白及多糖在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用

［收稿日期］2021-02-25;" ［修訂日期］2023-11-23

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81870632）；山東省自然科學基金青年計劃（ZR2019BH004）

［第一作者］張冉冉（1995-），女，碩士。

［通信作者］趙桂秋（1962-），女，博士，教授，博士生導師。E-mail：zhaoguiqiu_good@126.com。彭旭東（1988-），男，博士，副主任醫師，碩士生導師。E-mail：doctorpxd@126.com。

［摘要］" 目的

研究白及多糖（BSP）在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中的抗炎機制，探討BSP對真菌性角膜炎的治療作用。

方法" 建立小鼠煙曲霉菌性角膜炎模型，使用BSP水溶液局部滴眼處理，裂隙燈下觀察感染后第1、3、5天小鼠角膜的炎癥程度，反轉錄-聚合酶鏈反應法檢測小鼠角膜中炎癥因子和模式識別受體Dectin-1的mRNA水平，酶聯免疫吸附試驗和蛋白免疫印跡法檢測炎癥因子和Dectin-1蛋白的表達。

結果" BSP處理的小鼠角膜炎癥評分在感染后第3、5天明顯低于對照組（F=6.64、11.58，P＜0.05）。16 g/L 的BSP水溶液可以降低小鼠角膜中炎癥因子白細胞介素1β、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α以及模式識別受體Dectin-1的mRNA和蛋白表達水平，差異均具有統計學意義（F=2.21～97.39，P＜0.05）。

結論" BSP通過下調炎癥因子水平和抑制模式識別受體Dectin-1的表達在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中發揮抗炎作用。

［關鍵詞］" 白及多糖；煙曲霉菌；角膜炎；炎癥；小鼠

［中圖分類號］" R392.5;R772.22

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0028-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.017

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240319.1459.003;2024-03-21" 14：28：24

Anti-inflammatory effect of Bletilla striata polysaccharides in mice with Aspergillus fumigatus keratitis

＼ ZHANG Ranran， PENG Xudong， ZHAO Guiqiu

＼ （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the anti-inflammatory mechanism of Bletilla striata polysaccharides （BSP） in a mouse model of Aspergillus fumigatus keratitis and the therapeutic effect of BSP on fungal keratitis.

＼ Methods＼ A mouse model of fungal keratitis （FK） was established， and BSP solution was used for local treatment as eye drops. A slit lamp was used to observe the severity of keratitis on days 1， 3， and 5 after infection; RT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of inflammatory cytokines and the pattern recognition receptor Dectin-1 in mouse cornea， and ELISA and Western blotting were used to measure the protein expression levels inflammatory cytokines and Dectin-1.

＼ Results＼ The BSP group had a significantly lower clinical score of corneal inflammation than the control group on days 3 and 5 after infection （F=6.64，11.58，Plt;0.05）. BSP solution at a concentration of 16 g/L significantly reduced the mRNA and protein expression levels of the inflammatory cytokines interleukin-1β， interleukin 6， and tumor necrosis factor-α and the pattern recognition receptor Dectin-1 in mouse cornea （F=2.21-97.39，Plt;0.05）.

＼ Conclusion＼ BSP exerts an anti-inflammatory effect in mice with A. fumigatus keratitis by downregulating the expression levels of inflammatory cytokines and inhibiting the expression of the pattern recognition receptor Dectin-1.

［Key words］＼ Bletilla striata polysaccharide; Aspergillus fumigatus; keratitis; inflammation; mice

真菌性角膜炎（FK）是一種由致病真菌引起的、致盲率極高的感染性角膜病，農業外傷占其致病危險因素的70%～80%［1-2］。藥物治療是應對FK的主要策略，而有限的藥物種類、日漸嚴重的耐藥性等問題，使得研發抗真菌新藥的需求變得愈加迫切。目前，新型抗真菌藥物的研發策略主要包括改造現有臨床常用藥物和發現新靶點藥物兩個方面，從植物提取物中尋找有效抗真菌藥物或增效劑也成為近年來研究的新熱點［3］。白及多糖（BSP）是從中藥白及中提取的一種水溶性多糖，是白及主要的活性成分［4］。中國藥典中記載，白及具有收斂止血、消腫生肌、減輕炎癥、促進組織再生等功能［5］。BSP含有豐富的葡甘聚糖結構，能夠參與細胞內或細胞間的信號傳導，具有增強免疫活性的功能［6］。有實驗研究證實，BSP可以通過介導多種途徑抑制組織中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達水平［7-8］，而這些炎癥因子在FK的感染過程中發揮著重要作用。Dectin-1作為一種模式識別受體（PRRs），在機體受到真菌感染時可以迅速識別病原體進而激活先天性免疫反應［9］。

PRRs表達增加可導致下游炎癥因子水平升高，與FK的進展呈正相關，抑制炎癥反應的過度激活可以減輕角膜組織的損傷，有助于FK的治療［10-12］。BSP在煙曲霉菌性角膜炎中的作用尚未見報道。本研究旨在探討BSP是否通過抑制炎癥分子的表達在煙曲霉菌性角膜炎中發揮抗炎作用。

1" 材料與方法

1.1" 實驗動物與菌種

8周齡SPF級C57BL/6雌鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司，均經過嚴格的生產許可和檢疫。所有實驗動物的操作嚴格按照中國科學技術部制定的實驗動物人道待遇指導與美國眼科和視覺研究協會（ARVO）制定的動物使用原則和標準進行。實驗用煙曲霉菌由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供（NO3.0772）。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 煙曲霉菌菌絲的制備" 將復溫的煙曲霉菌標準菌株接種于Sabouroud瓊脂固體培養基，28 ℃恒溫箱內孵育。待長出少量菌絲后，用無菌接種環刮取孢子及菌絲接種于300 mL滅菌Sabouroud培養液中，用紗布嚴密包扎瓶口，37 ℃、120 r/min搖床培養5～6 d。收集菌絲研磨成均勻混懸液，4 ℃、4 500 r/min離心10 min，棄上清，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次后離心，棄上清，加入不含胎牛血清的DMEM混勻，得到有活性的煙曲霉菌菌絲，然后用細胞計數板計數并調整其終濃度為1×1010 CFU/L，－20 ℃冷凍保存。

1.2.2" FK小鼠模型的建立" 給予C57BL/6小鼠80 g/L水合氯醛腹腔內麻醉，顯微鏡下用無菌手術刀片刮除小鼠右眼角膜中央直徑約2 mm的上皮，缺損區涂抹5 μL煙曲霉菌菌絲，覆蓋角膜接觸鏡，用5-0縫線縫合上下眼瞼。小鼠左眼為空白對照。24 h后拆線觀察建模情況，最終納入72只建模成功且均一的小鼠，隨機分為BSP治療組和PBS對照組（每組36只），分別使用16 g/L的BSP水溶液和PBS每日3次局部滴眼處理。分別于第1、3、5天在裂隙燈下觀察小鼠角膜炎癥程度并拍照記錄，取各組小鼠角膜進行反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）以及蛋白免疫印跡（Western blot）實驗。小鼠角膜炎癥評分及分級參考WU等［13］的研究。

1.2.3" RT-PCR實驗" 取小鼠的角膜組織，加入800 μL的RNA iso plus試劑（TaKaRa，中國大連）提取總mRNA，提取方法參考朱玉楠等［14］的研究。使用核酸濃度分析儀（NanoDrop ND-1000，賽默飛世爾，美國）檢測mRNA的含量以及純度（R值gt;1.6）。根據逆轉錄試劑盒（TaKaRa，中國大連）的說明合成cDNA。取cDNA模板液2 μL，依次加入DEPC水7 μL、SYBR 10 μL（TaKaRa，中國大連）及內參或目的引物1 μL（TaKaRa，中國大連）制成PCR反應液。設置擴增程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃降溫30 s，重復40個循環；95 ℃退火延伸15 s；60 ℃降溫30 s；95 ℃溶解15 s。

反應結束后根據循環數計算各目的基因的相對表達量。所需小鼠引物序列見表1。

1.2.4" ELISA實驗" 取小鼠角膜組織，置于495 μL

PBS中，加入5 μL蛋白酶抑制劑，充分研磨后于4 ℃、以5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。采用鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒（San-

Diego，CA，USA）檢測各組角膜中炎癥因子蛋白的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5" Western blot實驗" 小鼠角膜蛋白的提取方

試劑盒（Elabscience，中國武漢）測定各組小鼠角膜的蛋白濃度并計算上樣量。待測蛋白使用100 g/L丙烯酰胺SDS-PAGE電泳分離并轉移到PVDF膜上，以PBST洗滌液搖洗（50 r/min×5 min）3次，加入Western專用封閉液（beyotime，中國北京）室溫封閉2 h。加入兔抗鼠Dectin-1一抗或者兔抗鼠GAPDH一抗（稀釋比均為1∶1 000，Elabscience，中國武漢）4 ℃孵育過夜。PBST洗滌液搖洗（50 r/min×5 min）3次后將膜與山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶5 000，Elabscience，中國武漢）共同室溫孵育1 h，用ECL發光液（A液∶B液=1∶1，beyotime，中國北京）浸泡10 s后顯影拍照，用Image J軟件定量分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.3" 統計學處理

使用Graphpad Prism7.0 軟件進行統計學分析和處理。各項實驗均獨立重復3次，所得計量資料結果以±s表示。炎癥評分比較采用重復測量設計的方差分析，有兩個影響因素的多組數據之間比較采用析因設計方差分析，單個影響因素的多組數據之間比較采用SPSS-單因素方差分析（One-wayANOVA）。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" BSP對小鼠煙曲霉菌性角膜炎病變程度及臨床評分的影響

感染后第1天BSP治療組小鼠角膜輕度水腫，伴有較小面積灰白色潰瘍灶，與PBS對照組無明顯差異；感染后第3天小鼠角膜潰瘍面積及混濁程度均增加，BSP組角膜病變程度輕于對照組；感染后第5天BSP組小鼠角膜水腫減輕，潰瘍面積明顯減小，而對照組小鼠角膜病變程度較前變化不大，角膜不均勻混濁，且有部分角膜出現后彈力層膨隆（圖1A）。臨床評分結果顯示，煙曲霉菌感染后第1天BSP治療組與PBS對照組評分無明顯差異（F=0.09，Pgt;0.05）；第3天時PBS對照組臨床評分明顯升高，BSP治療組小鼠角膜臨床評分略有升高且顯著低于對照組，差異具有統計學意義（F=6.64，P＜0.01）；第5天時PBS對照組臨床評分較前變化不大，而BSP治療組小鼠角膜臨床評分呈降低趨勢且明顯低于對照組，差異有統計學意義（F=11.58，P＜0.05）（圖1B）。

2.2" BSP對煙曲霉菌性角膜炎小鼠炎癥相關分子mRNA表達的影響

RT-PCR結果表明，隨著時間的進展，小鼠角膜的炎癥因子表達水平呈下降趨勢，但使用BSP處理可以顯著抑制炎癥因子的表達水平（表2）。BSP治療組角膜中IL-1β、IL-6以及Dectin-1的mRNA水平在第3天和第5天明顯低于對照組，差異有統計學意義（F=2.21～10.56，P＜0.05）；BSP治療組TNF-α mRNA水平在第3天明顯低于對照組（F=3.82，P＜0.01），第5天兩組比較差異無顯著意義（F=0.18，P＞0.05）。

2.3" BSP對煙曲霉菌性角膜炎小鼠炎癥相關分子蛋白表達的影響

ELISA結果顯示，感染后第3天，BSP治療組

小鼠角膜中的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白

水平明顯低于PBS對照組，差異有統計學意義（F=19.02～97.39，P＜0.01）。Western blot結果顯示，感染后第3天，BSP治療組小鼠角膜中Dectin-1的蛋白表達水平與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義（F=54.76，P＜0.01）。見表3。

各指標3組間比較，F=19.02～97.39，P＜0.01。與正常組比較，*P＜0.01；與PBS對照組比較，#P＜0.01。

3" 討" 論

BSP作為中藥白及的主要活性成分，具有抗炎、促凝、抗氧化等多種生物學活性［16-18］。黎笑蘭等［7］的研究顯示，BSP通過抑制TLR4/NF-κB信號通路降低潰瘍性結腸炎大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的表達水平，起到保護結腸組織的作用。ZHANG等［8］研究表明，BSP可以抑制MAPK/NF-κB信號通路的激活，降低大鼠胃黏膜組織中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-18的表達。YUE等［19］和LUO等［20］也證實，在體外BSP可以降低炎癥因子IL-6和TNF-α的表達從而減輕組織炎癥損傷程度。抑制真菌生長和控制炎癥反應是臨床上治療FK的主要方法［21］。已有研究表明，BSP具有抑菌和抗炎的雙重作用［6］。本研究結果表明，小鼠角膜炎的病程進展受時間和用藥的雙重影響，感染第3天時角膜炎癥程度達到高峰，BSP可明顯減輕小鼠角膜炎癥的嚴重程度；第5天時，對照組小鼠角膜的臨床評分較前變化不大，部分角膜出現后彈力層膨出等情況，而BSP治療組角膜臨床評分較前減輕，這提示在FK病程早期使用BSP干預可以減少角膜不可逆損害的發生。進一步研究表明，使用BSP治療可以顯著抑制小鼠角膜中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平，在裂隙燈下表現為角膜水腫減輕、潰瘍面積減小。

先天性免疫反應是機體識別和抵抗病原體感染的第一道防線［22-23］，當真菌病原微生物入侵角膜時，機體的免疫系統通過多種PRRs特異性識別并結合病原體相關分子模式快速激活先天性免疫反應，通過分泌炎癥因子及募集免疫細胞，進而清除病原體［24-28］。然而，角膜持續、過度的炎癥反應會加重FK的進展，嚴重時可導致角膜潰瘍穿孔從而損害視功能［10，29-30］。Dectin-1是一種C型凝集素受體，它可以識別真菌細胞壁中的β-葡聚糖結構進而激活機體先天性免疫應答反應［31］，通過觸發炎癥信號轉導通路促進IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達［32-33］，這些炎癥因子的過度表達會引起角膜組織的損傷，導致角膜水腫，加重潰瘍，在FK中適當控制Dectin-1的表達可以起到炎癥保護作用［12，34］。本文研究結果顯示，在小鼠角膜感染煙曲霉菌的第3天，角膜中炎癥分子Dectin-1、IL-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA水平達到最高，與我們前期研究結果一致［35］。而BSP可顯著抑制煙曲霉菌感染小鼠角膜中這些分子的表達，避免了過度炎癥反應對角膜組織造成損傷，通過抗炎機制在煙曲霉菌性角膜炎的治療中起到保護作用。

綜上所述，BSP通過下調炎癥因子水平和抑制PRRs Dectin-1的表達在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中發揮抗炎作用，有望成為治療FK的新型藥物。

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（本文編輯" 劉寧）