不同地區紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)養殖群體遺傳多樣性分析

程慧濤，戴遠棠，阮炘賀，李育森，李麗華，段旭琢，單金紅，賈弦澤，徐 斌，王 慶，2，趙會宏，2

(1.華南農業大學，廣州 510642；2.廣州南沙華農漁業研究院，廣州 511458；3.廣東海大集團股份有限公司，廣州 511434；4.廣東東源縣現代農業綜合服務中心，廣東河源 517500)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)屬擬鰲蝦科滑螯蝦屬[1]，原產于澳大利亞北部[2]，屬于熱帶淡水小龍蝦[3]，也被稱為澳洲淡水龍蝦，因其個體大，出肉率高，肉質鮮美，并且具有廣泛的環境忍耐力，在pH 5.8～8.2、溫度5～37 ℃、溶氧量不低于1.5 mg/L的水體中都能生存，這也使得紅螯螯蝦在水產養殖中具有很大的潛力[4-6]，是世界上最有價值的經濟淡水甲殼動物之一[7，8]。20世紀90年代紅螯螯蝦首次引進中國，目前主要在我國南方地區養殖[3]，市場歡迎度很高[9]。

物種的遺傳多樣性會因為近親繁殖和遺傳漂變而降低，使物種喪失環境適應能力和降低物種的抗病力，所以物種高水平的遺傳多樣性就顯得非常重要[10]。對不同地區的紅螯螯蝦養殖品種進行遺傳分析可為該物種的遺傳資源保護提供依據[3，11]?；蚪M中由1到6個堿基對長單元組成的串聯重復DNA序列被稱為微衛星[10]，具有中性、共顯性、高度的多態性和跨基因組的隨機分布等特性[12-14]。目前，微衛星標記已經被用來分析羊、蛇、蟹、蝦和魚等物種的遺傳分析[12，15-17]。

紅螯螯蝦作為十足目甲殼類動物，通常只會顯示出低水平的等位酶變異[9，18]，而對于一些表現出較低的等位酶變異的物種而言，核基因組中的微衛星位點已經被證明對于記錄類似物種的遺傳多樣性具有重要作用[19]。為了解不同地區養殖群體的遺傳多樣性，本研究基于本實驗室先前轉錄組結果，選取篩選了8個微衛星位點，對中國不同地區(廣東省湛江市、廣東省佛山市、廣東省惠州市、廣西自治區南寧市、浙江省湖州市)的5個紅螯螯蝦養殖群體進行遺傳多樣性分析，以期為后續紅螯螯蝦群體遺傳多樣性研究及相關育種工作提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用的紅螯螯蝦群體分別來自廣東省湛江市(GDZJ)、廣東省佛山市(GDFS)、廣東省惠州市(GDHZ)和廣西自治區南寧市(GXNN)，從當地養殖戶購買，浙江省湖州市(ZJHZ)購自于浙江水產研究所。每個群體30尾，。取背部適量的肌肉樣品共150份，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒(北京金沙生物技術有限公司)提取樣品DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，微量分光光度計測其濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 微衛星引物篩選

根據本實驗室開展紅螯螯蝦轉錄組測序得到SSR序列，使用Primer6.0軟件設計引物后進行PCR擴增。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，合成時正向引物F的5’端加上通用Tag的16個堿基的引物序列，第一次擴增DNA時片段就多帶一段Tag序列。第二輪篩選擴增條帶理想的PCR產物進行熒光引物PCR，所用引物是Tag修飾引物和各自對應的反向R引物。用Tag的修飾引物，帶Tag序列的F引物，R引物共3條引物可以一起多重擴增達到目的，最后擴增良好的熒光PCR產物用3730xl測序儀進行檢測，得到的數據進行Genemapper軟件分析，判斷不同引物是否具體片段多態性，最后獲得8對符合條件的引物(表1)。

表1 8對微衛星引物信息Tab.1 Information of eight pairs of microsatellite primers

1.2.3 PCR擴增

用合成的引物的不同引物進行擴增，以擎科金牌Mix(green)試劑盒進行擴增，擴增體系為20 μL：金牌Mix(green) 17 μL、10 μmol/L Primer F(加接頭)1 μL、10 μmol/L Primer R 1 μL、Template(gDNA)1 mL。PCR擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 10 s、各引物特異性退火溫度(表1)10 s、72 ℃ 10 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。最后擴增良好的熒光PCR產物用3730xl測序儀進行檢測，得到的數據使用Genemapper軟件分析。

1.2.4 數據分析

SSR位點和種群的各項遺傳多樣性指標分別在Popgen32[20]中計算，包括觀察到的等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農指數(I)、多態性信息指數(PIC)、哈迪溫伯格平衡(PHWE)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和等位基因豐富度(Ar)。用FSTAT[10]軟件計算近親繁殖系數(Fis)和遺傳分化指數(Fst)。本實驗的種群遺傳結構是基于STRUCTURE 2.3.3版軟件中的貝葉斯模型的種群聚類方法。采用馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法使用預先設定的種群分組(K)，同時根據等位基因頻率對個體進行計算、抽樣和分組。K值被設定為5，對每個K值進行10次獨立運行，每個周期的重復采樣次數被設定為100 000。最后，根據EVANNO等[21]的方法，在STRUCTURE HARVESTER網站上計算出最佳K值。

2 結果

2.1 微衛星位點多態性

由表2可知，8個微衛星位點Na數范圍在3～12，平均為8.125 0。Ne范圍為1.466 4～4.781 1。I的范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。多態信息含量的數值范圍為0.280 5～0.764 5，平均值0.590 1，8對引物PIC>0.25，具有較高的多態信息。綜上，本實驗所開發的8對SSR引物的多態性較高。

表2 8對微衛星引物的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters at ten microsatellite loci

5個群體在8個微衛星位點確定了237個Na(表3)，Na數范圍為2～10，平均為6.05。Ho和He平均值分別為0.490和0.614。每組的Na數在6.000(GXNN)～6.625(GDFS)。所有種群間觀察到的Ar數量無明顯差異，Ar平均值在2.788(ZJHZ)～3.205(GDZJ)。所有群體中平均He在0.593(GDHZ)～0.646(GDZJ)。綜上可以看出遺傳多樣性并未顯著降低。此外，養殖種群的近交系數(Fis)表明GXNN(0.263)、ZJHZ(0.264)這2個地區的養殖群體比GDHZ(0.155)、GDZJ(0.226)、GDFS(0.158)這3地區的群體分化更嚴重。

表3 5個紅螯螯蝦群體在8個微衛星位點的遺傳多樣性統計Tab.3 Genetic diversity parameters at eight microsatellite loci among five populations of C.quadricarinatus

2.2 遺傳分化分析

群體間分化程度的指標常用Fst和P值量化不同種群間遺傳分化程度(表4)。從結果中可知，GXNN、GDHZ、GDFS 3個種群相似度最高，ZJHZ和GDZJ最低；并且GXNN、GDHZ、GDFS之間基本沒有遺傳分化，ZJHZ和GDZJ之間存在中等程度的遺傳分化。從分子方差分析(AMOVA)結果可知(表4)，種群內遺傳變異較大，占變異總量的98%，種群間的遺傳變異僅占2%，可以看出遺傳變異主要來自種群內。在STRUCTURE(2.3.3版本)軟件中基于貝葉斯模型的群體聚類方法，得到最適delta K值為5(圖1)，表明5個聚類是最可能的種群結構。由圖2可知，5個養殖群體表現明顯的差異，說明這5個種群具有明顯的遺傳結構。

圖1 STRUCTURE分析的ΔK方法繪制的K值變動圖Fig.1 K value change diagram drawn by ΔK method of STRUCTURE analysis

圖2 K=5時150個樣品的STRUCTURE結果Fig.2 The STRUCTURE results of 150 samples when K=5

表4 群體間的Fst值(下三角)和P值(上三角)Tab.4 Fst value(lower triangle) and P value(upper triangle)

表5 5個種群間AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis of microsatellites among five cultured populations

3 討論

3.1 SSR位點多態性的意義

本研究開發了8個新的多態性微衛星位點，用于分析廣東湛江、廣東惠州、廣東佛山、廣西南寧、浙江湖州5個地區不同養殖群體之間的遺傳關系。所有微衛星Na數范圍在3～12，平均值為8.125，與金玲等[22]研究結果相似。I的數值范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。8個微衛星位點都具有高水平的多態性(PIC>0.25)，而PIC、Ho、He能夠反映群體中個體的遺傳變異程度，其中PIC是衡量微衛星多態性的一個指標，根據BOTSTEIN等[23]的方法界定衡量基因變異程度高低：當PIC>0.5時，該位點為高度多態位點；0.25

3.2 SSR位點在群體中的多態性

8個微衛星位點在150個個體中的Na數在2～10之間變化，平均值為6.05，與甲殼動物Na較少的結論是一致的[24]。該結果與一些水生動物相似，如戴氏裸玉褶魚(Hypoptychusdybowskii)[25]和斑鱖(Sinipercascherzeri)[26]。在5個養殖群體中，平均Na及He分別為6.05和0.614，與BIAN等[27]關于紅螯螯蝦的結果相近。本實驗結果表明H0范圍在0.143～0.833，平均值為0.49，與澳洲野生紅螯螯蝦群體(H0：0.35～0.71)相比差距較小。而雜合度的高低在遺傳學中也代表著遺傳變異性的高低[28]，這也表明本研究采集的國內紅螯螯蝦養殖群體具有較豐富的遺傳多態性，而已有研究表明，國內養殖群體遺傳多樣性雖然保持著較高水平，但與澳洲野生紅螯螯蝦群體相比還是有些許下降[22]。

3.3 群體的遺傳分化與遺傳結構

Fis、AMOV、FCA和結構分析表明，大部分的變異來源于種群內部，只有小部分來源于種群間，這個結果和HE等[3]的研究相似。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大(0.107 7)。這些結果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，而種群內的差異很可能是因為人工選擇對于這些養殖群體的影響還不夠高[10]，或者是由于小規模養殖的遺傳漂變影響的結果。在本研究中有4個微衛星位點偏離了哈迪溫伯格平衡，而在金玲等[22]的研究中10個位點有5個偏離了哈迪溫伯格平衡，這可能是存在無效等位基因從而導致雜合子缺失[29]。也可能是隨著紅螯螯蝦養殖發展，不可避免地會發生近交，而近親繁殖會使種群質量衰減、生產力下降[3]。

4 結論

本研究共鑒定8個多態多樣性良好的微衛星位點。8個位點在150個樣本個體中共檢測出237個Na，平均為6.05，說明這些微衛星位點可以用來檢測紅螯螯蝦的遺傳變異。Ho和He也保持著較高水平意味著所采集的國內紅螯螯蝦養殖群體具有較豐富的遺傳多態性。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大。這些結果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，表明這5個中國紅螯螯蝦養殖群體具有較高水平的遺傳多態性，雖然5個養殖群體都保持著較高的遺傳多態性，但結合過往研究，隨著累代養殖，紅螯螯蝦養殖群體會不可避免發生近交，會對培育品種產生不良影響，也會導致國內紅螯螯蝦遺傳多樣性有下降的風險。而以上實驗數據可為后續定制科學合理的選育及保種的方法提供數據支持，這樣紅螯螯蝦產業才能夠持久健康發展。