丙氨酸抑制PKM2表達對缺血性腦損傷保護作用

［收稿日期］2022-11-20;" ［修訂日期］2023-03-17

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82071385）

［第一作者］王茜鈺然（1995-），女，碩士研究生。

［通信作者］萬芪（1962-），男，博士，教授，博士生導師。E-mail：qiwan1@hotmail.com。

［摘要］" 目的

研究丙氨酸（Ala）在缺血性腦損傷中的神經保護作用以及Ala對M2型丙酮酸激酶（PKM2）表達水平的調節。

方法" 體外培養原代神經元并構建氧-糖剝奪/再灌注（OGD/R）模型，將神經元隨機分為對照組、OGD/R模型組以及OGD/R后Ala干預組（OGD/R+Ala），應用CCK-8方法檢測Ala干預對神經元存活率的影響，Western blot方法檢測Ala對OGD/R模型神經元內PKM2蛋白表達水平的影響。構建大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，隨機將36只SD大鼠分為假手術組、MCAO組以及MCAO后Ala干預組（MCAO+Ala），每組12只，采用免疫熒光方法檢測腦缺血/再灌注損傷后神經元內Ala含量的變化，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察各組腦梗死面積，Western blot方法檢測Ala干預對缺血損傷腦組織中PKM2蛋白表達水平的影響。

結果

CCK-8與Western blot檢測結果顯示，各組神經元存活率及PKM2蛋白表達差異有顯著性（F=86.88、20.83，Plt;0.05），OGD/R組細胞存活率較對照組顯著降低，PKM2蛋白表達較對照組升高（tLSD=4.65、10.95，Plt;0.05）；OGD/R+Ala組細胞存活率較OGD/R組顯著增加，PKM2蛋白表達較OGD/R組明顯下降（tLSD=4.98、4.69，Plt;0.05）。免疫熒光染色結果顯示，MCAO組大鼠受損神經元內Ala含量較假手術組明顯降低。TTC結果顯示，Ala干預使MCAO模型大鼠缺血面積減少（F=83.90，tLSD=3.41，Plt;0.05）。Western blot結果顯示，MCAO模型組大鼠腦組織中PKM2表達水平增高，與假手術組相比差異有顯著性（F=3.60，tLSD=5.10，Plt;0.05），Ala干預后腦組織中PKM2表達水平明顯下降（tLSD=6.20，Plt;0.05）。

結論" Ala可能通過抑制PKM2蛋白表達減輕腦缺血/再灌注損傷從而發揮神經保護作用。

［關鍵詞］" 缺氧缺血，腦；丙氨酸；丙酮酸激酶；神經保護藥

［中圖分類號］" R338.2；R743

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0001-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.036

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240329.0927.001;2024-04-01" 12：06：17

Alanine exerts neuroprotective effects in cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibition of PKM2

＼ WANG Xiyuran， GAO Jingchen， Ge Chengyan， Wang Yitian， WAN Qi

＼ （Institute of Neurodegeneration And Neurorehabilitation， Qingdao University，" Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective role of alanine （Ala） in ischemic brain injury and the regulation of M2-type pyruvate kinase （PKM2） expression levels by Ala.

＼ Methods＼ Primary neurons were cultured in vitro and an oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） model was constructed. Neurons were randomly divided into the sham-operated group （Sham）， oxygen-glucose deprivation/reperfusion-treated group （OGD/R）， and post-OGD/R Ala intervention group （OGD/R+Ala）. CCK-8 method was used to detect the effect of Ala intervention on neuronal survival rate. Western blot was used to detect the effect of Ala on PKM2 protein expression level in neurons of the OGD/R model. A middle cerebral artery embolization （MCAO） model was constructed in rats， and 36 SD rats were randomly divided into the sham-operated group （Sham）， middle cerebral artery embolization group （MCAO）， and post-MCAO Ala intervention group （MCAO+Ala）， with 12 rats in each group. Immunofluorescence assay was used to detect the changes of Ala content in OGD/R injured neurons. The changes in the cerebral infarct area were observed after 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride （TTC） staining. Western blot was used to detect the effect of Ala intervention on the expression level of PKM2 protein in ischemically injured brain tissues.

＼ Results＼ CCK-8 and Western blot showed significant differences in neuronal survival rate and PKM2 expression （F=86.88，20.83;Plt;0.05）. Cell survival was significantly lower and PKM2 expression was higher in the OGD/R group compared with the Sham group （tLSD=4.65，10.95;Plt;0.05）. Compared with OGD/R， OGD/R+Ala significantly increased neuronal survival and reduced PKM2 expression （tLSD=4.98，4.69;Plt;0.05）. Immunofluorescence staining showed that Ala content in damaged neurons was significantly lower in the MCAO group compared with the Sham group. TTC showed that Ala intervention reduced the ischemic area in MCAO model rats （F=83.90，tLSD=3.41，Plt;0.05）. Western blot showed that PKM2 expression levels were significantly increased in the brain tissue of the MCAO model rats compared with the sham-operated group （F=3.60，tLSD=5.10，Plt;0.05）. PKM2 expression levels in brain tissue decreased significantly after Ala intervention （tLSD=6.20，Plt;0.05）.

＼ Conclusion＼ Ala can reduce cerebral ischemia/reperfusion injury and thus exert neuroprotective effects by inhibiting PKM2 protein expression.

［Key words］＼ hypoxia-ischemia， brain; alanine; pyruvate kinase; neuroprotective agents

缺血性腦卒中是一種高死亡率及高致殘率的疾病［1-2］，主要由動脈栓塞、微血管病變或大血管病變引起，缺血性腦卒中引起的腦損傷導致腦內低氧和葡萄糖缺乏，最終引起神經功能障礙［3-5］。丙氨酸（Ala）是一種非必需氨基酸，對許多生物分子的合成至關重要。研究發現，Ala 具有神經保護作用［6］，Ala 在腦卒中病人血清中含量降低［7］，推測其在神經元內含量也可能降低并且與神經元的死亡密切相關。丙酮酸激酶（PK）為糖酵解的關鍵酶之一，有4種不同的亞型［8］，M2型PK（PKM2）是其中一種。研究表明，PKM2分布于腦組織中，PKM2敲除或抑制可保護缺血組織，因此推測其可能作為腦卒中后 Ala 發揮神經保護作用的下游信號［9-14］。目前， Ala 在缺血性腦損傷中對 PKM2的作用及其機制尚不明確。本研究旨在探討 Ala 對缺血性腦損傷后神經元的保護作用及其對 PKM2表達水平的調節作用，從而為缺血性腦卒中的治療提供新的思路。現將結果報告如下。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

1.1.1" 實驗動物" SPF級，出生24 h內SD胎鼠以及體質量250 g健康成年雄性SD大鼠36只，均購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養于青島大學醫學部實驗動物中心。

1.1.2" 主要試劑" 抗PKM2兔單克隆抗體、抗β-actin鼠單克隆抗體、抗MAP2小鼠單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司，抗Ala兔單克隆抗體（Abcam），L-丙氨酸（Solarbio），增強型CCK-8試劑盒（Bioss），原代神經元培養相關試劑（Gibico），胎牛血清（四季青），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染料（Solarbio），Western blot相關試劑（Solarbio）。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 原代神經元培養" 取出生24 h的SD胎鼠，用體積分數0.75乙醇消毒后，將胎鼠頭剪下置于冰水混合的Hank’s平衡液中，在立體顯微鏡下剝離胎鼠顱骨和腦膜，分離大腦皮質并將其暫存于無血清DMEM培養液中，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入5 g/L胰酶于37 ℃下消化25 min，加入含血清的DMEM完全培養液終止消化，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入無血清Neurobasal Medium培養液（含體積分數0.02 B-27 Supplement、0.01 gluta Max 100×、10 g/L青霉素-鏈霉素100×），將細胞重懸后細胞篩過濾，以3×108個/L密度接種于多聚賴氨酸包被的孔板中，次日全換液，此后每3 d半換液。

1.2.2" 氧-糖剝奪/再灌注（OGD/R）細胞模型制備及分組" 原代神經元培養10 d后，將其隨機分為對照組（Sham組）、OGD/R處理組（OGD/R組）以及OGD/R后Ala干預組（OGD/R+Ala組）。用PBS輕輕沖洗3次后，OGD/R與OGD/R+Ala組加入無糖細胞外液置于37 ℃厭氧箱（內含體積分數0.01 O2+體積分數0.94 N2+體積分數0.05 CO2）中，Sham組則加入有糖細胞外液置于正常培養箱中。1.5 h后取出神經元，Sham組和OGD/R組更換為無血清神經元培養液，OGD/R+Ala組則更換為含10 μmol/L Ala的等體積無血清神經元培養液。

1.2.3" CCK-8比色法檢測細胞存活率" 神經元復氧24 h后每孔加入等量含體積分數0.10 CCK-8溶液的無血清培養液，置于37 ℃培養箱中孵育3 h。用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（％）=（實驗孔吸光度－空白孔吸光度）／（對照孔吸光度－空白孔吸光度）×100%。

1.2.4" 免疫熒光染色" 用無菌PBS漂洗細胞爬片3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，再次用無菌PBS漂洗3次，每孔加入體積分數0.03血清封閉液（含體積分數0.025 Triton X-100）200 μL室溫封閉破膜1.5 h，加入一抗（1∶300）4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次后加入二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，再次用PBS漂洗3次，使用抗熒光猝滅封片劑封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5" 大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型制備及分組" 采用線栓法建立大鼠MCAO模型。大鼠在異氟烷氣體麻醉下仰臥位固定在手術臺上，備皮后常規消毒頸部皮膚，取頸部正中切口，暴露分離動脈

血管。結扎頸總動脈近心端和頸外動脈，將線栓經頸外動脈切口處插入頸內動脈至堵塞大腦中動脈開口處，扎緊動脈殘端，90 min后拔除線栓并縫合皮膚。24 h后觀察大鼠肢體活動，Longa評分1～3分者選為實驗對象。采用隨機數字表法將SD大鼠分為假手術組（Sham組）、MCAO組以及MCAO后Ala干預組（MCAO+Ala組），每組6只。其中Sham組大鼠僅于頸外動脈處開口不進行梗阻，MCAO+Ala組在拔栓時給予10 mg/kg的Ala靜脈注射，其余兩組注射等量生理鹽水。

1.2.6" TTC染色檢測梗死面積" MCAO 24 h后，大鼠經異氟烷氣體麻醉，用生理鹽水進行心臟灌注，分離腦組織切成2 mm厚切片。將腦片置于200 g/L TTC溶液中37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min晃動1次。染色后正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白色。用組織固定液浸泡24 h后按解剖結構從前向后擺放腦片，用掃描儀采集圖像，Image J軟件定量檢測各組梗死面積。

1.2.7" Western blot檢測PKM2表達水平" 收集各組半暗帶區腦組織，制備神經元樣本，經裂解、研磨、離心后取上清，BCA 法檢測蛋白濃度，行SDS-PAGE 凝膠電泳，每孔蛋白上樣量10 μg。經電泳（80 V）、轉膜（220 mA，90 min）后，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入抗PKM2兔單克隆抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，用 ECL 發光劑顯影，洗脫條帶后加入抗β-actin鼠單克隆抗體（1∶8 000），用上述方法孵育二抗及顯影。采用 Image J 軟件對條帶進行半定量分析。

1.3" 統計學分析

應用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，兩組數據比較采用t檢驗；多組數據比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" Ala 處理對OGD/R后受損神經元作用

CCK-8結果顯示，各組神經元存活率比較差異有顯著性（F=86.88，Plt;0.05）。兩兩比較顯示，與Sham組相比，OGD/R組神經元存活率降低（tLSD=10.95，Plt;0.05）；與OGD/R組相比，OGD/R+Ala組神經元存活率顯著增加（tLSD=4.98，Plt;0.05）。見表1。

2.2" Ala對OGD/R 損傷神經元內PKM2蛋白表達影響

Western blot 檢測顯示，各組神經元 PKM2蛋白表達水平差異具有統計學意義（F=20.83，Plt;0.05）。兩兩比較顯示，OGD/R組PKM2蛋白表達較Sham組升高，OGD/R+Ala組PKM2蛋白表達較OGD/R組明顯下降，差異有顯著性（tLSD=4.65、4.69，Plt;0.05）。見圖1、表1。

2.3" 缺血性腦損傷后受損神經元內Ala含量變化

免疫熒光染色結果顯示，MCAO組大鼠受損神經元內 Ala 含量較對照組明顯降低（圖2）。

2.4" Ala對MCAO大鼠腦梗死面積影響

TTC染色結果顯示，各組大鼠腦梗死面積比較差異有統計學意義（F=83.90，Plt;0.05）。兩兩比較顯示，MCAO組大鼠腦梗死面積較Sham組增加（tLSD=10.90，Plt;0.01），MCAO+Ala組大鼠腦梗死面積較MCAO組則明顯減小（tLSD=3.41，Plt;0.05）。見圖3。

2.5" Ala對缺血損傷腦組織中PKM2蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，各組腦組織缺血半暗帶組織PKM2蛋白表達比較差異有統計學意義（F=3.60，Plt;0.05），兩兩比較顯示，MCAO組PKM2蛋白表達水平較Sham組升高，MCAO+Ala組PKM2蛋白表達水平較MCAO組明顯下降，各組比較差異均有統計學意義（tLSD=5.10、6.20，Plt;0.05）。見圖4、表2。

神經元標記物Neun染色呈紅色，Ala呈綠色，DAPI呈藍色。

3" 討" 論

腦卒中是殘疾的主要原因，也是全球第二大死亡原因。其發病機制極其復雜，是細胞凋亡、興奮性毒性、氧化應激和炎癥等病理生理過程相互作用的

結果［5，15］。Ala是一種非必需氨基酸，在神經系統

中主要通過糖酵解途徑及其他代謝途徑產生。代謝

組學研究顯示，Ala在卒中病人血清中含量降低［6］。由于氨基酸具有多種生物學功能，因此，它們的變化可能反映了缺血性腦損傷的一些關鍵病理生理通路。近年來的研究表明，Ala可以通過增加神經系統中腦源性神經營養因子、神經肽Y的表達并減少炎癥反應從而發揮神經保護作用［16-17］。但Ala在缺血性腦損傷中的作用及機制尚不清楚。本研究從在體實驗及離體實驗兩方面證實了Ala對缺血損傷腦組織的保護作用及其靶點。免疫熒光結果顯示，缺血性腦損傷發生后，受損神經元中Ala含量顯著降低。本文應用CCK-8方法檢測補充Ala是否具有神經保護作用，結果顯示，在原代培養的神經元內補充Ala可以減少OGD/R導致的神經元死亡。在體實驗同樣支持上述結論，TTC染色結果表明，補充Ala可以減少MCAO大鼠的腦梗死面積。

PKM2是一種在糖酵解中將磷酸烯醇式丙酮酸去磷酸化為丙酮酸的酶。最近的一項研究表明，PKM2敲除小鼠在胚胎和出生后階段沒有表現出任何明顯的發育異常［10］，PKM2基因敲除小鼠失

去PKM2可以通過維持線粒體生物生成來保護缺

血組織［11］。有研究表明，Ala是PKM2四聚體的變

構激活劑［12-13］；然而另有研究指出，PKM2的PK酶活性可被Ala抑制［14］。目前尚不清楚在腦缺血/再灌注損傷模型中Ala是否以及如何對PKM2進行調控。為了進一步探究Ala發揮神經保護作用的分子機制，本文采用Western blot方法檢測了各組大鼠神經元以及腦組織中PKM2的表達水平，結果顯示，缺血性腦損傷發生后，神經元內PKM2的表達水平顯著升高，導致腦缺血面積增大、原代神經元存活率下降等一系列損傷；Ala干預使缺血面積減少，PKM2表達水平明顯下降，細胞存活率顯著增加。提示Ala處理可以通過抑制PKM2的表達水平發揮神經保護作用，但其下游的具體作用機制還需進一步研究。

綜上所述，Ala可通過抑制PKM2蛋白表達減少MCAO模型大鼠的腦梗死面積以及OGD/R損傷神經元的死亡，發揮神經保護作用。

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（本文編輯" 黃建鄉）