雞FGF6基因生物學(xué)特性及其多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

曹玉珠,邢雨欣,馬乘霖,管宏波,賈其輝,康相濤,2,3,田亞?wèn)|,2,3,李轉(zhuǎn)見,2,3,劉小軍,2,3*,李 紅,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,鄭州 450046;2.河南省家禽育種國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046;3.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6(fibroblast growth factor 6,FGF6)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)的成員之一,主要通過(guò)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)1和4結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)活性[1-2]。有研究表明,FGF6是血管新生誘導(dǎo)因子之一,它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成[3]。沉默F(xiàn)GF6會(huì)抑制膀胱癌(BC)細(xì)胞系有氧糖酵解,從而調(diào)節(jié)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路抑制其血管生成[4]。FGF6基因可調(diào)節(jié)人舌頭發(fā)育過(guò)程中的肌源性分化和成肌細(xì)胞融合[5]。Cai等[6]通過(guò)構(gòu)建肌母細(xì)胞和周圍神經(jīng)損傷的體內(nèi)模型,發(fā)現(xiàn)FGF6在去神經(jīng)支配的大鼠肌肉中增強(qiáng)了MyHC-IIb肌纖維表型,減少了肌肉萎縮,進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)支配后再生骨骼肌的功能恢復(fù)。Xu等[7]通過(guò)對(duì)男性骨骼肌樣本進(jìn)行甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序(MeDIP-Seq)和RNA測(cè)序(RNA-Seq)發(fā)現(xiàn)FGF6基因表達(dá)下調(diào),骨骼肌中過(guò)表達(dá)FGF6能夠改善胰島素抵抗,增加骨骼肌的AMPK活性,進(jìn)而增加全身葡萄糖量和脂質(zhì)代謝。Shamsi等[8]發(fā)現(xiàn),FGF6作為一種脂肪因子可獨(dú)立于脂肪生成機(jī)制調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的表達(dá),并調(diào)節(jié)全身能量代謝。Liu等[9]研究表明,FGF6是脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞(APC)維持脂肪穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的增殖因子。Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn),重組人FGF6蛋白能夠通過(guò)抑制Hippo途徑改善心肌梗死(MI)小鼠的心臟功能并促進(jìn)其心臟的修復(fù)能力。Creighton等[11]通過(guò)對(duì)非裔美國(guó)人前列腺癌(Pca)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組學(xué)全DNA甲基化的綜合分析,發(fā)現(xiàn)了與Pca唯一相關(guān)的包括FGF6在內(nèi)的12個(gè)候選基因。

上述關(guān)于FGF6基因的報(bào)道主要集中在哺乳動(dòng)物上,表明該基因在血管形成、骨骼肌再生、葡萄糖代謝、脂肪生成及穩(wěn)態(tài)、心肌發(fā)育和腫瘤細(xì)胞的發(fā)育等生理和病理過(guò)程中具有重要作用。在雞上,Kumar和Chapman[12]對(duì)雞FGF6基因進(jìn)行了克隆,并通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)其在雛雞的頭部、咽部和內(nèi)臟中胚層廣泛表達(dá)。先前研究發(fā)現(xiàn)FGF6基因在固始雞的十二指腸高表達(dá)[13]。除此之外,有關(guān)雞FGF6基因的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

綜上,FGF6基因在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖、肌肉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,在雞上對(duì)其研究較少,尚未見對(duì)FGF6基因多態(tài)性及與雞經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析。本研究旨在通過(guò)對(duì)雞FGF6基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對(duì)雞FGF6基因的SNPs與雞的生長(zhǎng)、屠體、肉品質(zhì)和血清生化指標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,篩選與雞經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的重要SNPs及單倍型組合,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ),為雞分子育種提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心構(gòu)建的固始雞×安卡雞F2資源群768個(gè)個(gè)體為研究對(duì)象(該群體按F2遠(yuǎn)緣半同胞設(shè)計(jì)方案,有正反交7個(gè)家系)[14]。所有雞飼養(yǎng)在同一環(huán)境,自由采食飲水,飼喂至第84天時(shí),頸靜脈采血,血液置于含/不含EDTA的抗凝管中,用于制備DNA/血清。768只雞簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(genotyping-by-sequencing, GBS)數(shù)據(jù)[15]及個(gè)體所對(duì)應(yīng)的表型數(shù)據(jù)庫(kù)由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 測(cè)定表型指標(biāo)

固始雞×安卡雞F2資源群所有個(gè)體從孵化起,每隔2周稱體重,每隔4周測(cè)定體尺指標(biāo)。體重指標(biāo)包括出生重(birth weight, BW0)、2周體重(BW2)、BW4、BW6、BW8、BW10和BW12。體尺指標(biāo)包括0、4、8和12周齡的脛長(zhǎng)(shank length, SL)、脛圍(shank girth, SG)、胸深(chest depth, CD)、胸寬(chest width, CW)、胸骨長(zhǎng)(breast bone length, BBL)、胸角(breast angle, BA)、體斜長(zhǎng)(body slanting length, BSL)和骨盆寬(pelvis breadth, PB)等32個(gè)指標(biāo)[14]。

84日齡屠宰后測(cè)定屠體、肉質(zhì)和血清生化相關(guān)指標(biāo)。屠體性狀包括肝臟重(liver weight, LiW)、胸肌重(breast muscle weight, BMW)、腿肌重(leg muscle weight, LMW)、腿重(leg weight, LW)、腹脂重(abdominal fat weight, AFW)、屠體重(carcass weight, CW)、半凈膛重(semi-evisceration weight, SEW)、全凈膛重(evisceration weight, EW)及其對(duì)應(yīng)的比率等16個(gè)指標(biāo)[15]。肉質(zhì)性狀包含腿肌剪切力(leg shear force, LSF)、胸肌剪切力(breast shear force, BSF)、胸肌失水率(water loss rate of breast muscle, WLRB)和腿肌失水率(water loss rate of leg muscle, WLRL)4個(gè)指標(biāo)[16]。血清生化指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、膽堿酯酶(choline esterase, ChE)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、總膽固醇(total cholesterol, CHO)、甘油三酯(triglyceride, TG)等15個(gè)指標(biāo)[17,18]。

1.3 生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人(NP_066 276.2)、鼠(NP_571 983.1)、雞(XP_001 232 071.1)、火雞(XP_003 202 616.1)、綠海龜(XP_007 055 701.1)、熱帶爪蟾(NP_001 136 295.1)和斑馬魚(NP_001 001 398.2)FGF6的氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì),利用MEGA10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用生物信息學(xué)在線軟件對(duì)FGF6蛋白理化性質(zhì)及功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。相關(guān)分析項(xiàng)目及對(duì)應(yīng)的工具見表1。

表1 生物信息學(xué)分析在線軟件Table 1 The bioinformatics analysis online softwares

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用POPGENE Version32構(gòu)建單倍型并計(jì)算SNPs位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC),并檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡。

利用SPSS24.0軟件的混合線性模型(最小二乘分析)對(duì)FGF6不同基因型和單倍型組合與F2資源群經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,數(shù)據(jù)的多重比較使用邦弗倫尼(Bonferroni)校正。關(guān)聯(lián)分析模型如下:

Yijklm=μ+Gi+Sj+ Hk+fl+eijklm。

式中:Yijklm為個(gè)體性狀的表型值;μ為性狀總體均值;Gi為基因型的固定效應(yīng)(1～3);Sj為性別的固定效應(yīng)(1, 2);Hk為批次的固定效應(yīng)(1, 2);fl為家系的隨機(jī)效應(yīng)(1～7);eijklm為隨機(jī)誤差。P<0.05表示差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié) 果

2.1 FGF6系統(tǒng)進(jìn)化樹和保守性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得FGF6不同物種的氨基酸序列并進(jìn)行分析(圖1),利用CLUSTALW將獲得的雞FGF6基因序列與其他6個(gè)物種對(duì)比發(fā)現(xiàn),雞FGF6氨基酸序列與人、鼠、火雞、非洲爪蟾、斑馬魚和綠海龜?shù)男蛄邢嗨菩苑謩e為65.05%、66.02%、91.26%、63.59%、68.29%、85.44%。不同物種FGF6氨基酸序列利用MEGA10.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示雞FGF6與火雞親緣關(guān)系最近,其次為綠海龜,與斑馬魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖1A)。FGF6保守性分析表明FGF6在不同物種中保守性較高,擁有相同的motif1～4、6基序(圖1B)。

A. 不同物種間FGF6系統(tǒng)進(jìn)化樹;B. 不同物種FGF6保守性分析A. Phylogenetic tree of FGF6 among different species; B. Conservativeness analysis of FGF6 among different species 圖1 不同物種間FGF6氨基酸序列分析Fig.1 Amino acid sequence analysis of FGF6 among different species

2.2 雞FGF6蛋白理化性質(zhì)、信號(hào)肽、親水性/疏水性和高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用Expasy-Protparam在線軟件對(duì)雞FGF6基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果顯示FGF6蛋白分子式為C1023H1617N287O298S9,分子量為22 993.38 u,等電點(diǎn)(pI)為9.28,其蛋白不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為35.68,說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為89.47,總平均親水性系數(shù)為-0.163,說(shuō)明FGF6蛋白是親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示FGF6在第36～37位存在信號(hào)肽序列,概率為62.74%,推測(cè)其為分泌蛋白(圖2A)。Expasy-ProtScale在線軟件計(jì)算FGF6蛋白的疏水性,疏水性最大值為3.011(第27位氨基酸),最小值為-2.400(第70位和71為氨基酸),該蛋白為親水性蛋白(圖2B)。FGF6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示無(wú)規(guī)則卷曲占比44.17%,α螺旋占26.70%,β轉(zhuǎn)角為8.74%,延伸鏈為20.39%(圖2C)。FGF6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致(圖2D)。

A.雞FGF6蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析;B.雞FGF6蛋白質(zhì)疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);C.雞FGF6蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(h.α-螺旋;t.β-轉(zhuǎn)角;c.無(wú)規(guī)則卷曲;e.延伸鏈);D.雞FGF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Chicken FGF6 protein signal peptide analysis; B. Chicken FGF6 protein hydrophobic structure prediction; C. Chicken FGF6 protein secondary structure analysis (h.α-helix; t.β-turns; c.irregular coiling; e.elongated strand); D. Chicken FGF6 protein tertiary structure prediction圖2 雞FGF6蛋白質(zhì)信號(hào)肽、親疏水性及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 The prediction of chicken FGF6 protein signal peptide, hydrophilicity, potential secondary and tertiary structure

2.3 雞FGF6跨膜域、亞細(xì)胞定位、磷酸化和N-糖基化分析

利用TMHMM-2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,FGF6第21～40位氨基酸處存在一個(gè)跨膜區(qū)域(圖3A)。利用UniProt進(jìn)行亞細(xì)胞定位,GO注釋顯示FGF6位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間(圖3B)。利用NetPhos 3.1進(jìn)行磷酸化預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,FGF6蛋白有12個(gè)絲氨酸、5個(gè)蘇氨酸和5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化(圖3C)。利用NetNGlyc 1.0進(jìn)行糖基化預(yù)測(cè),結(jié)果顯示FGF6蛋白第44位氨基酸處有一個(gè)N糖基化位點(diǎn),可能性為74.42%(圖3D)。

A.雞FGF6蛋白質(zhì)跨膜分析;B.雞FGF6蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);C.雞FGF6蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè);D.雞FGF6蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)A. Chicken FGF6 protein transmembrane analysis; B. Prediction of subcellular localization of chicken FGF6 protein; C. Prediction of chicken FGF6 protein phosphorylation sites; D. Prediction of chicken FGF6 protein glycosylation sites圖3 雞FGF6蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、磷酸化、糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted transmembrane structure, subcellular localization, phosphorylation and glycosylation sites of chicken FGF6 protein

2.4 雞FGF6蛋白互作分析

利用STRING在線軟件對(duì)FGF6的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示FGF6與FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)等5個(gè)蛋白可能存在相互作用(圖4)。

圖4 雞FGF6蛋白與其他蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Network analysis of chicken FGF6 protein interaction with other proteins

2.5 雞FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)的篩選

根據(jù)GenBank公布的雞FGF6基因序列(XM_001 232 070.4),下載獲取FGF6基因組啟動(dòng)子區(qū)域2 kb(73397575-73410291(-))序列,基于實(shí)驗(yàn)室保存的固始雞-安卡雞F2資源群的GBS數(shù)據(jù)(GRCg6a版本)[17],篩選FGF6基因組包含啟動(dòng)子區(qū)域2 kb序列在固始雞-安卡雞F2資源群GBS數(shù)據(jù)中存在的所有SNPs位點(diǎn),共得到6個(gè)遺傳變異位點(diǎn),均位于第1內(nèi)含子上,見表2。

表2 雞FGF6基因上SNPs信息Table 2 SNPs information on chicken FGF6 gene

2.6 群體遺傳學(xué)分析

對(duì)雞FGF6基因的多態(tài)性進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析表明,在F2資源群中,6個(gè)SNPs位點(diǎn)均存在3種基因型,其中rs73399071位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為GG(n=467),基因型頻率為0.650;rs73399075位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為TT(n=590),基因型頻率為0.821;rs73399124位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC(n=541),基因型頻率為0.752;rs73399207位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為TT(n=367),基因型頻率為0.510;rs73399282位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC(n=438),基因型頻率為0.609;rs73399353位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為TA(n=313),基因型頻率為0.435。除rs73399353外,其余5個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.001)。6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)介于1.419 3～2.853 2,雜合度(He)介于0.295 4～0.649 5,多態(tài)信息含量(PIC)介于0.484 9～1.073 4。各位點(diǎn)的等位基因頻率,Ne、He、PIC等群體遺傳學(xué)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 F2資源群FGF6基因SNPs位點(diǎn)的遺傳特性Table 3 Genetic characterization of the SNPs loci of the FGF6 gene in the F2 resource population

2.7 連鎖不平衡分析

利用Haploview 4.2軟件對(duì)rs73399071、rs73399075、rs73399124、rs73399207和rs73399282這5個(gè)處于哈代-溫伯格平衡位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡(LD)分析(圖5),結(jié)果顯示,這5個(gè)位點(diǎn)之間完全連鎖(D′=1,r2=1)(圖5A),后續(xù)使用rs73399071位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析;存在6種單倍型,其中GTCCC是主要單倍型,比例為0.257,其次是GTCTT和GTCTC,比例分別是0.202和0.199(圖5B)。

A.SNPs連鎖不平衡分析;B.單倍型模塊分析。顏色越深表示D′越高,數(shù)字表示R2A. SNPs linkage disequilibrium analysis; B. Haplotype module analysis. Darker colors indicate higher D′, numbers indicate R2圖5 雞FGF6基因5個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡分析Fig.5 Linkage disequilibrium analysis of 5 loci of chicken FGF6 gene

2.8 單倍型分析

由表4可知,雞FGF6基因5個(gè)處于哈代-溫伯格平衡的SNPs位點(diǎn)共存在28種單倍型組合,其中以GCTTCCTCCC組合的頻率最高(0.134 9),GGTTCCTCCT組合的頻率(0.126 6)次之,GCTGTCTTCC、GCTTCCCCCC、GCTTCCTCCT、GG-GGTTTCCC、GGGGTTTTCC、GGTGTCTCCT和GGTTTTTCCC組合的頻率最低(0.001 4)。為避免因個(gè)體數(shù)太少引起的誤差,單倍型關(guān)聯(lián)分析時(shí)剔除個(gè)體數(shù)少于30的單倍型組合。

表4 單倍型組合及其頻率Table 4 Haplotype combinations and their frequencies

2.9 rs73399071位點(diǎn)與F2資源群生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

LD分析結(jié)果顯示5個(gè)位點(diǎn)之間強(qiáng)連鎖,且屬于Block1中,因此僅對(duì)rs73399071位點(diǎn)的不同基因型與F2資源群體相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。如表5～8所示,rs73399071位點(diǎn)與雞0周齡脛長(zhǎng)、2周齡體重、4周齡體重、脛圍、胸骨長(zhǎng)、體斜長(zhǎng)、骨盆寬、6周齡體重、8周齡體重、胸寬、胸骨長(zhǎng)、胸角、10周齡體重和12周齡體重在內(nèi)的17個(gè)性狀顯著相關(guān)(P<0.05);且大部分CC突變基因型個(gè)體的表型均值普遍高于野生基因型GG(表5)。與其他生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。

表5 雞FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)rs73399071與F2資源群生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of genetic variant locus (rs73399071) of chicken FGF6 gene with growth traits in F2 resource population

2.10 rs73399071位點(diǎn)與F2資源群屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析

rs73399071位點(diǎn)與雞胸肌重、腿重、腿肌重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、肝臟率、腿肌重率、半凈膛率和全凈膛率10個(gè)屠體性狀顯著相關(guān)(P<0.05)。除腿肌重率外,該位點(diǎn)與其他9個(gè)表型性狀極顯著相關(guān)(P<0.01)。且突變基因型CC型個(gè)體表型均值普遍顯著高于GG基因型(表6)。與其他屠體性狀關(guān)聯(lián)不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。

表6 雞FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)(rs73399071)與F2資源群屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of genetic variant locus (rs73399071) of chicken FGF6 gene with carcass traits of F2 resource population

2.11 rs73399071位點(diǎn)與F2資源群肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

rs73399071位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,如表7所示,該位點(diǎn)與腿肌剪切力、胸肌剪切力、胸肌失水率和腿肌失水率的關(guān)聯(lián)均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

表7 雞FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)(rs73399071)與F2資源群肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 7 Association analysis of genetic variant locus (rs73399071) of chicken FGF6 gene with meat quality traits in F2 resource population

2.12 rs73399071位點(diǎn)與F2資源群血清生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

rs73399071位點(diǎn)與F2資源群血清生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)結(jié)果分析如表8所示,該位點(diǎn)與膽堿酯酶和高密度脂蛋白顯著相關(guān)(P<0.05),其中GG基因型和CC基因型普遍高于GC基因型。與其他血清生化指標(biāo)關(guān)聯(lián)不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。

表8 雞FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)(rs73399071)與F2資源群血清生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析Table 8 Association analysis of genetic variant locus (rs73399071) of chicken FGF6 gene with serum biochemical indexs of F2 resource population

2.13 不同單倍型組合與雞生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

不同單倍型組合與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表9和表10所示,CCTTCCTTCC單倍型組合個(gè)體的4周體重、胸骨長(zhǎng),6周體重,8周體重、脛圍,10周體重和12周體重、胸寬均最高,4周脛圍、8周胸寬和胸骨長(zhǎng)以GGTTCCCCCC組合最高,4周體斜長(zhǎng)以GCTTCCTTCT組合最高;與其他體重性狀關(guān)聯(lián)不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。

表9 SNPs位點(diǎn)單倍型組合與雞不同階段體重的關(guān)聯(lián)分析Table 9 Association analysis of haplotype combinations at SNPs loci and chicken body weight at different stages

表10 SNPs位點(diǎn)單倍型組合與雞不同階段體尺的關(guān)聯(lián)分析Table 10 Association analysis of haplotype combinations at SNPs loci and chicken body size at different stages

3 討 論

本研究對(duì)不同物種FGF6基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果顯示,雞與火雞的同源性達(dá)91%以上,與非洲爪蟾同源性較低,表明FGF6基因在鳥類中的保守性較高。同源性在一定程度上反映親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示雞FGF6與火雞親緣關(guān)系較近,與爬行類(綠海龜)和兩棲類(熱帶爪蟾)次之,與魚類(斑馬魚)最遠(yuǎn)。由于雞FGF6基因能夠與其他脊椎動(dòng)物聚集在一起,說(shuō)明這些物種的FGF6基因可能由同一祖先進(jìn)化而來(lái)。同時(shí)經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),雞FGF6與其他6個(gè)物種存在相同的5個(gè)motif基序,推測(cè)其可能是在雞FGF6執(zhí)行主要生理功能的蛋白片段。通過(guò)分析其疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)得知雞FGF6蛋白表現(xiàn)為親水性蛋白,存在跨膜區(qū)。雞FGF6蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)(二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu))主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋組成。

蛋白質(zhì)磷酸化是一種廣泛的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs)方式,也是一種最有效的調(diào)控途徑,是由蛋白質(zhì)激酶催化的磷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng),在調(diào)控細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)和影響肉品質(zhì)變化等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19-21]。雞FGF6蛋白存在12個(gè)絲氨酸、5個(gè)蘇氨酸和5個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),這些磷酸化位點(diǎn)對(duì)于FGF6的轉(zhuǎn)運(yùn)、接收和表達(dá)可能具有重要意義。雞FGF6蛋白有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。糖基化也是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,能夠通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)的電荷態(tài)、結(jié)構(gòu)及分子間相互作用影響其功能[22],參與細(xì)胞免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞壁的合成、蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控和蛋白降解等生物過(guò)程[23-24]。通過(guò)蛋白互作分析發(fā)現(xiàn),雞FGF6蛋白與FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族蛋白均有互作關(guān)系,有研究表明FGF成員的生物學(xué)活性是通過(guò)與FGFR1～4受體結(jié)合,啟動(dòng)MAPK(有絲分裂原激活的蛋白激酶)信號(hào)通路,從而刺激纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂增殖[25],這也說(shuō)明雞FGF6蛋白與其受體存在互作,具有一定的研究?jī)r(jià)值。

相關(guān)研究表明,FGF6基因會(huì)對(duì)骨骼肌發(fā)育、修復(fù)再生等方面產(chǎn)生一定影響[26-28]。FGF6基因多次被鑒定為影響經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因[29-31],但目前國(guó)內(nèi)外在雞FGF6基因多態(tài)性上未有相關(guān)研究報(bào)道。雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息量(PIC)常用來(lái)衡量一個(gè)群體的遺傳變異程度,其數(shù)值越大,表明試驗(yàn)群體遺傳變異度越高,遺傳豐富度越高[32]。本研究對(duì)雞FGF6基因遺傳特性分析發(fā)現(xiàn),6個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于高等多態(tài)性、5個(gè)SNPs處于Hardy-Weinberg平衡。可能是本試驗(yàn)中所用群體處于閉鎖的生長(zhǎng)繁育環(huán)境,導(dǎo)致了這種動(dòng)態(tài)平衡。單位點(diǎn)分子標(biāo)記通常適用于大規(guī)模群體的遺傳分析,如種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)估、品種鑒定和遺傳改良中的輔助選擇[33-34]。本研究通過(guò)對(duì)雞FGF6基因多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)rs73399071位點(diǎn)(G>C)與F2資源群不同階段的體重、脛長(zhǎng)、脛圍、體斜長(zhǎng)等17個(gè)生長(zhǎng)性狀表型指標(biāo)顯著相關(guān)(P<0.05),與全凈膛重、半凈膛重、屠體重等10個(gè)屠體性狀表型指標(biāo)顯著相關(guān)(P<0.05),但與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)未達(dá)到顯著水平(P>0.05),總體來(lái)看,CC基因型(突變型)普遍優(yōu)于GG基因型(野生型),故在生產(chǎn)實(shí)踐上rs73399071位點(diǎn)可以作為雞生長(zhǎng)性狀和屠體性狀的候選分子標(biāo)記,選留CC基因型個(gè)體用于輔助育種,提高經(jīng)濟(jì)效益。

在之前的研究中,一般認(rèn)為基因突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域不會(huì)直接改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列,故不會(huì)對(duì)其生物學(xué)特性產(chǎn)生影響[35]。但隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子可能潛在地影響剪切、mRNA加工、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控等各種細(xì)胞過(guò)程,內(nèi)含子的變異可能導(dǎo)致剪切準(zhǔn)確性或效率的變化,從而導(dǎo)致氨基酸編碼的變化,最終改變真核生物的表型[36-38],如緊密蛋白2(TJP2)基因內(nèi)含子突變(9q21.11位點(diǎn))通過(guò)改變TJP2基因的表達(dá)和促進(jìn)經(jīng)表皮水分流失而賦予特應(yīng)性皮炎(AD)易感性[39]。本研究在FGF6基因上共篩選到6個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域的SNPs(rs73399071、rs73399075、rs73399124、rs73399207、rs73399282、rs73399353),其中rs73399071突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)表型關(guān)聯(lián)顯著,該位點(diǎn)是否對(duì)FGF6基因的表達(dá)產(chǎn)生影響,以及如何調(diào)控基因來(lái)影響動(dòng)物表型后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

動(dòng)物的表型受單個(gè)突變位點(diǎn)和多個(gè)突變位點(diǎn)組合效應(yīng)的影響,其后者影響較為重大[40]。因?yàn)樵谘芯窟z傳變異對(duì)表型的影響時(shí),單個(gè)SNP分析作用較小,單倍型分析可以提供更豐富的信息[41-43]。單倍型組合分析通常適用于復(fù)雜性狀的遺傳研究,例如復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)分析和數(shù)量性狀的QTL定位[44]。本研究發(fā)現(xiàn),FGF6基因的CCTTCCTTCC單倍型組合個(gè)體的BW4、BW6和BW10均高于其他9種單倍型組合;GGTTCCCCCC單倍型組合個(gè)體的SG4、CW8和BBL8高于其他9種單倍型組合,而其SG8和CW12低于CCTTCCTTCC單倍型組合;GCTTCCTTCT單倍型組合的BBL4和BSL4高于其他組合;GGTGTCTTCC單倍型組合的BA12高于其他單倍型。不同單倍型組合對(duì)不同階段體重和體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)效果不同?？紤]到該研究的樣本量,有些單倍型個(gè)體數(shù)較少,產(chǎn)生的試驗(yàn)結(jié)果具有一定的誤差,后續(xù)還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)驗(yàn)證和探討。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),雞FGF6氨基酸序列與火雞親緣關(guān)系最近,與斑馬魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn);不同物種間保守性較高且其與FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、EGF共5個(gè)蛋白可能存在相互作用。雞FGF6基因內(nèi)含子6個(gè)遺傳變異位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)性(PIC≥0.5),且存在強(qiáng)連鎖,GTCCC是主要單倍型;FGF6基因遺傳變異位點(diǎn)rs73399071與固始雞-安卡雞F2資源群的生長(zhǎng)性狀、屠體性狀和血清生化指標(biāo)顯著相關(guān),且CCTTCCTTCC單倍型組合個(gè)體具有較高的體重。相關(guān)結(jié)果顯示,rs73399071位點(diǎn)可以作為改良雞生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記用于輔助選擇,表明FGF6基因可能在雞生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。本研究為進(jìn)一步深入研究FGF6基因在雞上的生物學(xué)功能提供重要的參考。