替羅非班對急性缺血性卒中小鼠的神經保護作用

［收稿日期］2023-06-01;" ［修訂日期］2023-08-21

［基金項目］國家重點研發計劃項目（2018YFC1315200）；山東省自然科學基金項目（ZR2020QH099）

［第一作者］滿旭（1995-），女，碩士研究生。

［通信作者］孫錦平（1969-），女，博士，主任醫師，博士生導師。E-mail：sunjinping@qdu.edu.cn。

［摘要］" 目的

探討替羅非班對急性缺血性卒中（AIS）小鼠腦梗死體積及神經元凋亡的影響。

方法" 將65只雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、模型組及替羅非班低、中、高劑量組，每組13只。采用光化學腦卒中法建立小鼠腦缺血模型。模型組尾靜脈注射相同體積的生理鹽水，替羅非班各劑量組尾靜脈注射不同劑量的替羅非班。采用神經行為學評分（mNSS評分）評估小鼠神經功能缺損，2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）測定小鼠腦梗死體積，TUNEL染色與NeuN染色檢測小鼠神經元凋亡情況。

結果" 5組的mNSS評分、腦梗死體積、TUNEL陽性細胞數量和NeuN陽性細胞數量差異有統計學意義（F=9.630～124.927，Plt;0.05）。與模型組相比，替羅非班中劑量組神經行為損傷明顯改善、腦梗死體積下降、TUNEL陽性細胞數量減少、NeuN陽性細胞數量增加，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。

結論" 中劑量替羅非班可降低AIS小鼠神經功能缺損評分、減小腦梗死體積及減輕神經元凋亡，從而發揮神經保護作用。

［關鍵詞］" 替羅非班；缺血性腦卒中；神經行為學表現；腦梗死；神經細胞凋亡抑制蛋白

［中圖分類號］" R972.7;R743.3

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0017-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.021

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240319.1459.004;2024-03-21" 17：37：49

Neuroprotective effects of tirofiban in mice with acute ischemic stroke

＼ MAN Xu， HAN Bin， WANG Qingqing， SUN Jinping

（Center for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Department of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the effects of tirofiban on brain infarct volume and neuronal apoptosis in mice with acute ischemic stroke （AIS）.

＼ Methods＼ Sixty-five C57BL/6 mice were randomly divided into sham group， model group， and low-dose， medium-dose， and high-dose tirofiban groups， with 13 mice in each group. Amouse model of cerebral ischemia was established through photochemical thrombosis. The model group received injection of the same volume of normal saline via the tail vein， while the tirofiban groups receivedinjection of different doses of tirofiban into the tail vein.The neurological deficits of mice were evaluated using the modified neurological severity scale （mNSS）.The brain infarct volume was measuredwith 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride staining. Neuronal apoptosis was determined with TUNEL staining and NeuN staining.

＼ Results＼ There were significant differences in the mNSS score， cerebral infarction volume， the number of TUNEL-positive cells， and the number of NeuN-positive cells between the five groups （F=9.630-124.927，Plt;0.05）. Compared with the model group， the medium-dose tirofiban group showed significantly resolved neurobehavioral damage， a significantly decreased cerebral infarction volume， a signi-

ficantly decreased number of TUNEL-positive cells， and a significantly increased number of NeuN-positive cells （Plt;0.05）.

＼ Conclusion＼ A medium dose of tirofiban can play a neuroprotective role in mice with AIS， decreasing neurological deficit score， infarct volume，and neuronal apoptosis.

［Key words］＼ tirofiban; ischemic stroke; neurobehavioral manifestations; brain infarction; neuronal apoptosis-inhibitory protein

急性缺血性卒中（AIS）病人約占所有卒中的80%［1］。AIS的病理過程涉及炎癥、細胞凋亡和神經元損傷［2］。對于AIS病人，在發病后4.5 h內，靜脈溶栓是標準治療方法［3］，可改善臨床預后并降低死亡率［4］。目前針對AIS的治療方法十分有限，迫切需要開發新療法。AIS治療的主要目標是保護正常腦組織，促進梗死區附近缺血半暗帶區域的功能恢復［5］。有研究表明，抗血小板藥物的使用對于AIS治療是必要的［6-7］。替羅非班是一種半衰期短的速效糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa抑制劑，可通過可逆阻斷纖維蛋白結合受體來抑制血小板聚集的最終共同途徑［8］。替羅非班在未接受早期再通治療的AIS病人中是安全有效的［9］。本研究探討不同劑量替羅非班對小鼠腦梗死體積以及缺血半暗帶區神經元凋亡的影響，為替羅非班用于AIS病人提供依據。現報告如下。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

雄性C57BL/6小鼠65只，體質量為（26±2）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國Sigma公司。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。NeuN抗體購自英國Abcam公司。驢抗兔IgG二抗購自美國Thermo Scientific公司。40 g/L多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司。鹽酸替羅非班氯化鈉注射液由魯南貝特制藥有限公司提供。制備光化學模型所需光纖冷光源儀器購自德國Schott公司。冷凍超薄切片機購自德國Leica公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 光化學卒中模型制備及實驗分組" 采用光化學方法誘導血栓形成腦缺血模型［10］。將所有小鼠隨機分為假手術組、模型組、替羅非班低劑量組（2.5 mg/kg）、替羅非班中劑量組（7.5 mg/kg）和替羅非班高劑量組（12.5 mg/kg），每組13只。光化學卒中模型建立后，假手術組注射孟加拉玫瑰紅后不光照，其余手術步驟同模型組。模型組小鼠尾靜脈注射相應體積的生理鹽水，其余各組小鼠分別尾靜脈注射低、中、高劑量替羅非班。24 h后，每組隨機選取10只小鼠進行神經行為學評分（mNSS評分），之后處死小鼠，測量腦梗死體積。隨后，每組取剩余的3只小鼠進行冷凍切片標本采集，進行免疫熒光實驗。

1.2.2" mNSS評分" mNSS評分范圍為0～18分，內容主要包括運動測試、感覺測試、平衡木測試和反射測試［10］。mNSS評分越高，表示神經系統損傷越嚴重。

1.2.3" 腦梗死體積的測定" 在光化學所致的腦缺血模型形成后24 h后采用TTC染色法對小鼠腦組織進行染色。白色區域的體積即為腦梗死體積。具體步驟如下：腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，去除小鼠顱骨后，取出腦組織放置在載玻片上，之后迅速置于-20 ℃冰箱中速凍10 min。將冷凍過的腦組織取出，沿冠狀面切成約2 mm厚的腦片。將切片置于20 g/L TTC溶液中，37 ℃下避光孵育30 min。切片每5 min翻轉一次，最后將染色完成后的腦片放置在40 g/L多聚甲醛中固定1 h，將固定好的腦片旁邊放置直尺，并進行拍照。利用Image-Pro-Plus軟件對梗死區域進行體積的測量，計算腦梗死體積比例。腦梗死體積比例=（總梗死體積/各腦切片體積之和）×100%。

1.2.4" TUNEL法檢測小鼠腦缺血半暗帶區凋亡細胞數" 光化學致腦缺血模型建立成功后24 h，麻醉小鼠后分離腦組織，腦組織在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，將腦組織轉移到含有150 g/L蔗糖水的離心管中進行脫水，待腦組織沉入到離心管管底后，將腦組織轉移到含有300 g/L蔗糖水的離心管中進行進一步脫水，直至腦組織沉入管底，進行下一步包埋。脫水后的腦組織嵌入OCT包埋，干冰快速冷凍后，使用溫度為-20 ℃的冷凍切片機將腦組織沿冠狀面切成厚度為8 μm的腦片，之后用40 g/L多聚甲醛固定腦片30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，每次10 min。加入含體積分數0.005聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的PBS，待破膜完畢后，將腦片用PBS清洗3次。使用TUNEL檢測試劑盒進行TUNEL測定。加入50 μL TUNEL反應混合物（5 μL TdT酶溶液和45 μL標記溶液），并將所得混合物在黑暗潮濕的環境中在37 ℃下孵育1 h。用PBS洗滌3次。最后，細胞核使用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。用熒光顯微鏡觀察呈現綠色的凋亡細胞。

1.2.5" 免疫熒光染色方法檢測小鼠腦缺血半暗帶區NeuN的表達" 將-20 ℃冰箱中的腦冷凍切片復溫至室溫，多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽吐溫緩沖液洗3次，每次5 min。之后利用體積分數0.003 Triton X-100室溫通透10 min，破膜完畢后，將腦片清洗3次。用PBS配制30 g/L的牛血清清蛋白進行室溫封閉1 h。封閉完成后，加入NeuN一抗（1∶500），并置于4 ℃的冰箱中孵育過夜。一抗孵育完畢之后，用PBS清洗3次，每次5 min。加入熒光二抗（1∶500）后室溫避光孵育40 min。二抗孵育完成后，加入DAPI染色，抽選3個熒光顯微鏡下的視野進行圖像分析并計算NeuN陽性細胞數。

1.3" 統計學處理

應用Graph Pad Prism 9.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組數據組間均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" 各組小鼠mNSS評分比較

mNSS評分結果顯示，5組小鼠mNSS評分差異有統計學意義（F=97.234，Plt;0.05）。與假手術組相比，模型組小鼠出現神經功能損傷（P＜0.05）；與模型組相比，替羅非班中劑量組小鼠神經行為功能損傷減輕（P＜0.05）。見表1。

2.2" 各組小鼠腦梗死體積比較

TTC染色結果顯示，5組小鼠腦梗死體積差異有統計學意義（F=43.080，Plt;0.01），與模型組相比，替羅非班中劑量組小鼠腦梗死體積減小（P＜0.05）。見圖1和表1。

2.3" 各組小鼠缺血半暗帶區TUNEL陽性細胞數比較

凋亡染色結果顯示，5組小鼠缺血半暗帶區的TUNEL陽性細胞數差異具有統計學意義（F=124.927，Plt;0.05）。與假手術組相比較，模型組

小鼠缺血半暗帶區的TUNEL陽性細胞數上升（P＜0.05）；

與模型組相比，替羅非班中劑量組的TUNEL陽性細胞數減少（P＜0.05）。見圖2和表1。

2.4" 各組小鼠缺血半暗帶區NeuN陽性細胞數的比較

免疫熒光結果顯示，5組小鼠缺血半暗帶區NeuN陽性細胞數差異有統計學意義（F=9.630，Plt;0.05）。與假手術組相比，模型組、低劑量替羅非班組小鼠缺血半暗帶區NeuN陽性細胞數顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，替羅非班中劑量組的NeuN陽性細胞數顯著上升（P＜0.05）。見圖3和表1。

3" 討" 論

本研究結果顯示，替羅非班可減少腦梗死體積和神經元凋亡，改善AIS小鼠神經功能缺損。表明替羅非班可以保護AIS后帶來的神經損傷，為替羅非班在AIS中的作用提供了新的見解。

替羅非班是一種高度特異性的非肽類血小板放大400倍，標尺=100 μm。

GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，可有效阻斷血小板活化和

聚集的共同途徑［11］。在腦卒中相關治療中，給予GPⅡb/Ⅲa抑制劑可能是安全的，但是應該注意藥物種

類和劑量［12-13］。阿昔單抗可以增加癥狀性顱內出血的風險，替羅非班在低劑量下可以被認為是安全的［14］。

與常見的雙重抗血小板治療相比較，替羅非班單藥治療AIS是安全的［15］，替羅非班治療作為未接受再通治療的AIS病人的補救治療，是安全有效的［16-17］。替羅非班可能是AIS治療潛在的安全選擇［18］。

有研究表明，替羅非班在大腦中動脈阻塞24 h后可以減小小鼠腦梗死體積，但對小鼠神經功能障礙無明顯影響［19］。而本研究結果顯示，7.5 mg/kg的替羅非班不僅可減小小鼠腦梗死體積，也降低了小鼠神經功能障礙。腦卒中發生后，主要引起神經細胞凋亡及機體炎癥反應。NeuN被認為是一種成熟神經元標志物，是腦卒中研究中極其重要的一個指標［20］。本研究結果顯示，替羅非班中劑量組小鼠NeuN陽性細胞數明顯上升。表明替羅非班通過降低梗死體積、減輕神經功能損傷以及減少缺血半暗帶區NeuN陽性神經元的丟失，在AIS中發揮神經保護作用［21］。

本研究還發現，較高劑量（12.5 mg/kg）替羅非班可能導致更大的腦梗死體積。有學者提出了雙相劑量反應和激效的概念，即在低劑量刺激下具有有益作用，高劑量會導致抑制甚至毒性效應［22-23］。推測高劑量下腦梗死體積的增加可能與雙相劑量反應和激效有關。

綜上所述，本研究在動物水平觀察了不同劑量

替羅非班對AIS小鼠的神經保護作用。替羅非班放大400倍，標尺=100 μm。

可通過減少腦梗死體積以及減輕缺血半暗帶區神經

元凋亡來發揮神經保護作用。本研究未能進一步檢

測凋亡相關蛋白的變化趨勢，也未涉及替羅非班發

揮神經保護作用的具體的分子機制及相關通路。這些內容我們將在后續研究中進行進一步的探討。

［參考文獻］

［1］WANG W Z， JIANG B， SUN H X， et al. Prevalence， incidence， and mortality of stroke in China： results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults［J］. Circulation， 2017，135（8）：759-771.

［2］DUAN J L， CUI J， YANG Z F， et al. Neuroprotective effect of Apelin 13 on ischemic stroke by activating AMPK/GSK-3β/Nrf2 signaling［J］. Journal of Neuroinflammation， 2019，16（1）：24.

［3］POWERS W J， RABINSTEIN A A， ACKERSON T， et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke：3019 update to the 2018 guidelines for the early management of acute ischemic stroke： a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association［J］. Stroke， 2019，50（12）：e344-e418.

［4］WARDLAW J M， MURRAY V， BERGE E， et al. Thrombo-

lysis for acute ischaemic stroke［J］. The Cochrane Database of Systematic Reviews， 2014， 2014（7）：CD000213.

［5］LEIGH R， KNUTSSON L， ZHOU J Y， et al. Imaging the physiological evolution of the ischemic penumbra in acute ischemic stroke［J］. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism： Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism， 2018，38（9）：1500-1516.

［6］HOU X W， CHEN H S. Proposed antithrombotic strategy for acute ischemic stroke with large-artery atherosclerosis： focus

on patients with high-risk transient ischemic attack and mild-

to-moderate stroke［J］. Annals of Translational Medicine， 2020，8（1）：16.

［7］PHIPPS M S， CRONIN C A. Management of acute ischemic stroke［J］. BMJ， 2020，368：16983.

［8］KING S， SHORT M， HARMON C. Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa in-

hibitors： the resurgence of tirofiban［J］. Vascular Pharmacology， 2016，78：10-16.

［9］HAN B， MA T， LIU Z D， et al. Efficacy and safety of tirofiban in clinical patients with acute ischemic stroke［J］. Frontiers in Neurology， 2021，12：785836.

［10］CHEN J， SANBERG P R， LI Y， et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats［J］. Stroke， 2001，32（11）：2682-2688.

［11］WANG Y， MA H R， ZHANG Q H， et al. Factors affecting the outcomes of tirofiban after endovascular treatment in acute ischemic stroke： experience from a single center［J］. CNS Neuroscience amp; Therapeutics， 2023，29（3）：957-967.

［12］YANG M， HUO X， MIAO Z， WANG Y. Platelet Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa Receptor Inhibitor Tirofiban in Acute Ischemic Stroke. Drugs， 2019，79（5）：515-29.

［13］LIU J， YANG Y， LIU H. Efficacy outcomes and safety mea-

sures of intravenous tirofiban or eptifibatide for patients with acute ischemic stroke： a systematic review and meta-analysis of prospective studies. Journal of thrombosis and thromboly-

sis， 2022，53（4）：898-910.

［14］ZHU X L， CAO G M. Safety of glycoprotein Ⅱb-Ⅲa inhibitors used in stroke-related treatment： a systematic review and meta-analysis［J］. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis： Official Journal of the International Academy of Clinical and Applied

Thrombosis/Hemostasis， 2020，26：107602962094-

2594.

［15］TAO C R， ZHU Y Y， ZHANG C， et al. Association between tirofiban monotherapy and efficacy and safety in acute ischemic stroke［J］. BMC Neurology， 2021，21（1）：237.

［16］WU C， SUN C， WANG L， et al. Low-dose tirofiban treatment improves neurological deterioration outcome after intravenous thrombolysis［J］." Stroke， 2019，50（12）：3481-3487.

［17］TANG L， TANG X， YANG Q. The application of tirofiban in the endovascular treatment of acute ischemic stroke： a meta-analysis［J］. Cerebrovascular Diseases （Basel， Switzerland）， 2021，50（2）：121-131.

［18］GONG J H， SHANG J J， YU H， et al. Tirofiban for acute ischemic stroke： systematic review and meta-analysis［J］. European Journal of Clinical Pharmacology， 2020，76（4）：475-481.

［19］LI T T， FAN M L， HOU S X， et al. A novel snake venom-derived GPⅠb antagonist， anfibatide， protects mice from acute experimental ischaemic stroke and reperfusion injury［J］. British Journal of Pharmacology， 2015，172（15）：3904-3916.

［20］ZHAO Y， ZHANG X， CHEN X， et al. Neuronal injuries in cerebral infarction and ischemic stroke： From mechanisms to treatment （Review）［J］. International Journal of Molecular Medicine， 2022，49（2）：1-9.

［21］DUAN W， ZHANG Y P， HOU Z， et al. Novel insights into NeuN： from neuronal marker to splicing regulator［J］. Mole-

cular Neurobiology， 2016，53（3）：1637-1647.

［22］CALABRESE E J. The emergence of the dose-response concept in biology and medicine［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（12）：2034.

［23］GNES-BAYIR A， KOCYIGIT A， GULER E M， et al. In vitro hormetic effect investigation of thymol on human fibroblast and gastric adenocarcinoma cells［J］. Molecules， 2020，25（14）：3270.

（本文編輯" 周曉彬）

醫學學術論文討論的寫作

討論是學術論文的重要組成部分，是結果的展開、延伸和升華，是作者表達個人見解、闡述學術思想把實驗結果提高到理論高度的部分。討論的目的主要是回答“研究出什么？”的問題，是論述本文在選題、方法、結果等方面與過去文獻比較的異同和優劣，并從中引出新的觀點、結論，探求新的規律。討論部分可反映作者對研究的認識水平。討論的主要內容包括與該研究相關的理論闡述、理論意義和實踐意義評價、研究進展和遺留問題等。國際醫學期刊編輯委員會（ICMJE）發布的《向生物醫學期刊投稿的統一要求》對討論部分的書寫作了統一要求，主要可歸納為以下5點：①應強調指出研究獲得的新的重要結果和結論，不要重復引言和結果部分內容；②應說明研究的價值和局限性，如有其他相關研究，應闡述其間的關聯；③要與研究的目的結合起來討論，避免妄下研究結果不支持的結論；④除非做了經濟學分析，一般不應下成本、效益方面的結論；⑤要避免強調和暗示尚未完成的工作的重要性，如果有把握，可以提出新的假設和建議。寫作時要圍繞結果內容進行論述，必須緊扣主題，把結論與結果分開，切忌推理過分外延，要大量查閱有關文獻，以及堅持一分為二的觀點。