Treacher Collins綜合征1例基因突變分析

［收稿日期］2022-12-05;" ［修訂日期］2023-06-18

［基金項目］國家自然科學基金面上項目（30971586）

［第一作者］王小雨（1996-），女，碩士研究生。

［通信作者］劉世國（1973-），男，博士，主任醫師，博士生導師。E-mail：liushiguo@qdu.edu.cn。

［摘要］ "目的

分析1例Treacher Collins綜合征（TCS）病人的遺傳學改變，探討該病例基因型-表型的關系。

方法" 提取先證者及其父母外周靜脈血全基因組DNA和RNA，利用全外顯子測序（WES）對先證者進行突變篩查，采用Sanger測序在先證者及其父母中進行驗證。

結果" 先證者符合TCS的典型臨床癥狀。基因檢測分析結果顯示，該病例TCOF1基因第18外顯子最后一個堿基發生c.3183Ggt;A（p.Q1061=）突變，但表型正常的父母不存在此突變，因此該突變是一個de-novo遺傳的突變。RNA驗證顯示，先證者與健康人的TCOF1 mRNA水平存在顯著差異（t=-27.488，Plt;0.01）。

結論" TCOF1基因c.3183Ggt;A突變很可能是TCS的致病突變位點。本研究結果有助于了解和完善中國TCS病人的遺傳學基礎。

［關鍵詞］" Treacher Collins綜合征；全外顯子組測序；基因，TCOF1；基因突變

［中圖分類號］" R394

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0043-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.028

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1139.001;2024-03-28" 17：27：24

Gene mutation analysis of a patient with Treacher Collins syndrome

＼ WANG Xiaoyu， SHEN Lu， WANG Fengqi， ZHANG Ru， LIU Shiguo

＼ （Department of Medical Genetics， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To analyze the genetic changes of a patient with Treacher Collins syndrome （TCS） and explore the genotype-phenotype relationship.

＼ Methods＼ The whole-genomic DNA and RNA were extracted from the peripheral venous blood of the proband and her parents. Whole-exome sequencing was used to detect the gene mutations of the proband， followed by verification with Sanger sequencing in the proband and her parents.

＼ Results＼ The proband met the typical clinical symptoms of TCS. A mutation of c.3183Ggt;A （p.Q1061=） was detected at the last base of exon 18 of the TCOF1 gene in this case， but not in her parents with a normal phenotype， indicating a de-novo genetic mutation. The RNA validation analysis showed a significant diffe-

rence （t=-27.488，Plt;0.01） in the TCOF1 mRNA level between the proband and healthy controls.

＼ Conclusion＼ The c.3183-Ggt;A mutation of the TCOF1 gene is the probable pathogenic mutation of TCS. This study is helpful for understanding and improving the genetic basis of Chinese patients with TCS.

［Key words］＼ Treacher Collins syndrome; whole exome sequencing; gene， TCOF1; mutation

Treacher Collins綜合征（TCS，OMIM編號為154500）又稱鳥面綜合征，是一種罕見的先天性顱面部疾病，以下頜骨發育不良、眼瞼裂隙向下傾斜、耳畸形以及眶周異常為主要特征［1］。TCOF1基因突變是導致TCS的重要的原因，該基因位于5q32-5q33.3，編碼Treacle蛋白［2-3］。Treacle蛋白已被研究證明可以調節腦神經嵴細胞的存活和增殖，當TCOF1基因發生突變時，正常的神經嵴細胞會遷移、增加凋亡和減少增殖，這將導致第一咽弓中神經嵴細胞的數量大大減少，從而導致發育異常［4］。本研究通過全外顯子測序（WES）技術和Sanger測序驗證，鑒定了1例TCS病人TCOF1基因的錯義突變，并探究該位點突變對TCOF1基因的表達所造成的影響。

1" 資料和方法

1.1" 研究對象

病人是來自山東省的1例患有TCS的女性，25歲，因有生育要求就診。體格檢查：神志清，精神可，口唇無發紺，皮膚、黏膜色澤正常，無皮疹及出血點，無吞咽及呼吸異常；面骨發育不全，顴骨發育不良，下頜后縮畸形；眉毛稀疏，睫毛內側缺失，下眼瞼雙側對稱性凹陷，下眼瞼裂隙向下傾斜；雙側耳明顯不對稱，右耳外耳畸形，自述對低頻聲音識別不清。病人自述既往行眶下骨及顴骨填充手術和睫毛嫁接

術。病人無兄弟姐妹，否認家族史；父母體健，無明顯TCS癥狀。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會審核批準。

1.2" 研究方法

1.2.1" 外周血DNA、RNA提取" 采集病人及其父母外周靜脈血2～3 mL，同時采集來自山東的健康對照者200例外周靜脈血各3 mL。分別使用DNA、RNA提取試劑盒（天根，中國）提取外周血基因組DNA、RNA。外周血白細胞RNA提取后使用Trizol（Takara，日本）裂解，逆轉錄試劑（諾唯贊，中國）逆轉錄RNA（RNA含量為1 μg）獲得cDNA。

1.2.2" WES" 使用超聲波打斷儀（Covris-S220）將所獲得的DNA在TE緩沖液里片段化、純化后，選擇350～450 bp大小的DNA片段和包含適配序列的DNA片段作為DNA文庫。獲取樣本的DNA文庫后，通過生物素標記探針（80～120 mer）將目的基因富集。采用Illumina NextSeq 500（Illumina，美國）檢測人類全外顯子組中 20 099 個基因的外顯子區域及周圍內含子區域（20 bp），平均測序深度127.55×。使用BWA（bwa-0.7.10）對數據進行預處理，再與人基因組數據庫hg19（GRCh37）進行比對，去除低質量reads和假陽性SNP后進行生物信息學分析。最終的結果應用美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南評估，并應用SIFT等軟件對致病性進行預測。

1.2.3" Sanger測序驗證" 對病人及其父母的DNA經WES分析得到的可疑的致病性基因突變進行Sanger測序驗證。在突變位點周圍約500 bp進行PCR擴增，上下游引物使用Oligo 7.60軟件設計。引物及其序列見表1。

對PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，

得到的條帶應單一且明亮。

將檢測合格的PCR

產物在ABI3730XL測序儀（Applied Biosystems）上進行測序，并與NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的標準序列進行比對，確定突變位點。

1.2.4" RNA驗證" 在可疑致病基因的突變位點附近前后兩個外顯子上設計引物進行實時熒光定量PCR（qPCR），以探究是否存在mRNA的異常。使用引物TCOF1-F2、TCOF1-R2對病人及健康對照的cDNA進行qPCR擴增，反應體系共20 μL，內含：2×qPCR Master Mix（諾唯贊，中國）10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板5.0 μL，ddH2O 4.2 μL。反應條件嚴格按照說明書執行。

1.3" 統計學處理

使用SPSS（R26.0.0.0）軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2" 結" 果

2.1" 遺傳學分析

WES分析顯示，先證者攜帶有一個錯義突變（c.3183Ggt;A，p.Q1061=，NM_001135243.1），該突變位于TCOF1基因的第18外顯子，即該基因編碼cDNA的第3 183位從鳥嘌呤（G）變成腺嘌呤（A）。該位點的突變并沒有造成編碼的谷氨酰胺（Gln）發生改變，但是可能會影響RNA剪切而致病。Sanger驗證顯示，先證者父母在該位點沒有發生突變，而且先證者的父母也沒有出現TCS的臨床表現（圖1），說明這個突變是de-novo遺傳，即不是由父母遺傳所致。該突變在200例健康對照者中均未檢出。

2.2" 生物信息學分析

TCOF1基因錯義突變c.3183Ggt;A為第18外顯子的最后一個堿基發生突變，SpliceAI預測該變異被用作拼接供體的概率增加了0.89。相同堿基位置的c.3183Ggt;T變異為HGMD已收錄的變異，該變異可導致外顯子18跳過，從而導致終止子提前出現，影響蛋白的功能［5］。根據ACMG指南將該突變評為臨床意義未明（PS4_Supporting+PM2_Supporting）。該變異在HGMD數據庫中報道為DM（Disease causing mutation），在InterVar數據庫中報道為Uncertain，但是在Clinvar數據庫中沒有被報道。查詢gnomAD數據庫顯示，該突變在正常人群中的突變頻率為0。

2.3" RNA分析

qPCR結果顯示，與健康對照者相比，TCS病人（先證者）TCOF1 mRNA表達量明顯下降，差異有統計學意義（t=-27.488，Plt;0.01）。見圖2。

3" 討" 論

本研究通過對1例中國TCS病人進行WES以及Sanger測序驗證，發現了一個致病基因錯義突變：TCOF1（c.3183Ggt;A），并對病人的RNA進行了定量分析。該突變不會引起氨基酸發生改變，但是可能會影響剪切。剪切異常導致外顯子序列的丟失，使qPCR的引物無法識別擴增檢測，最終結果顯示mRNA的表達量發生變化。本文病人的父母均未存在該位點的變異，也沒有出現TCS的相關表型，因此認為該變異是de-novo遺傳。該病最早于1846年被THOMSON所描述，隨后在1900年被英國的眼科醫生TREACHER COLLINS命名［6］。BOWMAN等［7］曾經在2012年報道過1例攜帶c.3183Ggt;A雜合突變的TCS病人，遺憾的是他們沒有進行RNA驗證。HORIUCHI等［5］在2005年報道了1例攜帶該變異相同堿基位置的c.3183Ggt;T病人，RNA鑒定顯示該變異造成了外顯子18的跳躍，導致終止密碼子提前出現，影響蛋白的功能。

TCS是一種罕見的先天性顱面部疾病，疾病的嚴重程度因人而異，但是總體上表現為面部骨骼發育不良、外耳或中耳畸形、眼瞼裂隙、眼皮缺損、睫毛缺損、腭裂和牙齒發育不良等［8］。此外，病人通常會因為耳畸形而導致單側及雙側傳導性聽力損失，也有可能會因為面部骨骼（包括上頜骨和下頜骨）的發育不良而導致進食困難和呼吸困難，包括阻塞性睡眠呼吸暫停等。臨床癥狀嚴重的病人在出生后可能會因危及生命的呼吸道損害而必須進行手術治療，甚至會導致胎兒死于圍產期呼吸窘迫等。

TCS的發病率約為1/50 000，其中40%的病例是家族性遺傳所致，其余60%的病例是因為基因的新發突變［9］。既往有研究顯示，TCS具有遺傳異質性，該疾病有4種亞型，即TCS1（OMIM606847）、TCS2（OMIM613715）、TCS3（OMIM248390）以及TCS4（OMIM610060），其發生分別由基因TCOF1、POLR1D、POLR1C、POLR1B突變所致，其中發生頻率最高的是TCOF1，通過常染色體顯性遺傳模式遺傳，占所有病例的86%［10］。

TCOF1基因位于5q32-33.3，以往人們認為完整的TCOF1基因總共有26個外顯子，但是有研究發現了兩個新的外顯子：外顯子6A和外顯子16A，分別位于之前的外顯子6和外顯子7之間、外顯子16和外顯子17之間。

TCOF1編碼一種富含絲氨酸、丙氨酸的蛋白，稱為Treacle蛋白。Treacle蛋白是一種由1 488個氨基酸組成的高度磷酸化的核仁蛋白，分子量為152 000，結構域包括核輸出信號結構域、核定位信號結構域以及包含大量蛋白激酶CK2和蛋白激酶C（PKC）的磷酸化基序［11］。Treacle蛋白廣泛存在于人體大部分組織和器官，在胚胎發育的各個時期均有表達。既往研究表明，TCOF1基因在小鼠胚胎發育過程中的E8.5～9.5時期，即小鼠顱面部發育的關鍵時期表達量最高［12］。

神經嵴細胞的增殖和遷移調節胎兒的顱面骨骼和軟骨的發育，而神經嵴細胞遷移的異常與核糖體生物合成不足密切相關。Treacle蛋白在rRNA的轉錄、核糖體的生物發生和修飾、細胞增殖分裂及防止氧化應激誘導的細胞凋亡中發揮重要作用［13］。此外，有研究表明抑制Treacle蛋白可刺激高度增殖的神經嵴細胞的高水平凋亡，因此早期胎兒的顱面發育異常以及TCS的典型頭面部畸形可能與這些細胞數量減少有關［14］。本文病人的TCOF1基因發生了錯義突變c.3183Ggt;A，導致病人該基因的相對表達量低于健康對照者，可能會影響Treacle蛋白的表達，并且進一步影響神經嵴細胞的增殖與凋亡。然而本研究并未進行功能學驗證，因此只能認為錯義突變c.3183Ggt;A是先證者TCS的高度可疑致病突變。

迄今為止，關于TCS的治療尚未有明確的方案，只能通過早期干預治療來緩解病人的呼吸、進食和聽力等問題。既往研究中，有人提出可以通過抑制p53的功能來減少神經上皮細胞的凋亡［15］。另有研究表明，由于Treacle蛋白在處理氧化應激誘導的神經上皮細胞DNA損傷中發揮重要作用，因此母體給予抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可以部分挽救TCOF1+/-小鼠以及TCOF1 MOs處理的斑馬魚的面部表型，甚至可以阻止TCS發病［1］。然而，目前還沒有任何明確治療機制可以應用于人類TCS的治療上。

畸形的面部外觀導致TCS病人往往會出現審美或者心理問題，從而給病人的生活帶來嚴重的負面影響。除此之外，由于一些TCS病人癥狀較輕，在臨床上與Goldenhar綜合征（OMIM：164210）、Miller綜合征（OMIM：263750）以及Nagar綜合征（OMIM：154400）有相似的表型，因此根據表型進行鑒別診斷的難度加大［16］。因此，基因診斷成為了TCS診斷金標準。隨著技術的發展，二代測序技術具有準確度高以及性價比高等特點，在單基因病的檢測診斷中發揮了重大作用，可為TCS明確診斷提供幫助。

綜上所述，本研究結果證明了TCOF1基因突變位點c.3183Ggt;A具有潛在致病性，豐富了TCS的基因型-表型關系譜，為產前篩查和遺傳咨詢提供了理論依據，有助于疾病的早期分子診斷和治療，為 TCS的進一步研究奠定了基礎。本研究也存在一定的局限性，沒有討論TCS致病機制，需要進一步進行功能學研究。

［參考文獻］

［1］SAKAI D， DIXON J， ACHILLEOS A， et al. Prevention of Treacher Collins syndrome craniofacial anomalies in mouse models via maternal antioxidant supplementation［J］. Nature Communications， 2016，7：10328.

［2］ZENG H S， XIE M Y， LI J B， et al. A novel nonsense mutation in the TCOF1 gene in one Chinese newborn with Treacher Collins syndrome［J］. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology， 2021，141：110561.

［3］YAN Z Q， LU Y， WANG Y F， et al. Identification of a novel TCOF1 mutation in a Chinese family with Treacher Collins syndrome［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2018，16（3）：2645-2650.

［4］CHOU W S， CHEN J S， SHIAO Y M， et al. Prenatally diagnosed microdeletion in the TCOF1 gene in fetal congenital primary Treacher Collins Syndrome［J］. Taiwanese Journal of Obstetrics amp; Gynecology， 2022，61（3）：514-516.

［5］HORIUCHI K， ARIGA T， FUJIOKA H， et al. Mutational analysis of the TCOF1 gene in 11 Japanese patients with Treacher Collins Syndrome and mechanism of mutagenesis［J］. American Journal of Medical Genetics Part A， 2005，134（4）：363-367.

［6］ALJERIAN A， GILARDINO M S. Treacher collins syndrome［J］. Clinics in Plastic Surgery， 2019，46（2）：197-205.

［7］BOWMAN M， OLDRIDGE M， ARCHER C， et al. Gross deletions in TCOF1 are a cause of Treacher-Collins-Franceschetti syndrome［J］. European Journal of Human Genetics， 2012，20（7）：769-777.

［8］LIU J， LIN P， PANG J L， et al. Identification of a novel gross deletion of TCOF1 in a Chinese prenatal case with Treacher Collins syndrome［J］. Molecular Genetics amp; Genomic Medicine， 2020，8（8）：e1313.

［9］DIXON M J. Treacher collins syndrome［J］. Journal of Medical Genetics， 1995，32（10）：806-808.

［10］MARSZAEK-KRUK B A， WJCICKI P， DOWGIERD K， et al. Treacher collins syndrome： genetics， clinical features and management［J］. Genes， 2021，12（9）：1392.

［11］SAKAI D， TRAINOR P A. Face off against ROS： Tcof1/Treacle safeguards neuroepithelial cells and progenitor neural crest cells from oxidative stress during craniofacial development［J］. Development， Growth amp; Differentiation， 2016，58（7）：577-585.

［12］DIXON J， HOVANES K， SHIANG R， et al. Sequence analysis， identification of evolutionary conserved motifs and expression analysis of murine tcof1 provide further evidence for a potential function for the gene and its human homologue， TCOF1［J］. Human Molecular Genetics， 1997，6（5）：727-737.

［13］GRZANKA M， PIEKIEKO-WITKOWSKA A. The role of TCOF1 gene in health and disease： beyond treacher collins syndrome［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（5）：2482.

［14］ULHAQ Z S， NURPUTRA D K， SORAYA G V， et al. A systematic review on Treacher Collins syndrome： correlation between molecular genetic findings and clinical severity［J］. Clinical Genetics， 2023，103（2）：146-155.

［15］LAU M C， KWONG E M， LAI K P， et al. Pathogenesis of POLR1C-dependent Type 3 Treacher Collins Syndrome revealed by a zebrafish model［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2016，1862（6）：1147-1158.

［16］PAGLIA M， GIANI G， PISONI L， et al. Otodental syndrome： case report and differential diagnosis with Treacher Collins syndrome［J］. European Journal of Paediatric Dentistry， 2022，23（1）：58-66.

（本文編輯" 黃建鄉）