基于HIF-1α/EGFR/MAPK1信號通路探討龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠的保護作用

劉卓琳 馮芷瑩 王康宇 黃家望 時佳寧 張成 李玲 何清湖

本文引用： 劉卓琳， 馮芷瑩， 王康宇， 黃家望， 時佳寧， 張? 成， 李? 玲， 何清湖.基于HIF-1α/EGFR/MAPK1信號通路探討龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠的保護作用[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報， 2024， 44（4）： 572-579.

〔摘要〕 目的 探討龜鹿二仙膠調控缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）/和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）信號通路對少弱精子癥（oligoasthenozoospermia，OAS）大鼠的保護作用。方法 將48只SD雄性大鼠隨機分為正常組，模型對照組，龜鹿二仙膠低劑量（0.65 g/kg）組、中劑量（1.25 g/kg）組、高劑量（2.5 g/kg）組和左卡尼汀組，每組8只。除正常組外，其他組均采用腺嘌呤灌胃給藥進行造模。造模成功后進行灌胃給藥進行干預，連續(xù)給藥4周，記錄大鼠一般情況，給藥4周后進行取材處理。腹主動脈采血，ELISA法檢測血清睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）和催乳素（prolactin，PRL）;分離腎組織，計算腎指數(shù);分離右側附睪，運用自動精子分析儀檢測各組大鼠精子濃度和精子活力;HE染色觀察睪丸組織病理改變;用試劑盒檢測大鼠睪丸組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平;免疫組化檢測大鼠睪丸組織HIF-1α、EGFR和MAPK1的蛋白表達。結果 與模型對照組相比，不同劑量的龜鹿二仙膠均可顯著增加大鼠的體質量（P<0.01），降低大鼠的腎指數(shù)（P<0.01），提高精子濃度和精子活力（P<0.01），改善大鼠的精子質量，并能有效減輕模型大鼠睪丸組織損傷程度，其中與龜鹿二仙膠低劑量組相比，龜鹿二仙膠高劑量組大鼠體質量、精子密度和精子活力均顯著上升（P<0.05）。ELISA結果顯示，與模型對照組相比，不同劑量龜鹿二仙膠能顯著升高T和E2水平（P<0.05），且顯著降低FSH、LH和PRL水平（P<0.05）。ROS、SOD和GSH-Px檢測結果顯示，與模型對照組相比，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組ROS水平顯著降低（P<0.05），龜鹿二仙膠中、高劑量組和左卡尼汀組SOD和GSH-Px活性顯著升高（P<0.05）。免疫組化結果顯示，與模型對照組相比，龜鹿二仙膠中、高劑量組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織HIF-1α、EGFR、MAPK1水平顯著降低（P<0.05）。結論 龜鹿二仙膠可能是通過HIF-1α/EGFR/MAPK1信號通路調節(jié)氧化應激來改善OAS。

〔關鍵詞〕 少弱精子癥;龜鹿二仙膠;HIF-1α/EGFR/MAPK1信號通路;精子活力;氧化應激

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.007

Protective effects of Guilu Erxian Glue on rats with oligoasthenospermia based on HIF-1α/EGFR/MAPK1 signaling pathway

LIU Zhuolin1， FENG Zhiying2， WANG Kangyu2， HUANG Jiawang1， SHI Jianing2，?ZHANG Cheng1， LI Ling2*， HE Qinghu3，4*

1. College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. College of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Andrology Laboratory， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. College of Chinese Medicine，?Hunan University of Medicine， Huaihua， Hunan 418000， China

〔Abstract〕 Objective To explore the protective effects of Guilu Erxian Glue （GLEXG） on rats with oligoasthenospermia （OAS） by regulating the hypoxia inducible factor-1α/epidermal growth factor receptor/mitogen-activated protein kinase 1 （HIF-1α/EGFR/MAPK1） signaling pathway. Methods Forty-eight male SD rats were randomized into normal， model control， low-dose GLEXG （0.65 g/kg）， medium-dose GLEXG （1.25 g/kg）， high-dose GLEXG （2.5 g/kg）， and L-carnitine groups， with eight rats in each group. All groups except the normal group were administered adenine by gavage to create the model After successful modeling， the rats were intervened by intragastric administration for continuous four weeks， during which the general condition of the rats was recorded. After four weeks of administration， the rats were processed for sample collection. Blood was collected from the abdominal aorta. Serum testosterone （T）， estradiol （E2）， follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH）， and prolactin （PRL） levels were measured by ELISA. Renal tissues were separated to calculate the renal index. The right epididymis was separated， and the sperm concentration and motility of each group were checked by automatic sperm analyzer. The pathological changes of testicular tissue were observed by HE staining. Reactive oxygen species （ROS）， superoxide dismutase （SOD）， and glutathione peroxidase （GSH-Px） levels in rat testicular tissue were examined by respective assay kits. Protein expressions of HIF-1α， EGFR， and MAPK1 in rat testicular tissue were checked by immunohistochemistry. Results Compared with the model control group， different doses of GLEXG significantly increased the body mass of rats （P<0.01）， decreased their renal index of rats （P<0.01）， improved sperm concentration and motility （P<0.01）， thereby enhancing the sperm quality of rats and effectively reducing the degree of testicular tissue damage in the model rats. Compared with the low-dose GLEXG group， the high-dose group showed significant increase in body mass， sperm density， and sperm motility （P<0.05）. ELISA results showed that compared with model control group， different doses of GLEXG significantly increased T and E2 levels （P<0.05）， and significantly decreased FSH， LH， and PRL levels （P<0.05）. The results of ROS， SOD， and GSH-Px indicated that compared with the model control group， ROS levels in low-， medium-， and high-dose GLXEG groups were significantly lower （P<0.05）， while SOD and GSH-Px activities in medium- and high-dose GLXEG， and L-carnitine groups were significantly higher （P<0.05）. Immunohistochemical results showed that compared with the model control group， the levels of HIF-1α， EGFR， and MAPK1 in rat testicular tissue of medium-， high-dose GLXEG and L-carnitine groups were significantly lower （P<0.05）. Conclusion GLEXG may improve OAS by regulating oxidative stress through HIF-1α/EGFR/MAPK1 signaling pathway.

〔Keywords〕 oligoasthenospermia; Guilu Erxian Glue; HIF-1α/EGFR/MAPK1 signaling pathway; sperm motility; oxidative stress

近年來，我國先后實施了單獨二孩、全面二孩、三胎開放政策，但是全國總和生育率仍然呈現(xiàn)出逐年緩慢下降的趨勢，并未隨之上升[1]。除經濟和社會發(fā)展等方面的客觀因素外，男性不育癥是生育率降低的重要影響因素之一，而不育癥中少弱精子癥又占了約3/4的比例[2-3]。

少弱精子癥（oligoasthenozoospermia，OAS）是指精子濃度<15×106/mL或精子總數(shù)<39×106/mL和精子總活動力<40%或前向運動率<32%，以精子數(shù)量及活力降低為主要特征，是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一，其發(fā)生率占男性不育患者的70%左右[4]。OAS的發(fā)病原因十分復雜，包括附睪等器官的炎癥引起精漿變異、精索靜脈曲張、微量元素缺乏、睪丸發(fā)育受阻、精液量不足以及體內產生抗精子抗體等病因[5]。目前OAS主要通過促性腺激素、雌激素受體調節(jié)劑、芳香酶抑制劑、維生素和補充劑等化學藥物進行治療，一般以經驗性治療為主，治療上存在不良反應、療效不確切等問題，具有一定局限性[6]。氧化應激是一種由氧和活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）引發(fā)的細胞損傷增加相關的狀態(tài)，已經是全球公認的導致男性不育癥的一個至關重要的原因。過量的ROS會導致機體內抗氧化防御機制的失衡，從而引發(fā)氧化應激，造成精子數(shù)量和精子活力的下降，甚至喪失[7-9]。

中藥在改善OAS的精子質量方面顯示出了其獨特的優(yōu)勢，可改善全身新陳代謝，協(xié)調神經與內分泌、生殖系統(tǒng)功能，近年來已引起國內外學者的廣泛關注[10-11]。基于OAS的主要病機是腎氣虛弱、精血不足，其治療主旨也基本圍繞補腎進行。本課題組前期研究[12-14]表明，龜鹿二仙膠能較為明顯改善OAS大鼠的生精細胞活性，恢復睪丸支持細胞的分泌功能，提高大鼠的生精功能，提高精子的質量和數(shù)量。龜鹿二仙膠最早由《醫(yī)便》記載，主要由龜甲、鹿角、枸杞子、人參4味中藥成分組成，具有益氣壯陽、滋陰填精的功效，是一種改善男性生殖功能障礙的經典方劑，在臨床應用中對腎精不足型精液異常患者的治療取得了令人滿意的效果[15]。但目前關于龜鹿二仙膠治療OAS的研究尚少，且分子機制尚不明確，基于此，本研究建立OAS大鼠模型，觀察腺嘌呤處理后的OAS大鼠睪丸組織病理變化及氧化應激情況，探討龜鹿二仙膠對OAS的保護作用和機制，以期為龜鹿二仙膠治療OAS提供實驗依據(jù)和基礎。

1 材料

1.1? 動物來源

SPF級SD大鼠，雄性，48只，體質量220～240 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，質量許可證號為430727221102014186，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房。飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度30%～70%，動物照度15～20 lx。本實驗經湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查通過，批號為LLBH-202212060003。

1.2? 藥物

龜鹿二仙膠由龜甲膠（湖南東健藥業(yè)有限公司，批號：20170901，國藥準字：Z43020570）、鹿角膠（湖南東健藥業(yè)有限公司，批號：20160903，國藥準字：Z43020572）、枸杞子（恒修堂藥業(yè)有限公司，批號：2110027，執(zhí)行標準：《中華人民共和國藥典》2020年版一部）、人參（湖南三湘中藥飲片有限公司，批號：2020071606，執(zhí)行標準：《中華人民共和國藥典》2015年版一部）組成;左卡尼汀口服溶液（東北制藥集團股份有限公司，批號：191041，國藥準字：H19990372）。

1.3? 試劑

腺嘌呤（批號：C10233004）、阿拉伯膠（批號：A889414）均購自上海麥克林公司;烏拉坦（上海源葉生物公司，批號：Z17J10Y93206）;大鼠睪酮（testosterone，T）ELISA試劑盒（批號：NM0480TH0135）、雌二醇（estradiol， E2） ELISA試劑盒（批號：NM05BP6R1717）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒（批號：NM0784604866）、促黃體生成激素（lutei?nizing hormone，LH）ELISA試劑盒（批號：NM06TFBN3282）、催乳素（prolactin，PRL）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R3006）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）比色法測試盒（批號：NM01T?LZP7845）、ROS熒光法測試盒（批號：KL054B-046842）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）比色法測試盒（批號：E-BC-K096-M）、山羊抗兔IgG（H+L）（批號：AK02R0448813）均購自武漢伊萊瑞特公司;HIF-1α抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：080221），稀釋倍數(shù)均為1∶100;ERK1/2抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：51068-1-AP），稀釋倍數(shù)均為1∶20 000;MAPK1（美國Abcam公司，批號：ab32081），稀釋倍數(shù)均為1∶2 000。

1.4? 儀器

自動精子分析儀（南寧松景天倫生物科技有限公司，型號：邁朗ML-800III.型）;多功能酶標儀（美國 Bio-Tek，型號：Synergy HTX）;透射電子顯微鏡（日本日立公司，型號：HT7800）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號：DNP-9166B6S）;高速冷凍離心機（貝克曼庫爾特美國股份有限公司，型號：Microfuge 20R）;電熱恒溫水浴鍋（常州市國旺儀器制造有限公司，型號：DK-8D）;石蠟切片機（德國徠卡儀器有限公司，型號：02387）。

2 方法

2.1? 龜鹿二仙膠的制備

參考《醫(yī)便》《醫(yī)方考》《張氏醫(yī)通》，以龜甲膠∶鹿角膠∶枸杞子∶人參=4∶8∶3∶2的比例制備水煎劑。首先取相應比例的鹿角膠和龜板膠進行烊化，同時取相應比例的枸杞子和人參以蒸餾水煎煮，然后將兩者混合后煎煮成相應濃度藥液，0～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 動物模型制備和分組

將大鼠隨機分為正常組（8只）和造模組（40只）。參考YU等[16]的方法，結合預實驗結果，先將助溶劑阿拉伯膠干粉與腺嘌呤干粉按1∶10比例充分攪拌后用純水配制成混懸液。模型組大鼠每天灌胃給予300 mg/kg腺嘌呤，正常組大鼠給予純水，連續(xù)4周，評估大鼠OAS模型是否成功建立。

模型建立成功后，將造模組大鼠隨機分為5組：模型對照組，龜鹿二仙膠低劑量（0.65 g/kg）、中劑量（1.25 g/kg）組、高劑量（2.5 g/kg）組和左卡尼汀組。按照動物體表面積換算法，大鼠左卡尼汀臨床給藥劑量為0.323 g·kg-1，龜鹿二仙膠低、中、高劑量分別為0.65、1.25、2.5 g·kg-1（相當于臨床成人等效劑量的0.5、1、2倍），正常組和模型對照組給予等量純水，連續(xù)灌胃4周后處理動物，收集樣本備用。

2.3? 大鼠一般情況觀察

觀察大鼠的一般情況，包括毛發(fā)、活動度以及精神狀態(tài)等方面。并在造模前和取材前，對大鼠體質量進行記錄。

2.4? 大鼠腎指數(shù)計算及精子質量檢測

末次灌胃24 h后，以20%烏拉坦6 mL·kg-1腹腔注射麻醉，行腹主動脈采血，采血完畢后分別從大鼠腹腔和陰囊下方用鑷子快速夾住結締組織，分離腎組織、睪丸與附睪及其周圍的脂肪、血管、韌帶等其他組織，將腎組織并稱重，計算腎指數(shù)，腎指數(shù)=大鼠處死時雙側腎質量（mg）/大鼠處死前體質量（g）。將右側附睪取出用PBS沖洗后置于1 mL預熱的精子獲能液中，眼科剪充分剪碎后用移液槍輕輕吹打，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 min，使精子游離出來，精子懸液按1∶24的比例稀釋，取10 μL精子懸液于精子計數(shù)板中，用自動精子分析儀檢測精子密度和活動率。

2.5? 大鼠血清性激素水平檢測

大鼠麻醉后，于腹主動脈采血約8 mL置于采血管中，將其編號，靜置2 h后于3000 r·min-1（1006.2×g）條件下離心15 min，抽取上清液（即血清），按照ELISA試劑盒說明書檢測血清性激素（T、E2、FSH、LH、PRL）水平。

2.6? 睪丸組織氧化應激水平測定

以“2.4”同樣方法取出右側睪丸組織。（1）根據(jù)ROS測定試劑盒說明書選取新鮮大鼠睪丸組織制備單細胞懸液，用300目尼龍網過濾除去組織團塊，收集濾過細胞，滴加稀釋好的DCFH-DA工作液（1∶1000），37 ℃避光孵育1 h，1 000×g離心10 min除去未進入細胞內的DCFH-DA，洗滌3次后于熒光酶標儀下檢測（Ex/Em=500 nm/525 nm）;（2）根據(jù)SOD測定試劑盒說明書選取新鮮大鼠睪丸組織制備10%勻漿上清液，生理鹽水稀釋100倍后取20 μL按試劑盒說明書操作表操作，37 ℃孵育20 min，于酶標儀下檢測（450 nm處讀數(shù)）;（3）根據(jù)GSH-Px測定試劑盒說明書選取新鮮大鼠睪丸組織，制備10%勻漿上清液，生理鹽水稀釋60倍后按試劑盒說明書進行酶促反應和顯色反應操作，充分混勻后靜置5 min，于酶標儀下檢測（412 nm處讀數(shù)）。

2.7? 睪丸組織HE染色

以“2.4”項同樣方法取出右側睪丸，用PBS沖洗后放入多聚甲醛固定，切片備用。60 ℃烤片1～2 h，切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中10 min，2次，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇中每級放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min;蘇木素染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍;伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗;梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min（或者直接把片子烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.8? 睪丸組織免疫組化

用4%多聚甲醛固定大鼠睪丸組織，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸漬蠟，石蠟切片，脫蠟，抗原提取，一級抗體孵育，PBS洗滌3次，滴加二級抗體，30 min后洗滌，滴加鏈霉素-親和素-生物素復合物，30 min之后洗滌，加入DAB溶液進行顯色，30 min后洗滌，蘇木精復染，然后脫水，透明，密封，在顯微鏡下觀察睪丸組織染色，染色呈棕黃色，為陽性，使用Image Pro Plus 6.0分析圖像信號并計算每個視野的平均光密度值（IOD/面積）。

2.9? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組比較，方差齊采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法;方差異質采用Mann-Whitney U檢驗比較兩組間的差異。定量數(shù)據(jù)采用秩和檢驗進行分析，多樣本比較采用完全隨機設計。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠一般情況及腎指數(shù)的影響

與正常組比較，模型對照組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)暗淡無光澤、伴脫落，并且精神萎靡不振，蜷縮于角落等情況，同時伴隨體質量顯著下降（P<0.01），腎指數(shù)顯著上升（P<0.01）。與模型對照組比較，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和左卡尼汀組大鼠毛發(fā)枯萎黯淡程度稍減輕，活動度和精神狀態(tài)改善，體質量均顯著上升（P<0.01），且腎指數(shù)均顯著下降（P<0.01），其中與龜鹿二仙膠低劑量組相比，龜鹿二仙膠中、高劑量組大鼠體質量顯著升高（P<0.05）。詳見圖1A—1B。

3.2? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠精子質量的影響

與正常組比較，模型對照組大鼠精子密度和精子活力均明顯下降（P<0.01）。與模型對照組比較，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和左卡尼汀組大鼠精子密度和精子活力均顯著升高（P<0.01）。龜鹿二仙膠組間比較發(fā)現(xiàn)，高劑量組較低劑量組大鼠精子密度和精子活力顯著升高（P<0.05）。詳見圖1C—1D。

3.3? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠睪丸組織病理組織形態(tài)的影響

HE染色顯示，模型對照組大鼠睪丸曲細精管輪廓塌陷、萎縮、變形、不呈橢圓形，生精小管上皮明顯變薄，各級生精細胞排列紊亂稀疏，數(shù)量明顯減少，管腔內精子明顯減少。龜鹿二仙膠治療可以顯著改善睪丸組織的這些病理損傷，其中高劑量組大鼠的病理損傷改善效果更好。詳見圖2。

3.4? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠性激素水平的影響

與正常組相比，模型對照組大鼠T和E2水平顯著降低（P<0.01），F(xiàn)SH、LH和PRL水平顯著升高（P<0.01）;與模型對照組相比，龜鹿二仙膠治療組和左卡尼汀組大鼠T和E2水平顯著升高（P<0.01），F(xiàn)SH、LH和PRL水平顯著下降（P<0.01）。與左卡尼汀組相比，龜鹿二仙膠中、低劑量組大鼠T和E2水平顯著下降（P<0.01），龜鹿二仙膠高劑量組大鼠T水平顯著下降（P<0.05），龜鹿二仙膠高、中、低劑量組大鼠FSH、LH和PRL水平顯著上升（P<0.05）。詳見圖3。

3.5? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠睪丸組織氧化應激水平的影響

與正常組相比，模型對照組ROS水平顯著升高（P<0.05），SOD和GSH-Px活性顯著降低（P<0.01）;與模型對照組相比，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組ROS水平顯著降低（P<0.01），龜鹿二仙膠中、高劑量組和左卡尼汀組SOD和GSH-Px活性顯著升高（P<0.01），龜鹿二仙膠低劑量組差異無明顯統(tǒng)計學意義;與左卡尼汀組相比，龜鹿二仙膠高劑量組大鼠ROS水平顯著降低（P<0.01），SOD、GSH-Px水平顯著升高（P<0.01），龜鹿二仙膠低劑量組大鼠SOD和GSH-Px水平顯著降低（P<0.05）。詳見圖4。

3.6? 龜鹿二仙膠對少弱精子癥大鼠睪丸組織HIF-1α、EGFR和MAPK1蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與正常組大鼠睪丸組織相比，模型對照組大鼠睪丸組織中HIF-1α、EGFR、MAPK1表達水平升高（P<0.05）;與模型對照組相比，龜鹿二仙膠中、高劑量組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織HIF-1α、EGFR、MAPK1水平顯著降低（P<0.05），龜鹿二仙膠低劑量組差異無明顯統(tǒng)計學意義。詳見圖5。

4 討論

OAS病因復雜，目前病因及發(fā)病機制尚不明確，但據(jù)相關資料顯示，近年來其發(fā)病率逐年升高且可能呈持續(xù)增加的趨勢，給患者的身心造成了極大的傷害和負擔，同時嚴重影響了患者的生活質量[17]。中醫(yī)學認為OAS與古籍中“精少”“精冷”“精清”類似，其主要病機多為腎中精氣受損，致腎陰、腎陽平衡失調，從而形成陰陽俱損的表現(xiàn)[18]。中藥在治療男性不育癥方面具有令人滿意的效果，且中藥具有便于服用、患者依從性好、不良反應少、價格成本相對低、不易產生耐藥性等特點，同時中藥具有多成分、多靶點、多途徑、協(xié)同作用的優(yōu)勢。龜鹿二仙膠作為陰陽并補之劑，補陰而無凝滯之弊、補陽而無燥熱之害，具有溫腎壯陽、益精填髓功效[19]。龜甲膠和鹿角膠均歸肝、腎二經，《古今名醫(yī)方論·龜鹿二仙膏》云“龜?shù)锰斓刂帤庾詈瘢仆ㄈ蚊}，鹿得天地之陽氣最全，善通督脈”，兩藥并作竹破竹補之用，能滋陰血、補腎陽，人參大補元氣而生津，枸杞子益精生血，四藥合用，可生精、益氣、養(yǎng)血[20]。現(xiàn)代藥理學研究證實，龜鹿二仙膠具有抗氧化應激、抗炎癥反應、促進血小板生成、促進骨恢復等作用[21]。本研究表明，中、高劑量龜鹿二仙膠能顯著改善腺嘌呤誘導的OAS大鼠的精子質量和精子活力，同時可以調節(jié)其性激素水平和氧化應激水平恢復正常，并能修復少弱精子大鼠的睪丸損傷。

結合前期網絡藥理學研究結果[22]，本課題組認為龜鹿二仙膠可能是通過HIF-1α、EGFR、MAPK1等多成分、多靶點、多信號通路的相互作用調節(jié)OAS大鼠睪丸組織性激素和氧化應激水平達到保護作用。低水平的ROS在維持男性生殖功能中承擔重要角色，但過量的ROS會導致氧化應激狀態(tài)，破壞精子細胞蛋白質、脂質和DNA，從而導致生殖功能受損，引起精子降低和喪失[23-24]。SOD是睪丸組織內一種重要的抗氧化酶，GSH-Px是機體內清除氧自由基的一種重要過氧化物分解酶，睪丸組織中SOD活性及GSH-Px水平可以反映其氧化應激損傷水平[25]。許多研究表明，HIF-1α能夠阻止低氧條件下過多ROS的產生以對抗氧化應激[26]。HIF-1α是一種氧調節(jié)的轉錄激活劑，屬于缺氧誘導因子的一個亞基，在細胞對缺氧的反應中起著關鍵作用。臨床研究表明，缺氧會對精子質量和睪丸激素水平造成不良影響，而由缺氧引起的精母細胞凋亡是導致精子生成障礙的關鍵因素[27]。EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面糖蛋白受體。有研究表明，基于分子對接，某些中藥活性成分可以通過與EFGR結合，調控MAPK信號通路的表達，從而減輕相關炎癥反應[28]。MAPK信號通路是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，是細胞增殖、分化、細胞凋亡以及正常條件和病理條件下應激反應的關鍵信號通路。有研究表明，山柰酚可以通過下調MAPK信號通路來降低氧化應激和炎癥反應[29]。我們在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，經腺嘌呤造成OAS模型后，大鼠睪丸組織中ROS水平升高，SOD和GSH-Px水平降低，過量的ROS造成了大鼠睪丸組織的氧化應激損傷狀態(tài)。模型對照組大鼠的精子數(shù)量和精子活力水平顯著降低，且睪丸組織受損，說明氧化應激狀態(tài)可能導致精子相關活性物質的破壞和生殖系統(tǒng)的損害。隨后，我們對前期預測作用靶點及相關信號通路進行驗證，發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠睪丸組織中HIF-1α、EGFR、MAPK1蛋白表達均顯著升高。而當給予不同劑量的龜鹿二仙膠進行干預后，OAS大鼠的上述情況得到不同程度的逆轉。中、高劑量龜鹿二仙膠的干預明顯改善了OAS大鼠精子質量和睪丸組織的損傷，同時降低了HIF-1α、EGFR、MAPK1蛋白表達水平，說明龜鹿二仙膠能夠促進機體抗氧化，降低腺嘌呤在少弱精子大鼠的睪丸中誘導的氧化應激，從而提高精子活力，改善精子質量，且其可能是通過調節(jié)HIF-1α和MAPK等多條信號通路發(fā)揮作用。低劑量龜鹿二仙膠的干預對OAS大鼠沒有顯著的治療作用，這可能是因為低劑量龜鹿二仙膠僅為臨床等效劑量的0.5倍，導致其藥效作用不足。因此，龜鹿二仙膠可能是通過HIF-1α/EGFR/MAPK1信號通路調節(jié)氧化應激來改善OAS，從而發(fā)揮治療效果。

本研究通過動物實驗研究，初步探討了龜鹿二仙膠治療OAS的潛在分子作用機制。本研究旨在為龜鹿二仙膠臨床治療應用于治療OAS提供實驗依據(jù)。本課題組后續(xù)將進行更深入對其他主要調控靶點展開研究，以期探索其更為明確的分子機制。

參考文獻

[1] 薛? 瓏， 甄號召， 王? 健. 經濟發(fā)展水平、生育政策與生育率[J]. 統(tǒng)計與決策， 2023， 39（15）： 79-84.

[2] EISENBERG M L， ESTEVES S C， LAMB D J， et al. Male infertility[J]. Nature Reviews Disease Primers， 2023， 9（1）： 49.

[3] WAGNER A O， TURK A， KUNEJ T. Towards a multi-omics of male infertility[J]. The World Journal of Men's Health， 2023， 41（2）： 272-288.

[4] PU R Y， LIU J， ZHANG A P， et al. Modeling methods for busulfan-induced oligospermia and asthenozoospermia in mice： A systematic review and meta-analysis[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics， 2023， 40（1）： 19-32.

[5] AGARWAL A， BASKARAN S， PAREKH N， et al. Male infertility[J]. Lancet， 2021， 397（10271）： 319-333.

[6] METHORST C， FAIX A， HUYGHE E. Medical treatments for male infertility[J]. Progres En Urologie： Journal De L'Association Francaise D'urologie et De La Societe Francaise D'urologie， 2023， 33（13）： 653-680.

[7] BARATI E， NIKZAD H， KARIMIAN M. Oxidative stress and male infertility： Current knowledge of pathophysiology and role of antioxidant therapy in disease management[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2020， 77（1）： 93-113.

[8] EVANS E P P， SCHOLTEN J T M， MZYK A， et al. Male subfertility and oxidative stress[J]. Redox Biology， 2021， 46： 102071.

[9] HUSSAIN T， KANDEEL M， METWALLY E， et al. Unraveling the harmful effect of oxidative stress on male fertility： A mechanistic insight[J]. Frontiers in Endocrinology， 2023， 14： 1070692.

[10] 李? 玲， 黃家望， 馮芷瑩， 等. 基于鐵死亡途徑探討龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的作用及機制[J]. 中草藥， 2023， 54（20）： 6722-6733.

[11] ZHAO H Y， ZHAO T T， YANG J H， et al. Epimedium protects against dyszoospermia in mice with Pex3 knockout by exerting antioxidant effects and regulating the expression level of P16[J]. Cell Death & Disease， 2022， 13（1）： 69.

[12] 陸包偉， 劉露梅， 王? 能， 等. 龜鹿二仙膠對糖尿病大鼠生殖損傷的保護作用及機制[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2022， 28（19）： 1-8.

[13] 胡海林， 劉子毓， 何清湖， 等. 龜鹿二仙膏對陽虛型少弱精子癥大鼠的改善作用及CFTR蛋白表達的影響[J]. 中醫(yī)藥信息， 2021， 38（6）： 15-20.

[14] 劉子毓， 何清湖， 孫貴香， 等. 兩種劑型龜鹿二仙膠對于腺嘌呤誘導腎陽虛型少弱精子癥大鼠的干預作用[J]. 世界科學技術： 中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2021， 23（5）： 1384-1389.

[15] 沈? 童， 劉芬芬， 周亞博， 等. 龜鹿二仙膠源流考辨與研究進展[J]. 世界中醫(yī)藥， 2022， 17（17）： 2517-2523.

[16] YU Z Z， CHEN J， SHOU P Q， et al. Effects of micronutrients on the reproduction of infertility rat model induced by adenine[J]. International Journal of Clinical and Experimental Medicine， 2014， 7（9）： 2754-2762.

[17] 管鵬飛， 徐新宇， 應志康， 等. 中醫(yī)藥治療弱精子癥研究現(xiàn)狀概述[J]. 山東中醫(yī)藥大學學報， 2022， 46（4）： 544-548.

[18] 黃念文， 李海松， 畢煥洲， 等. 基于腸道菌群探討補腎益精法治療少弱精子癥的作用機制[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2024， 30（5）： 170-175.

[19] 陸包偉， 盛? 文， 丁? 勁， 等. 龜鹿二仙膠對陽虛型腎病大鼠腎臟的保護作用[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2023， 34（2）： 257-260.

[20] DING J， SHENG W， BO W， et al. Guilu Erxian glue mitigates oxidative damage in mouse GC-1spermatogonial cells by inhibiting autophagy via the Keap1/Nrf2 pathway[J]. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences， 2023， 10（4）： 484-492， 527.

[21] 高? 毅， 樊勁沖， 陳儉波. 龜鹿二仙膠的臨床研究進展[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育， 2023， 21（10）： 199-202.

[22] 丁? 勁， 何清湖， 周興， 等. 基于網絡藥理學和分子對接探討龜鹿二仙膠治療少、弱精子癥作用機制[J]. 世界科學技術： 中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2021， 23（12）： 4490-4504.

[23] TAKESHIMA T， USUI K， MORI K， et al. Oxidative stress and male infertility[J]. Reproductive Medicine and Biology， 2021， 20（1）： 41-52.

[24] AYAD B， OMOLAOYE T S， LOUW N， et al. Oxidative stress and male infertility： Evidence from a research perspective[J]. Frontiers in Reproductive Health， 2022， 4： 822257.

[25] HASSANI-BAFRANI H， NAJARAN H， RAZI M， et al. Berberine ameliorates experimental varicocele-induced damages at testis and sperm levels; evidences for oxidative stress and inflammation[J]. Andrologia， 2019， 51（2）： e13179.

[26] HUANG X Y， ZHANG Y L， QI B Y， et al. HIF-1α： Its notable role in the maintenance of oxygen， bone and iron homeostasis （Review）[J]. International Journal of Molecular Medicine， 2022， 50（6）： 141.

[27] WANG Z X， ZHU C C， SONG Y Y， et al. SIRT3 inhibition suppresses hypoxia-inducible factor 1α signaling and alleviates hypoxia-induced apoptosis of type B spermatogonia GC-2 cells[J]. FEBS Open Bio， 2023， 13（1）： 154-163.

[28] DONG Y， ZHENG Y F， ZHU L H， et al. Hua-tan-Sheng-jing decoction treats obesity with oligoasthenozoospermia by up-regulating the PI3K-AKT and down-regulating the JNK MAPK signaling pathways： At the crossroad of obesity and oligoasthenozoospermia[J]. Frontiers in Pharmacology， 2022， 13： 896434.

[29] LIU Z Y， YAO X Q， SUN B H， et al. Pretreatment with kaempferol attenuates microglia-mediate neuroinflammation by inhibiting MAPKs-NF-κB signaling pathway and pyroptosis after secondary spinal cord injury[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2021， 168： 142-154.

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81973863）;湖南省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2022-2864） 。

〔通信作者〕*何清湖，男，教授，博士研究生導師，E-mail：Hqh19651111@163.com;李? 玲，女，教授，碩士研究生導師，E-mail：liling1049@hnucm.edu.cn。