腦小血管病血漿外泌體miRNA差異表達(dá)及其意義

［收稿日期］2023-03-08;" ［修訂日期］2023-05-22

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81971111）

［第一作者］王錚（1995-），男，碩士研究生。

［通信作者］馬愛軍（1971-），女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。E-mail：drmaj@qdu.edu.cn。

［摘要］" 目的

探討血漿外泌體miRNA在腦小血管病（CSVD）病人中的表達(dá)譜及臨床應(yīng)用價(jià)值。

方法" 選擇CVSD病人66例和健康體檢者66例血液標(biāo)本，分離血漿外泌體；隨機(jī)選取其中16例CVSD病人和16例健康對照者血漿外泌體進(jìn)行基因芯片檢測構(gòu)建差異表達(dá)的miRNA文庫，對132例樣本行PCR以檢驗(yàn)測序結(jié)果。進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析。

結(jié)果" 基因芯片測序顯示，CVSD病人血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNA共有38個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)18個(gè)，下調(diào)表達(dá)20個(gè)。與健康對照者相比，miR-498、miR-320e、miR-6776、miR-455表達(dá)明顯下調(diào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。CVSD病人血漿外泌體miR-320e的表達(dá)水平較健康對照組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.661，Plt;0.001）。生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)的miRNA的靶基因參與了細(xì)胞凋亡、阿爾茨海默病、FoxO信號通路、Wnt信號通路等生物學(xué)過程。

結(jié)論" CVSD病人血漿外泌體miRNA表達(dá)譜與健康對照者存在明顯差異，miRNA可能通過靶基因及生物信號通路的調(diào)控作用參與了CVSD的發(fā)生與發(fā)展。

［關(guān)鍵詞］" 腦血管障礙；外泌體；微RNAs；生物標(biāo)記；基因組學(xué)

［中圖分類號］" R743.9

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0033-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.033

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240329.0927.002;2024-04-01" 12：08：22

Differentially expressed plasma exosomal miRNAs and their significance in patients with cerebral small vascular disease

＼ WANG Zheng， WANG Yuan， MA Aijun

＼ （Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266001， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the expression profile of plasma exosomal miRNAs and their application value in patients with cerebral small vascular disease （CSVD）.

＼ Methods＼ Blood samples were collected from 66 patients with CVSD and 66 healthy controls， and then plasma exosomes were isolated. Plasma exosomes were randomly selected from 16 patients with CVSD and 16 healthy controls， and gene microarray was used to construct a library of differentially expressed miRNAs. PCR was performed for all 132 samples to verify the results of sequencing. Gene ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis were performed.

＼ Results＼ Gene microarray showed a total of 38 differentially expressed miRNAs in plasma exosomes of CVSD patients， among which 18 were upregulated and 20 were downregulated. Compared with the healthy control group， the patients with CVSD had significantly downregulated miR-498， miR320e， miR-6776， and miR-455. The results of quantitative real-time PCR were consistent with gene microarray results. The patients with CVSD had a significantly downregulated expression level of plasma exosomal miR-320e compared with the healthy control group （t=4.661，Plt;0.001）. The bioinformatics analysis showed that the target genes of differentially expressed miRNAs were involved in the biological processes including cell apoptosis， Alzheimer’s disease， the FoxO signaling pathway， and the Wnt signaling pathway.

＼ Conclusion＼ There is a significant difference in the expression profile of plasma exosomal miRNAs between CVSD patients and healthy controls， and miRNAs may be involved in the development and progression of CVSD through the regulation of target genes and biological signaling pathways.

［Key words］＼ cerebrovascular disorders; exosomes; microRNAs; biomarkers; genomics

腦小血管病（CSVD）是由各種病因引起的影響腦內(nèi)小動脈、微動脈、毛細(xì)血管、微靜脈和小靜脈所致的一系列臨床、影像、病理綜合征，占缺血性卒中的25%～30%，是一類臨床常見的腦血管疾病。衰老、高血壓病史和總膽固醇水平升高是CSVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-2］，常規(guī)降壓、調(diào)脂、抗血小板聚集治療均無法有效改善病人的認(rèn)知及運(yùn)動功能損害［3-4］。由于CSVD起病隱匿、機(jī)制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣，因此迫切需要尋找靈敏度、特異度較高的檢測標(biāo)志物提高其診療水平。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，其長度在20 nt左右，通過與靶基因的3′非編碼區(qū)相結(jié)合，以轉(zhuǎn)錄后修飾的方式發(fā)揮對下游通路的調(diào)控作用，參與多種疾病的進(jìn)程［5-6］。外泌體是直徑在40～100 nm之間、表面含有典型標(biāo)記蛋白的一類細(xì)胞外囊泡［5］，細(xì)胞外miRNA可以富集在外泌體中且受其表面膜的保護(hù)而具有很好的穩(wěn)定性，外泌體包裹的miRNA能影響靶細(xì)胞的生物學(xué)功能和細(xì)胞行為［7］。本研究對CSVD病人外泌體miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討其功能。

1" 資料與方法

1.1" 對象及分組

收集2017年1月—2019年1月我院收治66例CVSD病人（CVSD組）和66例健康體檢者（對照組）的血液標(biāo)本。CVSD病人診斷符合頭顱影像學(xué)上腦損傷的間接征象血管變化的神經(jīng)影像學(xué)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)［8］：①M(fèi)RI表現(xiàn)為血管源性腔隙、血管源性白質(zhì)高信號、腦微出血和血管周圍間隙擴(kuò)大gt;2 mm和腦萎縮；②發(fā)病時(shí)伴有頭昏、疲乏、認(rèn)知改變等臨床癥狀；③年齡gt;40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①明確診斷為心腦血管疾病及嚴(yán)重的頭頸大動脈狹窄、動脈硬化，腦MRI檢查不全者；②血液系統(tǒng)疾病或腫瘤者；③嚴(yán)重肝腎功能不全者。

1.2" 標(biāo)本采集與處理

分別采集病人和健康體檢者清晨空腹靜脈血，裝入15 mL離心管中，4 ℃條件下、1.68×106 r/min離心10 min后，吸取上層淡黃色血漿，加入 PBS 至10 mL體積，4 ℃條件下、1.12×106 r/min離心10 min，棄去管底沉渣，留取上層血漿，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3" 外泌體提取

實(shí)驗(yàn)使用蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific 4485229）以及Total Exosome Precipitation Reagent（REF4484451，Thermo Fisher Scientific公司）試劑盒提取外泌體。按照試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。得到外泌體溶液，立即進(jìn)行下一步操作或者-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4" 外泌體鑒定

使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒追蹤分析技術(shù)對所分離的外泌體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。對外泌體表面蛋白質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5" Western blot法檢測外泌體膜蛋白

將外泌體溶液解凍后取100 μL加入RIPA裂解液，使用BCA試劑盒測蛋白濃度。將蛋白樣品加

入SDS-PAGE（ACE）膠的凹槽中，對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂牛奶的TBST 溶液在室溫下封閉1 h，分別加入CD9、CD63、TSG101 和 GAPDH 一抗，在搖床上振蕩培養(yǎng)1 h，置-4 ℃冰箱中過夜。第2天室溫復(fù)溫后先用TBST 溶液清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后加入酶標(biāo)二抗室溫孵育2 h，再次用TBST 溶液清洗3次，最后使用 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，獲取蛋白條帶圖。

1.6" 外泌體RNA的提取

使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）（Cat. No.217184）試劑盒提取總RNA。將凍存的外泌體溶液融化后，取100 μL加入TRIzol 500 μL 裂解，室溫孵育5 min。加入100 μL氯仿渦旋振蕩后，在室溫下孵育3 min。隨后按試劑盒說明書方法進(jìn)行操作，提取RNA。

1.7" 構(gòu)建RNA文庫

miRNA文庫的構(gòu)建由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技公司協(xié)助，使用Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 （miRNA表達(dá)譜芯片，100 format，902446） 完成。采取每4人一組混檢的方式，CVSD組與對照組每組隨機(jī)選取16例進(jìn)行檢測。

1.8" 差異表達(dá)RNA的驗(yàn)證

根據(jù)基因芯片結(jié)果，選擇4個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)（FC）gt;1.5、Plt;0.05的miRNA （miR-320e、miR-498、miR-455、miR-6776）進(jìn)行驗(yàn)證。采用MiR-X miRNA First-Stand Synthesis Kit（Cat#638313）試劑盒，對 1.3 中提取的細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到 cDNA，用其作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物及其序列見表1。選用RNU6基因作為內(nèi)參，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNAseH Plus）（Cat#RR820A）SYBR Green熒光染料法，以cDNA為模板，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。按試劑盒說明書方法進(jìn)行操作和程序設(shè)定，循環(huán)數(shù)50個(gè)，結(jié)果以2-△△Ct表示。

1.9" 靶基因的預(yù)測及功能分析

通過TargetScan網(wǎng)站（https：//www.targetscan.org）、RNACentral（https：//rnacentral.org）、TarBase V.8（https：//dianalab.e-ce.uth.gr）在線預(yù)測miRNA靶基因，利用Metascape對靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG生物信息學(xué)分析，顯示miRNA的靶基因參與的生物學(xué)過程。

1.10" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0和Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Graphpad、TBools［9］、Metascape［10］軟件繪圖。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 兩組一般資料比較

CVSD病人66例中，男38例，女28例；年齡43～87歲，平均（66.46±10.52）歲；其中高血壓26例，糖尿病9例。對照組66例中，男36例，女30例；年齡47～85歲，平均（63.90±11.63）歲；高血壓21例，糖尿病7例。CVSD組與對照組一般臨床資料比較，差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表2。

2.2" 外泌體形態(tài)

透射電鏡觀察顯示，外泌體形態(tài)呈圓形或橢圓形，直徑30～150 nm（圖1A）。Western blot檢測顯示，外泌體膜表達(dá)標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101（圖1B）。

2.3" 兩組血漿外泌體miRNA的差異表達(dá)

血漿外泌體中miRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，CVSD組血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNA共有38個(gè)（FCgt;1.5，Plt;0.05），其中表達(dá)上調(diào)18個(gè)，表達(dá)下調(diào)20個(gè)（圖2A、B），其分布熱圖見圖2C。

2.4" 差異表達(dá)miRNA的PCR驗(yàn)證

對篩選出的差異表達(dá)miRNA在66例CVSD病人及66例對照者中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片趨勢一致，其中CVSD病人血漿外泌體miR-320e、miR-498的表達(dá)水平較對照組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.661、2.145，Plt;0.05）。見表3。

2.5" 靶基因GO分析與KEGG分析

對差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，KEGG主要富集于代謝通路、PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路、凋亡通路和阿爾茨海默病相關(guān)通路（圖3）。GO富集分析顯示，排前10位的生物信息學(xué)過程分別為Rho GTP酶參與的信號傳導(dǎo)（Rho GTPases、Miro GTPases 和 RHOBTB3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）、肌動蛋白細(xì)胞骨架組織（actin cytoskeleton organization）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路（BDNF signaling pathway）、細(xì)胞對壓力反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of cellular response to stress）、衰老（aging）、細(xì)胞分裂（cell division）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）、內(nèi)膜系統(tǒng)構(gòu)建（endomembrane system organization）（圖4）。

通過Metascape網(wǎng)站（https：//metascape.org）基于STRING6、BioGrid7、OmniPath8、InWeb_IM9數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，得到了蛋白-蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（圖5A）。在PPT網(wǎng)絡(luò)中，通過MCODE算法進(jìn)行量化評估得出3組分值最高的PPI過程，它們分別為多途徑神經(jīng)退行性變（Pathways of neuro-

3" 討" 論

CVSD的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多機(jī)制參與的過程，隨著衰老的自然發(fā)生和各種血管危險(xiǎn)因素的侵襲，

如高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白升高［11］

和氧化應(yīng)激，顱內(nèi)血管的功能逐漸下降，結(jié)構(gòu)完整性

也逐漸喪失。由于神經(jīng)-血管耦聯(lián)現(xiàn)象的存在，參與耦聯(lián)的任何環(huán)節(jié)發(fā)生的功能紊亂都將導(dǎo)致更廣泛的病理改變和臨床癥狀［12］。CVSD通常隱匿進(jìn)展，多數(shù)患有CVSD的病人通常在發(fā)生腦出血或梗死、認(rèn)知能力下降等后果時(shí)才被發(fā)現(xiàn)［13-14］。目前研究已經(jīng)證明，miRNA可以通過靶向調(diào)控mRNA表達(dá)而調(diào)控血管新生和成熟［1］、維持血管壁完整性［2］、調(diào)控細(xì)胞行使各種功能［3］。RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)可以被包裹在外泌體中進(jìn)行傳遞并且不會引發(fā)自身免疫反應(yīng)［6］。

人們可以通過外泌體內(nèi)容物的選擇性包裹或工程化外泌體膜，從診斷和治療等多個(gè)角度對外泌體加以利用［15］。

目前，關(guān)于外泌體和miRNA及其靶基因在CVSD中作用機(jī)制尚不清楚。本研究基因芯片測序結(jié)果顯示，CVSD病人血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNA共有38個(gè)，表達(dá)上調(diào)18個(gè)，表達(dá)下調(diào)20個(gè)，其中miR-668-5p、miR-498、miR-320e等出現(xiàn)了明顯下調(diào)，miR-6089、miR-3665、miR-4466等出現(xiàn)了顯著上調(diào)。miR-320e的靶基因HES2受抑制可以導(dǎo)致Notch信號通路介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移受到抑制，從而干擾血管重塑［16］。ORMDL1基因被認(rèn)為是鞘脂生物發(fā)生的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，是miR-320e的靶基因之一。ORMDL1基因異常將導(dǎo)致嚴(yán)重的脫髓鞘和炎癥過程［17-18］。Wnt基因是miR-320e的靶點(diǎn)之一，Wnt/β-Catenin表達(dá)上調(diào)有利于腦損傷后血管修復(fù)過程［19］，調(diào)節(jié)血管新生和血-腦脊液屏障成熟［20］，但持續(xù)的Wnt/β-Catenin激活也會導(dǎo)致白質(zhì)病變和中樞系統(tǒng)炎癥損傷［21-22］，抑制Wnt/β-catenin信號通路有利于抑制帕金森病模型中成神經(jīng)細(xì)胞瘤的進(jìn)展和減弱軸突變性［23］。因此我們推測，miR-320e可能通過靶向Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮疾病保護(hù)作用。外泌體miR-498可以靶向抑制Prdx4過氧化物酶，Prdx4升高能引起顯著增強(qiáng)的IL-1β依賴性炎癥反應(yīng)［24］，miR-498下調(diào)可能促進(jìn)CVSD的進(jìn)展；miR-320e和miR-498顯著下調(diào)可能導(dǎo)致其對相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制作用缺失，而抑制缺失可能產(chǎn)生的病理改變與已知的CVSD的病理改變相一致。此外，差異表達(dá)文庫中表達(dá)上調(diào)的miR-6087通過靶基因調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡［25］。miR-6087的靶蛋白RhoG的降解或缺失會導(dǎo)致血小板功能的改變是微血管血栓形成的一個(gè)影響因素［26］。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，KEGG顯著富集到細(xì)胞代謝通路、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路、細(xì)胞凋亡、阿爾茨海默病；GO富集顯示，上述差異表達(dá)的miRNA的靶基因廣泛地參與了細(xì)胞對壓力反應(yīng)的調(diào)節(jié)、衰老、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、內(nèi)膜系統(tǒng)構(gòu)建，這些生物學(xué)過程與CVSD的血管壁破壞、血-腦脊液屏障破壞、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、白質(zhì)病變的發(fā)生和進(jìn)展均相關(guān)，這與已知的CVSD病理改變相符。

PPI圖可展示通過異構(gòu)、修飾等作用發(fā)生物理結(jié)合的蛋白質(zhì)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表相應(yīng)生物學(xué)過程，節(jié)點(diǎn)越大，表明參與該生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)越多。本文PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，CCT2、RPS19、OYNLL2、CDK6相互聯(lián)系，并且是與其他蛋白連接的核心蛋白。伴侶蛋白CCT2是一種自噬受體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)聚集蛋白的清除過程，其下調(diào)會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷將破壞腦血管系統(tǒng)的完整性，造成動脈血管僵硬、自主神經(jīng)失調(diào)、神經(jīng)-血管解耦聯(lián)和血-腦脊液屏障損傷，破壞腦血流和局部灌注的動態(tài)平衡，進(jìn)而促進(jìn)CVSD的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，CVSD病人血漿外泌體miRNA表達(dá)譜存在差異，差異表達(dá)譜中miRNA通過其靶基因發(fā)揮維持血管結(jié)構(gòu)完整性、調(diào)節(jié)小血管功能和調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞功能的作用，從而可能在CVSD中發(fā)揮調(diào)控作用。多個(gè)miRNA可能聯(lián)合發(fā)揮作用，miR-320e、miR-498的下調(diào)和miR-6087、miR-3960的上調(diào)可能促進(jìn)CVSD的進(jìn)展，這些miRNA如何參與CVSD的機(jī)制目前尚不清楚。本研究的不足之處：未對CVSD病人近期皮質(zhì)下小梗死、腔隙、微出血、腦萎縮、認(rèn)知功能障礙等臨床表現(xiàn)分型的miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行進(jìn)一步分類檢測。今后研究將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步對本文結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，并深入探討差異表達(dá)miRNA調(diào)控的下游基因在CVSD發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

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（本文編輯" 黃建鄉(xiāng)）