(粒徑、孔徑、表面電荷)、飼養管理水平和冷凍精液的儲存時間等因素造成。維生素E和硒調控動物精液品質的具體機制以及二者之間發揮協同作用的通路尚存在分歧。下一步應深入研究維生素E、硒調控公畜(禽)生殖系統的機制,并借助具有高吸附能力、高吸收利用效率的納米載體開發具有協同作用的復合型抗氧化劑,以期指導生產實踐。