17β-HSD14基因在魁蚶性腺發育過程中的表達特征

王文靜，吳 彪，劉志鴻，孫秀俊，周麗青，徐萬棟

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；3.山東省東營市墾利區行政審批服務局，山東墾利 257500)

水生動物性腺發育受內因和外因共同調控，其中內因是相關的遺傳物質，而外因則包括溫度、鹽度、pH、光照周期等環境因子[1]。近年來，對脊椎動物體內性類固醇激素合成相關基因的研究報道較多，而在貝類中研究較少[2]。性類固醇激素是性別決定、分化和性腺發育的關鍵物質，能夠誘導水生動物性逆轉[3，4]，也可以影響性腺發育[5]。起初，許多學者認為性類固醇激素只存在于脊椎動物中，然而越來越多的證據表明性類固醇激素也存在于無脊椎動物體內[6，7]。性類固醇激素在蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、海灣扇貝(Argopectenirradians)、長牡蠣(Crassostreagigas)和近江牡蠣(C.ariakensis)性腺中的測定均已有報道，結果表明貝類性腺中性類固醇激素的含量隨生殖周期的變化產生季節性變化[8-12]。性類固醇激素的合成以膽固醇作為前體，由一系列類固醇合成酶催化調控，主要包括細胞色素P450基因家族(Cytochrome P450s，CYP)和羥類固醇脫氧酶家族(Hydroxysteroid dehydrogenases，HSD)的成員，以及其他類固醇氧化還原酶[13]。在脊椎動物中，類固醇合成酶及其通路都已經有較為深入的研究，膽固醇在類固醇激素合成急性調節蛋白StAR(steroidogenic acute regulatory protein)的作用下從細胞質轉運至線粒體內膜上，然后由細胞色素側鏈裂解酶CYP11催化產生孕烯醇酮，孕烯醇酮回到細胞質后，再由CYP17、CYP19、3β-HSD和17β-HSD等基因編碼的類固醇合成酶催化形成相應的性類固醇激素[14]。已有研究表明，軟體動物的主要種類，如頭足類、腹足類和雙殼類等，能夠利用膽固醇或孕烯醇酮等前體物質合成性類固醇激素[15]。但在貝類中性類固醇激素合成機制的研究相對較為匱乏，其中性類固醇激素合成通路中的關鍵基因也有待進一步研究。

17β-羥類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)是一類以NAD(P)(H)作為輔酶的氧化還原酶，是性類固醇激素合成過程中的催化酶，因其作用于類固醇的第17位碳而得名[16]。目前在哺乳動物中，已發現該家族的15種亞型，并根據發現順序依次命名[17]。17β-HSD能夠氧化17β-羥基類固醇，或還原17-酮類固醇，從而實現性類固醇激素活性的調節，如催化雄烯二醇和睪酮、雌二醇和雌酮、雙氫睪酮和3α-雄烷二醇等之間的相互轉化，對于維持生物體內性類固醇激素的合成與代謝發揮重要作用[18]。在水產動物中，許多17β-HSD基因已被發現，在牙鲆(Paralichthysolivaceus)中篩選克隆了10個17β-HSD基因，其中3個基因(17β-HSD10、17β-HSD12a和17β-HSD12b)在卵巢中表達量較高，1個基因(17β-HSD9)在精巢中表達量較高，說明牙鲆17β-HSD基因家族可能與性腺發育過程中雌雄激素的合成有關[19]。櫛孔扇貝中已發現了17β-HSD4、17β-HSD8和17β-HSD14，這3個17β-HSD基因在性腺中的表達量都具有性別二態性，可能參與了性腺的發育與成熟、雌二醇的含量調節等過程[20]。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)中17β-HSD11基因在性腺中的表達量具有性別二態性，注射雌二醇干擾后，17β-HSD11基因在精卵巢中的表達量降低[21]。17β-HSD14基因作為17β-HSD基因家族成員，可能參與性腺發育和雌二醇含量調節，是性類固醇激素合成通路中的基因之一。

魁蚶(Scapharcabroughtonii)是我國黃渤海區重要的大型底棲貝類，也是我國北方重要的經濟養殖物種[22]?？佬韵俦桓愀采w，不解剖情況下肉眼不可見，給準確判斷性腺發育狀態帶來困難，這是人工育苗工作中的一個難題。掌握魁蚶性腺發育與性類固醇激素相關基因的相關性，能夠為順利開展人工親貝選擇和苗種繁育提供支撐。本研究篩選并驗證了魁蚶17β-HSD14基因序列，進行了生物信息學分析，并利用原位雜交、熒光定量PCR技術檢測了該基因在魁蚶性腺中的時空表達規律，為了解17β-HSD14在魁蚶性腺發育中的作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魁蚶采自山東省青島海域野生群體，選取殼長為70 mm左右的健康個體運回實驗室置于過濾海水中暫養1周，每天投喂小球藻2次、換水1次，每次換水量50%，水溫18 ℃左右，鹽度30，海水pH 8.0?？佬韵俳M織取樣后，通過組織學方法將魁蚶性腺發育階段劃分為5個時期，即形成期(Ⅰ期)、增殖期(Ⅱ期)、成熟期(Ⅲ期)、排放期(Ⅳ期)和耗盡期(Ⅴ期)。同時取成熟期精巢、卵巢、鰓、斧足、外套膜、閉殼肌和肝胰腺7種組織，置于原位雜交固定液(Servicebio，中國)中固定24 h，用于原位雜交實驗。

1.2 RNA提取與反轉錄

在魁蚶性腺發育的5個時期中，各選3個精巢和卵巢樣品進行RNA提取，RNA的提取采用Trizol法，提取的RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美國)檢測純度和濃度，并且OD260 nm/ OD280 nm的比值范圍應在1.8～2.2，將鑒定合格的樣品稀釋到1 000 ng/μL。使用Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒(Accurate，中國)將魁蚶RNA逆轉錄為cDNA，保存于-20 ℃備用。

1.3 核心片段驗證

從實驗室前期轉錄組測序結果中獲得魁蚶轉錄組文庫中17β-HSD14基因cDNA片段，使用Primer 3.0(http：//www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設計特異性引物進行片段驗證，引物見表1。采用2×Tap Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)(Vazyme，中國)擴增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction(TaKaRa，中國)試劑盒進行切膠回收。使用5 min TA/Blunt-Zero Cloning試劑盒(Vazyme，中國)將純化后的目的片段連接到載體上，轉化至DH5α化學感受態細胞(Vazyme，中國)中，在含Amp的LB平板上過夜培養后挑選陽性菌落送北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 實驗所用引物序列

1.4 基因序列及進化分析

對測序得到的17β-HSD14基因序列進行分析，使用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/orffinder/)進行開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)區預測，SignaIP-5.0 Server(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)預測信號肽，TMHMM 2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白質的跨膜結構域，SMART(http：//smart.emblhe idelberg.de/ smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)預測基因結構和功能域。利用ExPASY(https：//web.expasy.org/protparam/)在線網站預測蛋白理化性質，Swiss-model(https：//www.swissmodel.expasy.org/)網站進行蛋白質三級結構預測，Cell-PLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)網站預測亞細胞定位，使用BLAST進行堿基序列同源性比對分析和相似蛋白質序列搜索，使用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對，用MEGA 11.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統進化樹。

1.5 原位雜交

利用原位雜交分析17β-HSD14基因在魁蚶精巢(Ⅲ期)、卵巢(Ⅲ期)、鰓、斧足、外套膜、閉殼肌和肝胰腺中的定位。原位雜交探針由賽維爾公司設計，探針序列見表1。主要步驟如下：固定的組織經梯度酒精脫水、浸蠟、包埋、切片、撈片和烤片，依次將切片放入二甲苯15 min、二甲苯15 min、無水乙醇5 min、無水乙醇5 min，之后風干，DEPC水浸泡。組織切片于修復液中煮沸5 min，自然冷卻。根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K于37 ℃消化15 min。先用純水沖洗，后用PBS洗3次。滴加預雜交液，37 ℃孵育1 h。倒出預雜交液，滴加含探針雜交液，濃度500 nmol/L，恒溫箱42 ℃雜交過夜。洗去雜交液后，滴加含二標探針雜交液，稀釋比1∶400于42 ℃孵育3 h。滴加封閉血清正常兔血清，置于室溫30 min。倒去封閉液，滴加鼠抗地高辛標記堿性磷酸酶anti-DIG-AP，37 ℃孵育50 min，后PBS洗4次。滴加NBT顯色液，用顯微鏡觀察陽性顯色情況。后用純水沖洗，自然風干后，中性樹膠封片，得到的原位雜交的切片置于CIC顯微鏡(XSP-C204)下，進行圖像的采集與分析。

1.6 魁蚶性腺不同時期的表達分析

根據測序得到的編碼序列(Coding sequence，CDS)區序列設計17β-HSD14定量引物，qRT-PCR使用的引物見表1，以RL15基因[23]作為內參基因。使用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒(Vazyme，中國)將RNA反轉錄為cDNA，然后使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme，中國)在CFX 96(Bio-rad，美國)上進行qRT-PCR反應，反應體系為：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free H2O 8.2 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個qRT-PCR實驗進行3個重復，采用2-ΔΔCt法計算17β-HSD14基因的相對表達量，所有數據均在SPSS 22.0中采用單因素方差分析，定量數據以平均值±標準差(SD)表示，并將其進行統計學分析的顯著性水平設為P<0.05。

2 結果

2.1 17β-HSD14基因序列及生物信息學分析

克隆獲得的17β-HSD14基因CDS序列長度為822 bp,編碼273個氨基酸。17β-HSD14蛋白無信號肽,不存在跨膜區域,推測其為一個胞內蛋白。17β-HSD14基因蛋白質的分子質量為29.66 kDa,理論等電點為6.89,分子式為C1 306H2 065N361O403S12,脂溶系數為79.30,平均親水系數(GRAVY)為-0.331,不穩定系數為30.07<40.00,說明17β-HSD14基因編碼產物為親水性穩定蛋白。17β-HSD14在第2～262氨基酸序列中存在NADB結構域,且存在NAD(P)結合位點(TGXXXGXG)和催化活性位點(YXXXK)(圖1)。亞細胞定位顯示,17β-HSD14蛋白存在于細胞質和過氧化物酶體中。利用Swiss-model在線網站預測了三維結構,17β-HSD14蛋白序列與同源模板的相似性為51.54%,QMEAN為0.81,GMQE為0.82,結果說明該蛋白與模板蛋白的匹配度較高,該蛋白含有46.86% α-螺旋,14.65% β-折疊和38.45%無規則卷曲(圖2)。

圖1 17β-HSD14氨基酸的多序列比對Fig.1 Multiple comparisons of 17β-HSD14 amino acid紅色方框內為NAD(P)結合位點，藍色方框內為催化活性位點。

圖2 17β-HSD14蛋白質三級結構預測Fig.2 Prediction of tertiary structure of 17β-HSD14 protein

氨基酸序列比對發現，魁蚶的17β-HSD14與歐洲牡蠣(Ostreaedulis)的同源性最高，為77.82%；與長牡蠣、美洲牡蠣(C.virginica)、福建牡蠣(C.angulata)、加州貽貝(Mytiluscalifornianus)、厚殼貽貝(M.coruscus)、藍貽貝(M.edulis)、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和歐洲扇貝(Pectenmaximus)的同源性相近，都在75.85%～77.44%的范圍內；與硬殼蛤(Mercenariamercenaria)的同源性比較低，為69.49%(表2)(圖1)。與斑馬魚(Daniorerio)等魚類和非洲爪蟾(Xenopustropicalis)等兩棲動物的同源性較低，為57.93%～66.02%；與智人(Homosapiens)等哺乳動物的同源性最低，為50.78%～51.94%。系統進化樹如圖3所示，魁蚶17β-HSD14先與貽貝、牡蠣、扇貝和蛤等雙殼貝類聚為一支，然后再與魚類和兩棲動物聚在一起，進化關系最遠的是智人等哺乳動物。

圖3 不同物種17β-HSD14氨基酸序列系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 17β-HSD14 amino acid sequence in different species

表2 不同物種17β-HSD14氨基酸序列號與同源性Tab.2 17β-HSD14 amino acids sequences numbers and identity of different species

2.2 17β-HSD14基因mRNA在魁蚶7種組織中的細胞學定位

性腺原位雜交結果如圖4所示，在卵巢組織中，17β-HSD14基因陽性雜交信號主要位于卵細胞和濾泡細胞壁上；在卵細胞中，陽性雜交信號主要出現在細胞質中，與亞細胞定位預測結果質一致。精巢組織中的精原細胞和精子中也都檢測到了17β-HSD14基因的陽性雜交信號。17β-HSD14基因在其他組織的定位結果如圖5所示，魁蚶斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓的細胞質中均檢測到了該基因的陽性雜交信號。與陰性對照組相比，斧足組織中的陽性雜交信號主要位于外表皮、肌纖維和結締組織中(圖5 A1、A2)；外套膜上肌纖維中的陽性雜交信號較為明顯，而上皮層和結締組織中的陽性雜交信號則較弱(圖5 B1、B2)；在肝胰腺組織中，肝小管上的陽性雜交信號較為強烈(圖5 C1、C2)；閉殼肌中的陽性雜交信號主要位于其肌纖維中(圖5 D1、D2)；鰓組織中，在鰓絲表面上檢測到了17β-HSD14的陽性雜交信號(圖5 E1、E2)。

圖4 17β-HSD14在魁蚶性腺中的細胞學定位Fig.4 Cytological localization of 17β-HSD14 in gonad of S.broughtoniiA：卵巢；B：精巢；1：原位雜交結果圖；2：陰性對照圖；3：HE染色圖；MO：成熟卵子；FW：濾泡壁；SN：精原細胞；SP：精子；比例尺：100 μm。

圖5 17β-HSD14在魁蚶斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓中的細胞學定位Fig.5 Cytological localization of17β-HSD14 in foot，mantle，hepatopancreas，muscle and gill of S.broughtoniiA：斧足；B：外套膜；C：肝胰腺；D：閉殼肌 E：鰓；1：原位雜交結果圖；2：陰性對照圖；3：HE染色圖；OE：外表皮；Mf：肌纖維；Ct：結締組織；Ep：上皮層；Ht：肝小管；Gf：鰓絲；比例尺：100 μm。

2.3 17β-HSD14基因在不同發育時期的性腺中的表達分析

熒光定量檢測結果表明，17β-HSD14基因在5個發育時期的精卵巢組織中均有表達(圖6)。其中，Ⅱ期卵巢中17β-HSD14的表達量最高，顯著高于Ⅰ期，且極顯著高于其他3個時期，Ⅰ期和Ⅲ期的17β-HSD14表達量顯著高于Ⅳ期，極顯著高于Ⅴ期；Ⅱ期精巢中17β-HSD14的表達量也最高，顯著高于Ⅰ期和Ⅴ期。17β-HSD14的表達量從Ⅰ期到Ⅱ期的精卵巢發育過程中均呈上升趨勢，在Ⅱ期達到最高值，然后從Ⅱ期到Ⅴ期的發育過程中呈下降趨勢，并在Ⅴ期達到最低值。比較17β-HSD14在同一發育時期精巢和卵巢的表達差異發現，5個時期卵巢中17β-HSD14的表達量均高于精巢，且Ⅰ期和Ⅱ期差異達到極顯著水平，Ⅲ期顯著差異，而Ⅳ期和Ⅴ期無顯著差異。

圖6 17β-HSD14在魁蚶不同發育時期性腺中的相對表達量Fig.6 Relative expression of 17β-HSD14 in gonad during different developmental periods of S.broughtonii*表示同一時期精巢和卵巢間表達量存在顯著差異(P< 0.05)，**表示同一時期精巢和卵巢間表達量存在極顯著差異(P< 0.01)。圖中不同的小寫字母代表不同時期卵巢的表達量的差異，不同大寫字母代表不同時期精巢的表達量的差異。

3 討論

17β-HSD是性類固醇激素合成過程中的關鍵催化酶，17β-HSD14是17β-HSDs中一個新成員，最早從人視網膜cDNA文庫中分離得到[24]，它能催化雌二醇轉化為雌酮、5α-雄烷-3α，17β-二醇轉化為雄酮[25]。本實驗在魁蚶中克隆獲得的17β-HSD14基因CDS序列長度為822 bp，編碼273個氨基酸。17β-HSD14基因所編碼的氨基酸中存在17β-HSD的SDR家族典型結構特征NAD(P)結合位點(TGXXXGXG)和催化活性位點(YXXXK)[26]?？赖?7β-HSD14基因與歐洲牡蠣的同源性最高，與貽貝、牡蠣和扇貝較近，且與魚類、兩棲動物和哺乳動物的同源性也較高，說明17β-HSD14在進化過程中相對保守。

17β-HSD14基因的原位雜交發現在魁蚶卵巢、精巢、斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓中均檢測到了17β-HSD14基因的陽性雜交信號，表明17β-HSD14在魁蚶各個組織中均有表達，表明除參與性類固醇激素合成外17β-HSD14可能還參與機體的其他生理活動。17β-HSDs在其他物種中也存在無組織特異性的現象，如17β-HSD11在三角帆蚌各組織中均有表達[21]；17β-HSD基因在福建牡蠣所有組織中表達，且在內臟團中表達量較高，說明其可能參與了牡蠣的脂肪代謝過程[16]；牙鲆17β-HSD1在雌性個體的卵巢、鰓、腎、頭腎、脾、胃、腸組織和雄性個體的精巢中表達[27]；17β-HSD12在人體的肝臟和腎臟等脂質代謝相關器官中高度表達，在腦垂體、腎上腺和睪丸等內分泌相關器官中被檢測到，表明17β-HSD12可能參與脂質生物合成和類固醇代謝的調節[28]；以上結果表明17β-HSDs在貝類和脊椎動物中都具有廣泛的生物學功能。在魁蚶所有組織中，肝胰腺的肝小管上17β-HSD14的陽性雜交信號最強烈，表明17β-HSD14基因除參與性類固醇激素的合成外可能也參與魁蚶的脂肪酸代謝過程。

性類固醇激素廣泛存在于貝類中，其含量隨不同的生殖階段而變化，且存在性別二態性，在性別決定和性腺發育中起著重要作用。有研究表明，性類固醇激素可以加快性腺的發育并影響貝類的性別[29]。性類固醇激素在脊椎動物的性別分化、生長發育、生殖代謝等過程中發揮著重要的生理作用，類固醇合成酶及其通路都已經有較為深入的研究，但性類固醇激素參與貝類繁殖過程的分子機制仍不清晰。本研究中，精卵巢中17β-HSD14在Ⅱ期的相對表達量均為最高，在精卵巢發育過程中均呈先上升后下降趨勢。17β-HSD14的表達量在魁蚶精卵巢由增殖期到成熟期的過程中迅速降低，說明17β-HSD14基因可能在生殖細胞成熟和排放過程中發揮了重要作用。近江牡蠣性腺中睪酮和雌二醇的含量均在增殖期最高，且性類固醇激素的變化與生殖周期相關，提示睪酮和雌二醇可能參與了性腺發育過程的調節[12]。櫛孔扇貝精卵巢中的雌二醇和睪酮含量均隨生殖過程周期性地變化，表明性類固醇激素在櫛孔扇貝性別維持、性腺分化、配子發生和排放等過程中具有潛在的重要作用[20]。以上結果表明17β-HSD14作為性類固醇激素合成酶，可能通過影響性類固醇激素的合成而影響性腺發育?？?個時期卵巢中17β-HSD14的表達量均高于精巢，且卵巢中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期表達量顯著高于精巢，具有性別二態性。已有研究發現三角帆蚌中17β-HSD11基因在卵巢中的表達量極顯著高于精巢[21]，與本研究結果相似；海灣扇貝性腺發育過程中，雌二醇和孕酮的表達量在卵巢中均高于精巢，而睪酮在精巢中的表達量均高于卵巢，表現出性別二態性[10]。這提示17β-HSD14可能與雌二醇、孕酮的合成呈正相關關系。在近江牡蠣性腺中，雌二醇、孕酮在卵巢中含量較高，睪酮在精巢中含量較高，且17β-HSD14基因在卵巢中的表達量較高，與雌二醇、孕酮的含量正相關，可能是由于其對雌二醇轉化為雌酮的作用比睪酮到雄烯二酮的作用更為有效[12]?？?個時期卵巢中17β-HSD14的表達量均高于精巢，可能也是由于在卵巢中對雌二醇的調控比在精巢中對睪酮的調控作用更重要。

本研究鑒定了性類固醇合成相關基因17β-HSD14在魁蚶中的組織分布和性腺發育過程中的表達特征，表明17β-HSD14基因可能通過調節性類固醇激素的合成影響性腺發育。研究結果為魁蚶性腺發育相關研究提供了基礎資料，為科學管控魁蚶親貝育肥提供了支撐。