拉氏鱥脊椎骨中TGF-β超家族部分基因的溫度表達模式研究

孫銘雪，鄭 晗，甘 星，韋奇志，馬徐發，謝 鵬

(華中農業大學水產學院，武漢 430070)

拉氏鱥(Phoxinuslagowskii)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cypriniformes)雅羅魚亞科(Cypriniformes)鱥屬(Phoxinus)，在中國主要分布于黑龍江、遼河、黃河及長江中上游的支流[1]。該魚在我國北方屬小型經濟魚類，喜棲息于低溫清澈且溶氧較高的水體中；其肉質細嫩、味道鮮美，營養價值較高。近年來我國北方地區加強對拉氏鱥增養殖技術的研究和推廣，取得了較好的經濟效益。有關拉氏鱥的研究多集中于人工繁殖和生態學方面。張永泉等[2]采集黑龍江流域野生拉氏鱥進行馴養，篩選優質親魚催產，制備受精卵進行人工孵化，完成了拉氏鱥的人工繁殖研究。莊雪等[3]利用D-loop分析遼寧省11個水庫中拉氏鱥種群的遺傳多樣性和適應性變異，結果表明水庫隔離的繁殖對種群的發展有一定的影響。謝鵬[4]基于比較轉錄組對我國鱥屬魚類在溫度適應方面進行了研究，結果顯示拉氏鱥在進化上與適應低緯度水域生活環境的相關基因表現出快速進化或正向選擇。然而有關溫度等環境因子對拉氏鱥生長發育影響的研究卻鮮有報道。

魚類作為生活在水中的變溫動物，溫度是影響魚類生長、發育、繁殖等活動的重要環境因子之一。溫度升高能夠促進生物體內的代謝活動，但超過一定的范圍則會抑制其生長，甚至造成生物體死亡[5]。有研究表明，在一定范圍內適當升高溫度，可以提高多種魚的生長性能，例如草魚(Ctenopharyngodonidella)[6]、駝背鱸(Cromileptesaltivelis)[5]、美洲黑石斑(Centropristisstriata)等。目前，利用基因芯片技術研究發現溫度變化可以引起鯉(Cyprinuscarpio)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]等大量基因的表達發生改變。研究溫度對拉氏鱥生長相關基因的影響可以為探索該魚高溫適應提供理論依據，進而可通過遺傳選育培育新品種，突破養殖區域限制。

魚類的生長主要是由下丘腦-垂體-肝臟生長軸調控的[9]，轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族是調控GH-IGF生長軸的重要基因家族，TGF-β超家族主要分為骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins，Bmp)和TGF-β兩個亞家族。Bmp亞家族包括BMPs、部分GDFs等[10]，在動物的骨骼生長和器官發育過程中具有著重要作用，通過對骨髓間充質干細胞和小鼠卵巢切除模型的研究中發現，當bmp4傳導活化被抑制后，小鼠會出現明顯的骨質疏松現象，說明bmp4可以促進骨組織再生[11]。gdf8是肌肉生長負調控因子，MCPHERRON等[12]研究發現gdf8缺失的小鼠會出現肌纖維增長和肌肉肥大的現象。Smad是TGF-β家族重要的信號轉導蛋白，smad4和smad7是TGF-β1/Smad信號傳導通路中的關鍵信號分子[13]。Sox基因家族在脊椎動物早期發育過程中起著重要作用[14]，生長分化因子5誘導兔骨髓間充質干細胞后檢測到sox9顯著表達，表明sox9與軟骨發育密切相關[15]。

脊椎骨作為多數硬骨魚類支撐體軸最重要的組織，其形態發育和生長直接關系到魚類軀體的生長。同時，在魚類個體生物學研究中，脊椎骨又是良好的年齡鑒定材料，可用于魚類生長特性的分析。本實驗基于團隊拉氏鱥比較轉錄組的分析結果(暫未發表)，篩選出與骨形態發育和生長相關的差異表達基因bmp2b、bmp4、bmp7a、smad4、smad7、sox9a和gdf8，擬探究不同溫度飼養條件下，拉氏鱥脊椎骨中這些基因的表達差異，旨在為拉氏鱥等非模式魚類響應溫度變化的生長機制研究提供數據支撐，以及為其溫度馴化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用拉氏鱥采集于長江水系(宜昌市，興山縣)，體長(6.1±0.6)cm，體質量(2.6±0.7)g。樣本采集后置于實驗室水族箱恒溫循環流水養殖系統馴養14 d使其適應室內環境。養殖水溫保持在(23.0±0.5) ℃，水體溶解氧5.0 mg/L以上，pH 7.0～7.2。采用紅蟲投喂。

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度實驗

隨機挑選大小相近、健康無病的拉氏鱥120尾作為實驗用魚。實驗設計15、20、25、30 ℃，每組設置三個平行組，每個平行組10尾魚，實驗在室內12個規格為60 L的聚乙烯塑料桶中進行。水溫通過空調與電子加熱棒調控，室內環境保持陰暗，每天換水20 L(備用曝氣水與各組水溫保持一致)，投喂紅蟲，投飼率為5%，投喂15 min后進行吸底。養殖28 d后從各平行組選規格相近的3尾拉氏鱥取脊椎骨樣品進行混樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中用于分子生物學實驗。

1.2.2 總RNA提取

將凍存的脊椎骨樣品取出后按照Trizol法抽提總RNA，采用紫外分光光度計NanoDrop 2000(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)測定所提總RNA的濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.2.3 引物設計

使用Premier5.0軟件設計實時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，各引物由北京擎科新業生物技術有限公司武漢分公司合成，實驗室稀釋至10 μmol/L保存備用。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR

表2 不同溫度飼養28 d后各組體長和體質量的變化Tab.2 Effects of different temperatures on growth of P.lagowskii

1.2.4 反轉錄及熒光定量PCR

參照TAKARA公司反轉錄試劑盒操作步驟對總RNA進行反轉錄,-20 ℃保存備用。按照一步快速反轉錄試劑盒進行反轉錄反應,反轉錄體系20 μL:總RNA 6 μL,4×AccuRT Reaction Mix 2 μL,室溫放置5 min,AccuRT Reaction Stopper 2 μL,5×All-In-One RT Master Mix 4 μL,Nuclease-free water 6 μL。輕輕混勻,25 ℃靜置10 min,42 ℃孵育15 min,85 ℃滅活5 min,反應結束后-20 ℃保存。

采用QuantStudioTM6Flex熒光定量PCR系統(Applied Biosystems，ABI，USA)，cDNA使用設計的引物進行qRT-PCR擴增，反應體系為20 μL：10 μL SYB Green Master Mix，0.4 μL Rox referene Dye II，0.8 μL Primer-F/R，6 μL ddH2O，2 μL cDNA。擴增程序為：①95 ℃預變性10 min；②擴增反應：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40輪循環；③熔解反應：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。每個樣品三個重復。

1.3 統計分析

熒光定量反應結束后，根據儀器導出的擴增曲線的Ct值，選擇β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量。數據以平均值±標準誤表示，用SPSS 26.0軟件作單因素方差分析(One-Way ANOVA)，GraphPad 9.0.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度組拉氏鱥生長的變化

實驗結果表明，拉氏鱥的平均體長在4個溫度下沒有發生顯著性變化，各組間體長增長范圍為1.25～1.83 mm，增長的平均值為1.63 mm。體質量在25 ℃和30 ℃組中顯著高于15 ℃和20 ℃組，15 ℃組和20 ℃組的平均體質量分別減少了0.12 g和0.09 g，而25 ℃組和30 ℃組分別增重了0.32 g和0.44 g。

2.2 總RNA檢測

經紫外分光光度計檢測，所有總RNA樣品的A260 nm/280 nm均在1.8～2.0之間。隨機挑選4份樣品進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，可見有明顯的3條帶，28 S和18 S條帶清晰，5 S條帶較弱，表明提取的總RNA質量均較好(圖1)。

圖1 拉氏鱥脊椎骨總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoresis of P.lagowskii

2.3 各引物qPCR熔解曲線

各對引物的熔解曲線如圖2所示，曲線均顯示出單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性引物，說明引物特異性良好，符合qPCR要求。

圖2 bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4、smad7、gdf8、sox9a和內參基因β-actin的熔解曲線Fig.2 Melting curves of bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4、smad7、gdf8、sox9a，and β-actin

2.4 拉氏鱥脊椎骨中相關基因相對表達量的變化

不同溫度條件下拉氏鱥bmp4、bmp2b、bmp7a基因在脊椎骨中的相對表達量如圖3所示。以15 ℃養殖組作為對照組，bmp4基因相對表達量在15 ℃和20 ℃組中沒有顯著差異，溫度上升到25 ℃時的表達量顯著升高，溫度升高至30 ℃，表達量顯著降低；bmp2b在25 ℃和30 ℃組顯著低于15 ℃和20 ℃組的表達量；bmp7a基因的表達量在15 ℃和20 ℃組無明顯差異，而25 ℃和30 ℃的表達量顯著高于15 ℃和20 ℃組。

圖3 拉氏鱥脊椎骨Bmps mRNA在不同溫度下的相對表達量Fig.3 Relative expression of Bmps mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

作為介導TGF-β家族成員信號轉導的關鍵性蛋白家族，本研究中拉氏鱥smad4和smad7基因在不同溫度下的相對表達量變化較為明顯(圖4)。兩基因的相對表達量均在25 ℃組顯著高于其余3個溫度組，且為顯著的先上升后下降的趨勢。

圖4 拉氏鱥脊椎骨Smads mRNA在不同溫度下的相對表達量Fig.4 Relative expression of Smads mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

如圖5所示，gdf8基因的相對表達量隨著溫度升高呈出明顯的上升趨勢，在30 ℃組的表達量達到峰值且顯著高于其他三個溫度組。sox9a的表達量在15 ℃和20 ℃組間無明顯差異，溫度升至25 ℃，表達量顯著升高，當溫度達到30 ℃時，表達量明顯下降。

圖5 拉氏鱥脊椎骨gdf8和sox9a mRNA在不同溫度下的相對表達量Fig.5 Relative expression of gdf8 and sox9a mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

3 討論

魚類的生長發育過程與溫度、光照、溶氧等環境因子有著密切的關系，其中溫度是最重要的影響因子[16]。適宜的溫度是魚類保持正常生長速度、維持正常生理狀態的必要條件，也是獲得最大經濟效益的保障。溫度過高或過低都會影響魚類的生長狀態[17]。本實驗中，拉氏鱥在15、20、25 ℃和30 ℃四個溫度組飼養前后的體長沒有顯著變化且無組間差異；而體質量在15 ℃和20 ℃組中無顯著差異，25 ℃組和30 ℃組的體質量顯著高于前兩組，但后兩組間的體質量無顯著差異。脊椎骨中bmp4、bmp7a、smad4、smad7和sox9a基因的相對表達量在25 ℃時達到最大值，平均體質量也顯著升高，說明拉氏鱥生長的適宜溫度應該在25 ℃左右；各基因表達量在30 ℃時大部分顯著降低，且體質量相對于25 ℃未顯著增加，推測30 ℃可能已接近拉氏鱥適宜生長溫度的上限，其攝食和生長相關的代謝活動開始減弱。

轉化生長因子β(TGF-β)是一類龐大的調控動物肌肉生長發育的超家族，該家族中的多個基因已被證實與肌肉發育有直接或間接的關系[18]。其成員骨形態發生蛋白(Bmps)是一種多功能細胞因子，促進骨細胞增殖分化，誘導軟骨和骨形成[19]，在脊椎動物的生長中起重要作用。在本研究中，3種骨形態發生蛋白基因的表達量與體重的組間差異大致相同。

bmp4由成骨細胞分泌，通過刺激成骨細胞分化和軟骨細胞分化誘導骨和軟骨形成[20]。本實驗中，溫度從20 ℃升至25 ℃，拉氏鱥的bmp4基因的表達量顯著升高。韓明洋等[21]探究了卵形鯧鰺仔魚頭部和脊柱軟骨組織中與骨骼發育相關基因在不同溫度下的表達差異，結果表明，溫度升高，bmp4的表達增強。YTTEBORG等[22]對大西洋鮭的研究結果同樣表明bmp4的表達會隨著水溫的升高而增強。本實驗研究結果與其大致相似，但過高的溫度會抑制拉氏鱥bmp4的表達。bmp2被認為是活性最強且是唯一能單獨誘導成骨的因子，bmp2b作為bmp2基因的亞型，在有機體內行使著與bmp2基因同樣的分子功能。bmp2b基因的表達量在溫度升高至25 ℃時顯著降低。NISHIMURA等[23]的研究結果表明，smad6的過表達可抑制bmp2的成骨作用。smad6和smad7都屬于抑制型蛋白，推測本實驗的smad7基因在溫度較高的養殖組中的相對高表達可能同樣抑制了bmp2的成骨作用，因而bmp2b基因的表達量下降。在一些硬骨魚中，例如斑馬魚[24]，bmp7分化為bmp7a和bmp7b兩個亞型，bmp7a參與早期背腹軸分化，在胚胎背腹軸發育過程中發揮重要作用[25]。SETOGUCHI等[26]發現脊椎損傷后bmp7基因的mRNA表達顯著上調，推測bmp7在脊椎損傷早期發揮保護作用。本研究中，bmp7a基因表達量隨著溫度升高呈上升趨勢，且在溫度從20 ℃升到25 ℃時，表達量顯著升高。這可能預示著在20～25 ℃這個區間內，溫度上升，對拉氏鱥的發育有一定的促進作用，從而為軀體生長的提速打下基礎。

Smads是TGF-β超家族的信號傳導至細胞核的重要基因家族[27]，smad4在TGF-β信號轉導的過程中起關鍵作用[28]。本研究中，smad4基因在不同溫度下的變化趨勢與bmp4的大致相同。隨著溫度從15 ℃上升到25 ℃，bmp4的成骨作用增強，smad4的信號轉導作用增強；溫度達到30 ℃時，smad6競爭結合smad4，負反饋作用增強，smad4的表達量顯著下降。smad7被稱為“軟骨抑制因子”，可破壞軟骨發育進程以及損壞軟骨細胞[29]。smad7作為bmp2下游的重要軟骨抑制因子，在bmp2誘導下表達明顯升高。

gdf8在生物體內對于維持成肌細胞的增殖和分化的穩態有著十分重要的作用，通過負向調節肌肉生長參與機體的生長發育過程[30]。本研究中該基因在20 ℃和25 ℃組間無顯著差異，且顯著低于30 ℃組。這可能暗示著在20～25 ℃的溫度范圍內，拉氏鱥脊椎骨中包含gdf8在內的多個基因參與的調控下，成肌細胞的增殖和分化處于良好穩態，有利于生長發育，該結果與葉恒振[31]研究布氏鯧鲹肌肉中gdf8表達量的結果相似。sox9a在軟骨和骨骼的形態發生和分化中發揮作用[32]。韓明洋等[33]的研究結果為26 ℃下sox9a的表達量顯著高于29 ℃和32 ℃。本實驗中sox9a在25 ℃組的表達量顯著高于其它三組，與其結果高度吻合。這說明25 ℃的飼養水溫對拉氏鱥脊椎骨中sox9a基因的表達有促進作用，從而調節其軟骨細胞分化，促進拉氏鱥的生長。

4 小結

本研究結果表明，不同飼養溫度對拉氏鱥脊椎骨中bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4和smad7、gdf8和sox9a基因的mRNA相對表達量有顯著影響。通過單因素方差分析，拉氏鱥脊椎骨中與生長相關的7個基因的相對表達量結果顯示，拉氏鱥在20～25 ℃之間脊椎骨中骨形態發生蛋白和GH-IGF生長軸的基因相對表達量較高，而且溫度20 ℃躍升至25 ℃時體質量顯著增加，推測在這個溫度范圍內拉氏鱥骨骼發育和生長相關的代謝通路和生物學過程更為活躍。

本研究更多的還是側重于這些基因所具有的分子功能，而對其對應的細胞組分以及所參與的生物學過程未能進行深入的探討。在未來研究中，可圍繞bmp4、bmp7a和smad4等基因，進一步挖掘其參與的代謝通路，以及介入的蛋白互作網絡，力爭更加系統地解析這些基因參與拉氏鱥等小型魚類生長發育，特別是骨骼發育的調控機制。