EBV相關腫瘤和健康人群BALF2基因序列分析

［收稿日期］2022-12-24;" ［修訂日期］2023-06-11

［基金項目］山東省自然科學基金資助項目（ZR2020MH302）

［第一作者］于彩霞（1996-），女，碩士研究生。

［通信作者］劉雯（1985-），女，博士，講師。E-mail：liu.wen@hotmail.com。

［摘要］" 目的

探討BALF2基因的多態性及其分布特征與EB病毒（EBV）相關腫瘤發生發展的關系。

方法

采用巢式PCR結合DNA測序的方法，對349例EBV陽性標本進行DNA序列分析，利用Lasergene軟件將其與EBV標準株B95-8序列進行比對，并生成系統發生樹，對基因變異型進行分類。

結果" 根據系統發生樹將BALF2分為5個基因型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。其中，BALF2-E在鼻咽癌中的檢出率高于健康人群，中國南方鼻咽癌人群BALF2-E的檢出率高于北方鼻咽癌人群（χ2=10.26，Plt;0.01）。

結論

BALF2基因存在多態性，其變異類型分布與腫瘤類型、地域有關，BALF2-E亞型與鼻咽癌發生相關。

［關鍵詞］" 皰疹病毒4型，人；多態性，單核苷酸；淋巴瘤；胃腫瘤；鼻咽癌

［中圖分類號］nbsp; R373.9;R394.25

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0067-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.027

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1140.002;2024-03-28" 17：25：55

Sequence analysis of BALF2 gene in people with EBV-associated tumors and healthy people

＼ YU Caixia， ZHAO Menghe， XIAO Hua， WANG Yun， LIU Wen

＼ （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the polymorphism of the BALF2 gene and its distribution characteristics and its relationship with the development and progression of Epstein-Barr virus （EBV）-associated tumors.

＼ Methods＼ DNA sequence analysis was performed on 349 EBV-positive specimens using nested PCR and DNA sequencing. Lasergene software was used for sequence alignment of them with the standard EBV strain B95-8 to derive a phylogenetic tree for classification of gene variants.

＼ Results

According to the phylogenetic tree， there were five BALF2 genotypes： BALF2-A， BALF2-B， BALF2-C， BALF2-D， and BALF2-E. The detection rate of BALF2-E was higher in people with nasopharyngeal carcinoma than in healthy people， and higher in southern people with nasopharyngeal carcinoma than in northern people with this disease in China （χ2=10.26，Plt;0.01）.

＼ Conclusion＼ The BALF2 gene is polymorphic， and the distribution of its variants is associated with tumor types and geographic regions. The BALF2-E variant is related to the development of nasopharyngeal carcinoma， especially in the high-incidence areas.

［Key words］＼ herpesvirus 4， human; polymorphism， single nucleotide; lymphoma; stomach neoplasms; nasopharyngeal carcinoma

EB病毒（EBV）屬于皰疹病毒科（γ皰疹病毒亞科），廣泛分布于世界各地，世界上超過90%的人口是EBV攜帶者［1］。EBV感染與上皮惡性腫瘤密切相關，這些腫瘤包括鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻部NK/T細胞淋巴瘤［2-6］。感染早期基因BALF2在病毒DNA復制過程中高度集中于復制小體，并在裂解復制過程中大量地表達［7］。當DNAase在病毒體內與BALF2編碼的分子量135 000大小DNA結合蛋白（mDBP）結合時，核酸外切酶的活性受到抑制，這可能是病毒DNA合成過程中保護DNA免受病毒DNA酶攻擊的病毒自我保護機制［8］。mDBP在不同的皰疹病毒株中具有結構保守性，并且對于已知皰疹病毒例如EBV的裂解復制是絕對必需的［9］。鼻咽癌的發病率呈現明顯的區域性［10］，原因尚不清楚。研究表明，不同來源的EBV毒株具有不同的基因變異，這可能在EBV感染和致病過程中起重要作用。以往對EBV潛伏期基因多態性的研究表明，病毒基因變異具有疾病特異性，如EBER變異體EB-8M在鼻咽癌中起主導作用，且其地理分布存在差異［11］。近期有研究發現，BALF2基因單核苷酸多態位點a162476g和g163364a與鼻咽癌風險高度相關［12］。為進一步研究BZLF2單核苷酸多態性（SNP）與EBV相關腫瘤發生的關系，本研究對359例中國南、北方地區的EBV相關性胃癌（EBVaGC）、淋巴瘤、鼻咽癌以及健康人群咽漱液（TW）樣本進行了EBV BALF2基因的序列分析。

1" 材料與方法

1.1" 樣本和DNA提取

本研究共有349例EBV陽性標本BALF2基因測序成功，其中50例EBVaGC、77例鼻咽癌、55例淋巴瘤以及47例健康人群TW樣本來自青島大學附屬醫院；另一部分樣本包括EBVaGC 4例、鼻咽癌50例、淋巴瘤20例以及46例健康人群TW樣本來自中國南方鼻咽癌流行區，主要由廣東省中山大學第一、第三附屬醫院提供。根據樣本的區域來源和腫瘤類型對標本進行分組并命名：北部EBV相關胃癌（NG），北部淋巴瘤（NL），北部鼻咽癌（NN），北部健康人群TW樣本（NT）；南部EBV相關胃癌（SG），南部淋巴瘤（SL），南部鼻咽癌（SN），南部健康人群TW樣本（ST）。本研究經青島大學醫學院醫學倫理委員會批準，所有參與者均知情同意。本研究中EBV陽性相關腫瘤標本均經EBV編碼的小RNA 1（EBER-1）原位雜交鑒定，腫瘤細胞中出現EBER-1陽性信號為EBV陽性樣本［13］。

采用傳統的苯酚-氯仿方法和蛋白酶K消化方法從新鮮腫瘤組織（胃癌組織）和TW樣品中提取DNA。使用QIAamp DNA FFPE組織提取試劑盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）從石蠟包埋腫瘤組織（鼻咽癌和淋巴瘤組織）中提取DNA。將提取的DNA -20 ℃保存直至實驗完成。

1.2" 聚合酶鏈式反應（PCR）擴增

采用巢式PCR法擴增BALF2的特定區域，該區域由兩部分組成：第一部分是核苷酸162145-162562，用于擴增的引物是BALF2-1～BALF2-8；第二部分是核苷酸163111-163508，用于擴增的引物是BALF2-5～BALF2-4。引物及其序列見表1。第一次PCR的總體積為10 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 μg/L），上游引物和下游引物各0.5 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）5 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，循環35次；最后72 ℃延伸2 min。取第一次擴增產物2 μL為模板，進行第二次PCR，總體積為20 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 mg/L），上游引物和下游引物各1 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）10 μL。第二次擴增條件與第一次擴增條件相同。每次PCR均設置EBV陽性細胞B95-8為陽性對照，EBV陰性細胞Jurkat為陰性對照，以及空白對照。取PCR擴增產物3 μL進行瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。經過兩輪PCR擴增，最終產物大小分別為418 bp和398 bp。使用Lasergene軟件將其剪接成816 bp的片段。

1.3" PCR產物的序列分析

取上述PCR產物25 μL送往北京華大基因生物工程技術服務有限公司進行全長測序。獲得序列信息后，用Chromas軟件查看峰圖，Lasergene軟件中的Clastal W對基因序列與EBV標準株B95-8序列進行對比分析，并繪制系統發生樹［14］，對基因變異型進行分類。

1.4" 統計學分析

使用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，數據間比較應用χ2檢驗和Fisher精確檢驗分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" BALF2基因序列變異分析

對349例EBV陽性樣本進行BALF2測序及多態性分析顯示，所有標本的測序峰圖中同一核苷酸位點均未發現雙峰，均為單一BALF2序列。與B95-8參考序列相比較，在349例樣本中鑒定出43個代表性核苷酸序列（圖1）。根據系統發生樹，將其分為5種亞型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。見圖2。

本文33例樣本的核苷酸序列與標準株B95-8的核苷酸序列一致，其中包括2例NT、26例ST、4例SN和1例SL。ST4中發現一個氨基酸突變（S647R），SN35中發現一個同義突變（g162246a）。96例樣本（18例NT、25例NG、28例NN、19例NL、3例ST、2例SN、1例SL）中只有一個同義突變（g162273a）。以上這些與B95-8標準株具有相同BALF2氨基酸序列或者散在突變的分離株被稱為BALF2-A。

本文97例樣本中同時有4個共有同義突變c163293t、t163377c、a163458g、a163482c，包括18例NT、20例NG、12例NN、20例NL、7例ST、1例SG、5例SN以及14例SL，上述分離株被歸類為BALF2-B。

本文在7例樣本中同時發現了兩個同義突變a163458g、a163482c，其中5例鼻咽癌存在一個共有同義突變c163464t，其中1例來自中國南方，4例來自中國北方。這7個樣本被認為是BALF2-C型。

另外，在18例樣本中發現了11個散在無規律突變，包括g162215t、g162237c、c162464t、a162476g、g162507a、c163287t、c163293t、g163364a、t163377c、g163404t、c163464t，其中的3個突變位點g162215t、a162476g以及g163364a具有氨基酸的改變，包括V317M，I613V和V700L，其余突變位點是同義突變。這18個樣本序列被命名為BALF2-D。

在89例標本中檢測到同時存在的3個同義突變t163377c、a163458g、a163482c，NT 3例、NG 2例、NN 30例、NL 9例、ST 5例、SG 3例、SN 34例、SL 3例。其中78例樣本存在另外3個同義突變c163287t、g163404t、c163422a，根據系統發生樹，將它們統一分類到同一簇中并將其稱為BALF2-E。

2.2" 中國南方和北方樣本中BALF2變異型分布

不同地區EBVaGC病人、鼻咽癌病人、淋巴瘤病人和TW中5種不同BALF2基因型的頻率見表2。NG、NN、NL和NT中BALF2-E的頻率分別為4.00%、38.96%、16.36%和6.38%，SG、SN、SL和ST中BALF2-E的頻率分別為75.00%、68.00%、15.00%和10.87%，SN病人的BALF2-E檢出率高于NN病人（χ2=10.26，Plt;0.01）。

BALF2-A在NN和NL中的頻率分別為37.66%

和40.00%，在SN和SL中的頻率分別為14.00%和10.00%。NN組BALF2-A的檢出率高于SN組（χ2=8.357，Plt;0.01），NL組高于SL組（χ2=6.066，Plt;0.05）。NT和SL病人的BALF2-B檢出率明顯高于ST和NL病人，差異有統計學意義（χ2=6.301、6.696，Plt;0.01），提示淋巴瘤和健康人

群中BALF2-B檢出在北方和南方地區有顯著差異。

2.3" BALF2在惡性腫瘤和健康人群中的變異型分布比較

BALF2基因型在中國南北部地區EBVaGC、鼻咽癌、淋巴瘤和健康對照中的分布比較顯示，NN與健康對照中BALF2-E分布差異有顯著性（χ2=15.860，Plt;0.001），而淋巴瘤、EBVaGC與健康人群中BALF2-E的分布差異無顯著性（P＞0.05），來自南方的樣本顯示出相同的變異模式。對淋巴瘤、EBVaGC、鼻咽癌和健康人群進行統計學分析發現，在我國南方健康人群BALF2-A的檢出率高于淋巴瘤、鼻咽癌（χ2=17.016、26.533，Plt;0.01）。中國北方地區健康人群BALF2-B檢出率明顯高于鼻咽癌（χ2=26.533，Plt;0.01）。南方地區健康對照組BALF2-B的檢出率低于淋巴瘤（χ2=19.283，Plt;0.01）。在中國北方，鼻咽癌BALF2-C檢出率高于EBVaGC（χ2=15.860，Plt;0.01）。見表2。

3" 討" 論

對于BALF2基因，以往文獻顯示其a162476g

和c163464t位點突變見于80.00%以上的鼻咽癌樣本［12］。本實驗對淋巴瘤和EBVaGC分析結果未發

現a162476g和g163364a突變與其發生發展有關。

此外，本研究還發現了V341I、V344I和Y619N氨基酸變異，但變異只存在于少數樣本中。3個多態性位點g162273a、a163458g和a163482c均未在既往研究中發現。在193例樣本中檢測到a163458g和a163482c的聯合突變，這兩個同義突變同時存在于BALF2-B、BALF2-C和BALF2-E中。因此，推測BALF2蛋白的第277位和第285位氨基酸可能具有一定的相關性。還需要進一步研究。

有研究表明，EBV編碼的LMP1基因變異與EBVaGC、淋巴瘤和鼻咽癌的發生有關。然而，也有研究發現鼻咽癌病人與正常人群中EBV編碼的LMP1基因檢出率差異無統計學意義，但存在區域相關性。因此，EBV編碼基因變異是僅存在區域差異還是參與EBV相關腫瘤的發生仍存在爭議。本研究結果顯示，BALF2的基因型在中國南北部地區的分布是不同的，南方地區鼻咽癌BALF2-E檢出率高于北方地區；在中國南方樣本中，EBV相關腫瘤和健康對照組的BALF2基因型差異也有顯著性；SN病人BALF2-E檢出率顯著高于健康對照。推測BALF2-E可能是鼻咽癌的危險因素，尤其與南方鼻咽癌相關。本文由于南方EBVaGC樣本數量較少，為了保證實驗結果的準確性，沒有對其進一步分析，這是本實驗的一個缺陷。然而，本研究結果仍可為BALF2基因多態性的區域性分布提供一些實驗依據。

鼻咽癌等EBV相關腫瘤的發生與EBV感染密切相關，但華南地區鼻咽癌的發病率明顯高于華北地區，這可能受到環境等多種因素的影響［15］。本文研究結果顯示，中國NN中BALF2-E基因型檢出率顯著高于健康對照組，南方地區鼻咽癌病人中該基因型的檢出率也顯著高于北方地區鼻咽癌病人。因此，BALF2基因型分布特征可能與環境、飲食因素一起導致南方地區鼻咽癌的高發病率。然而，由于本研究僅限于BALF2基因多態性分析，需要進一步研究其生物學功能和相關信號通路，以闡明BALF2基因在鼻咽癌發生發展中的作用。

綜上所述，BALF2在我國南北方EBV陽性腫瘤樣本和EBV陽性TW樣本中分為5種基因型，BALF2基因多態性分布具有地區特異性。南北方地區鼻咽癌組織中BALF2-E的檢出率明顯高于健康對照組，這可能與EBV相關腫瘤的發生有關。

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（本文編輯" 黃建鄉）