高模量高強度絲素蛋白 GBR 膜的制備及性能評估

廖小毓,方 輝,楊飛宇,鄒多宏,2

引導性骨再生(guided bone regeneration,GBR)技術是口腔科常用的骨量提升技術之一,而 GBR 膜作為其關鍵材料之一,具有避免骨缺損部分被軟組織侵占并引導新骨生長的重要作用[1]。然而,商用 GBR 膜如 Bio-Gide 膜等,存在機械性能不足、降解速度過快等問題,容易導致嚴重的并發癥,如膜穿孔等[2]。因此,迫切需要開發一種高模量高強度的 GBR 膜。絲素蛋白是一種天然的蛋白質,主要存在于蠶絲的繭中。它具有良好的生物相容性,可在各種醫學應用中使用,并不引起免疫反應。絲素蛋白可在體內逐漸降解并被代謝,為新生組織提供支撐,最終被身體自身的組織所替代[3]。絲素蛋白因其生物相容性、可降解性、機械性能、生物活性以及可塑性和可功能化的特點,使其在生物醫藥和組織工程領域具有重要的應用潛力。該研究以絲素蛋白作為原料,采用自蒸發方法使絲素蛋白溶液轉變為膜材,并通過保濕、熱壓的方法進一步改變其蛋白質的二級結構,通過測試其濕態拉伸強度、蛋白質二級結構以及對細胞增殖黏附的影響等,探究其作為新型 GBR 膜的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑蠶繭(南潯練市久恒蠶絲制品經營部);蛋白酶 K、溴化鋰(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);碳酸鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司);小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)、小鼠成纖維細胞(L929)購自中國科學院細胞庫;MWCO 3500 透析袋 (湖南翊博生物科技有限公司)。 MEM-α 培養基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)、杜氏磷酸鹽緩沖溶液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)、胎牛血清、0.25%胰酶細胞消化液、青-鏈霉素(美國 Gibco 公司),CCK-8 試劑盒、Calcein-AM/PI 活/死細胞雙染試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所)。

1.2 主要儀器場發射掃描電子顯微鏡(JSM-IT800,日本電子株式會社),傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS50 FT-IR,美國 Thermo Fisher 公司),自動壓片機(ZDZT-30T,天津市睿恒科技發展有限公司)、溫控儀(ZTRM-1,天津市睿恒科技發展有限公司),酶標儀(Spark,美國 Biotek 儀器有限公司),倒置熒光顯微鏡(IX71,日本 Olympus 株式會社),細胞培養箱(IMH60-S,美國 Thermo Scientific 公司),冷凍離心機(MultifugeXPro Series,美國 Thermo Scientific 公司),萬能力學試驗機(5565A,美國 Instron 公司),冷凍干燥機(SCIENTZ-12N/A,寧波新芝士生物科技有限公司),激光掃描共聚焦顯微鏡(A1 RHD25,日本尼康株式會社)。

1.3 方法

1.3.1提取絲素蛋白溶液 將去蛹的桑蠶繭剪成片狀,稱取 4.24 g無水碳酸鈉,溶于 2 L 去離子水,煮沸后加入 5 g蠶繭片,保持沸騰 30 min。取出蠶絲,去離子水洗沖洗、浸泡、擰干,重復 5 遍,直至徹底洗去絲膠和碳酸鈉;洗凈的蠶絲,放入 60 ℃ 烘箱過夜烘干,得到脫膠蠶絲。配制濃度為 9.3 mol/L的溴化鋰溶液,置于 60 ℃油浴中加熱。向溶液中加入 5 g 脫膠蠶絲,低速攪拌反應 4 h。完成反應后,將所得溶液裝入事先準備好的 MWCO 3500 透析袋中,去離子水透析 48 h,以去除溶液中的溴化鋰。透析完畢后,將溶液轉移至離心管中,并在 4 ℃、9 000 r/min離心2次,每次離心 20 min[4]。留取上清液作為最終使用的絲素蛋白溶液。

1.3.2制備絲素蛋白膜 將絲素蛋白溶液均勻地倒入方形培養皿中,然后將培養皿放置在 30 ℃的加熱臺上蒸發 24 h ,直至完全干燥,形成薄膜。將膜放置于 60 ℃、100%相對濕度的恒溫恒濕箱中高溫高濕處理 20 min,然后將膜放置于在兩塊鏡面鋼之間,使用熱壓機在 15 MPa、170 ℃的條件下進行熱壓處理,即可獲得絲素蛋白膜。所得的絲素蛋白膜應進行真空干燥保存,以備后續使用。

1.3.3微觀表征 將絲素蛋白膜裁剪成規則大小,于液氮中脆斷得到樣品。選擇斷面整齊的樣品,采用導電膠將其固定于樣品臺正面及側面,于低真空度的蒸金室中蒸金 60 s,通過掃描電鏡在 2.5kV 加速電壓下觀察其表面及截面結構特征。取絲素蛋白膜采用傅里葉變換紅外光譜儀分析其二級結構。

1.3.4力學性能測試 將絲素蛋白膜裁剪成長條形樣品并浸泡于 DPBS 中,待其充分溶脹后使用游標卡尺測量厚度、寬度與長度,樣品置于恒溫水浴中通過萬能力學試驗機以 100 mm/min 的拉伸速度勻速拉伸直至樣品斷裂,以測量其濕態拉伸性能。

1.3.5細胞相容性檢測 根據ISO/EN10993-12 國際標準組織的規定,提取絲素蛋白膜浸提液,并將經過高溫高壓滅菌處理的樣品浸泡在含有 10% 胎牛血清和 1% 青-鏈霉素溶液的培養基中,浸泡時間為 24 h。接種 MC3T3-E1 細胞,每個時間點每組 3 個復孔,每孔接種 1×103個細胞。接種 24 h 后更換培養基,對照組使用普通培養基,絲素蛋白組使用浸提液培養,每 3 d 換液 1 次。在 1、4、7 d 分別棄去培養基,PBS 清洗,每孔加入 CCK-8 溶液,37 ℃ 孵育 1 h 后使用酶標儀讀取450 nm處吸光度值。

1.3.6細胞活力實驗 通過活/死熒光染色評估細胞活力:使用打孔器將絲素蛋白膜制備成直徑 6 mm的圓形樣品,高壓蒸汽滅菌,分別置于 3 個 96 孔板中,每個樣品上接種 3×103個 L929 細胞,每個時間點設 3 個復孔。分別培養 4、7 d 后按照活死細胞染色試劑盒使用說明書染色,使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍攝樣品。

1.3.7細胞黏附實驗 將 MC3T3-E1 細胞接種于絲素蛋白膜,4 d 后取出,PBS 溶液洗滌 3 次,用 4% 多聚甲醛固定 40 min 后再次使用 PBS 洗滌,每次 5 min 。使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水(乙醇溶液的濃度依次為 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100%),每個梯度脫水 10 min 。脫水完畢后用叔丁醇清洗薄膜 3 次,置換出乙醇后使用冷凍干燥機將薄膜樣品凍干,用于掃描電鏡觀察。

1.3.8細胞成骨分化的檢測 將消毒后的絲素蛋白膜浸泡于成骨誘導培養基內 24 h,獲得浸提液。將 MC3T3-E1 接種于 12 孔板內,24 h 后更換為相應浸提液培養基,每 3 d換液 1 次, 7 d 后按照 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色劑說明書進行染色以檢測 ALP 活性。

1.3.9溶脹及降解性能測試 溶脹測試:將絲素蛋白膜裁剪成 5 mm×15 mm 的條形樣品,60 ℃ 烘干后稱量原始質量,然后將樣品完全浸沒于 DPBS 中,分別于 0.25、0.5、1、1.5、6、12、24、48、72 h 后取出,用濾紙吸去樣品表面的液體后稱重,定量變化表示為相對于初始干重溶脹后重量的百分比。

降解性能測試:將絲素蛋白膜制成規則的條形樣品,烘干后用分析天平測量樣品干重,絲素蛋白膜(每組n=3)浸沒在含或不含 0.1 U/L蛋白酶 K 的 DPBS 溶液中,在 37 ℃搖床中溫育0.5、1、3、6、12 h,每個時間段更換新鮮降解液,將降解的產物收集后在去離子水中漂洗并真空抽濾,60 ℃下干燥后稱量干重。定量變化表示為相對于初始干重殘留的重量的百分比。

2 結果

2.1 絲素蛋白膜的結構表征及成分分析掃描電鏡可見絲素蛋白膜表面平整(圖 1A),截面可見其結構致密,厚度約為 90 μm(圖 1B)。如圖 2C 所示,未保濕、熱壓的絲素蛋白膜的紅外吸收峰在 1 637 cm-1、1 514 cm-1處,分別表示隨機卷曲、α-螺旋中氨基酸殘基的 C=O 鍵振動和 β-折疊結構中氨基酸殘基的 N-H 及 C-N 鍵振動。對膜樣品進行高溫高濕、熱壓處理后,新的紅外吸收峰出現在 1 699 cm-1處,表明膜樣品中出現了新的 C=O 鍵振動。同時,原先位于1 637 cm-1的 C=O 鍵振動峰移動至 1 618 cm-1處,并且峰形更加尖銳。以上結果表明高溫高濕和熱壓處理促進了 β-折疊構象的形成。

2.2 濕態條件下自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜與甲醇交聯的絲素蛋白膜拉伸強度的比較圖2顯示,在濕態條件下,自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜與甲醇交聯的絲素蛋白膜在拉伸彈性模量、拉伸強度方面存在顯著差異。首先,自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜的拉伸彈性模量為(45±8.19)MPa,而甲醇交聯的絲素蛋白膜的拉伸彈性模量為(3.27±0.47)MPa。表明自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的彈性模量,即在受力后能夠更好地恢復到原始形狀。自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜的拉伸強度為(8.39±0.63)MPa,而甲醇交聯的絲素蛋白膜的拉伸強度為(1.48±0.151)MPa。表明自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的抗拉強度,能夠承受更大的拉伸力。以上結果表明自蒸發-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的彈性模量、拉伸強度。

圖1 絲素蛋白膜的微觀形貌和二級結構成分分析

圖2 絲素蛋白膜的拉伸機械性能測試

圖3 絲素蛋白膜的生物相容性及細胞黏附能力

圖4 絲素蛋白膜的促成骨分化能力檢測

圖5 絲素蛋白膜的溶脹及體外降解性能

2.3 細胞增殖及細胞活力實驗根據 CCK-8 法檢測結果顯示,培養 1、4、7 d 后,空白組和絲素蛋白組之間的吸光度無明顯差異(圖 3A)。通過倒置熒光顯微鏡觀察活死細胞染色,結果如圖 3B所示,活細胞呈現綠色熒光(活),死細胞呈現紅色熒光(死)。在共培養 4、7 d 后,空白組和絲素蛋白組表面的活死細胞比例無明顯差異。這些結果表明絲素蛋白組對細胞的毒性無明顯影響。

2.4 細胞黏附能力MC3T3-E1 接種在絲素蛋白膜表面 4 d 后,掃描電鏡結果表明細胞可以較好的黏附在絲素蛋白膜表面(圖 3C),且伸出偽足。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察絲素蛋白膜表面 MC3T3-E1 細胞,圖 3D 為細胞核染色圖、細胞骨架染色圖以及二者的融合圖像,可見大量細胞伸展黏附于絲素蛋白膜表面。以上結果表明 MC3T3-E1 細胞對絲素蛋白膜具有良好的黏附性。

2.5 促成骨分化能力成骨誘導 7 d 后,ALP染色實驗結果如圖 4,與空白組相比,在絲素蛋白組中MC3T3-E1細胞表面顯示堿性磷酸酶陽性結果更明顯。這表明絲素蛋白的存在確實有一定促成骨作用。

2.6 溶脹性和可降解性溶脹測試結果如圖 5,絲素蛋白膜在溶脹初始階段(1 h 內)溶脹較快,6 h 左右達到溶脹平衡。降解實驗表明,在 0.1 U/L 蛋白酶 K 的存在條件下,12 h 時絲素蛋白膜降解率達 35.3% 左右。表明絲素蛋白膜具有一定的溶脹性和可降解性。

3 討論

GBR 技術是一種使用屏障膜的外科技術,廣泛應用于牙周組織再生領域,它的原理是使用屏障膜來防止軟組織長入骨缺損區域,并幫助形成新生骨[5]。GBR 膜通常可分為可吸收性膜和不可吸收性膜,臨床上常用的可降解 GBR 膜通常基于聚酯或膠原蛋白。聚酯基膜具有可控的降解速率和足夠的機械強度,有利于骨缺損區域成骨空間維持,然而,其降解產物可能引發局部炎癥反應,不利于骨組織的形成。而膠原基天然膜雖然具有優異的生物相容性,但降解較快,且力學性能較差,可能會導致膜塌陷,影響成骨效果[6]。絲素蛋白是一種常見的天然高分子聚合物,因其免疫原性低、生物相容性優異、降解性能可控,廣泛應用于生物醫用材料領域[7]。

本實驗結合自蒸發技術和熱壓技術,成功制備了具有優異力學性能的可降解絲素蛋白基 GBR 膜。首先,利用自蒸發技術將絲素蛋白溶液制成平整光滑的膜材,并形成部分結晶。同時引入結合水來維持絲素蛋白的穩定性,水分子與絲素蛋白中的氨基酸殘基通過氫鍵和靜電作用相互作用,有利于后續 β-折疊的形成[8]。這種結合水的引入可以調節絲素蛋白的功能,使其具有一定的彈性和可伸縮性,從而有效提高其力學性能。其次,熱壓處理可以通過熱能的輸入和壓力的作用,使絲素蛋白中的亮氨酸和甘氨酸殘基之間的氫鍵重新組合,從而促進 β-折疊的形成[9]。同時,熱壓處理還可以改變絲素蛋白的分子排列和結晶度[10]。通過熱壓處理,絲素蛋白分子可以更加緊密地排列,形成更穩定的結晶態,有利于生成 β-折疊結構。這為制備高模量和高強度的可降解絲素蛋白 GBR 膜提供了理論依據。

既往研究[11-12]表明,絲素蛋白可以促進骨細胞的增殖和分化。它通過調節細胞外基質的合成和分泌,以及激活細胞內信號通路來促進骨細胞的增殖和分化,從而促進新骨的形成[13]。體外生物相容性實驗結果顯示,實驗組與空白對照組結果無明顯差異,絲素蛋白基 GBR 膜在體外環境中不引起明顯的細胞毒性或不良反應,顯示出良好的生物相容性。絲素蛋白基 GBR 膜具有表面光滑且致密的結構,這種致密的結構為膜提供了優良的力學性能。力學拉伸實驗結果表明,在濕態下,絲素蛋白基 GBR 膜的抗拉強度可達 8.39 MPa,顯著高于市售 Bio-Gide 膠原膜的1.16 MPa[14]。以上實驗結果表明,絲素蛋白基 GBR 膜具有優異的生物安全性,并且本研究所述蒸發-熱壓法,所得 GBR 膜的機械性能具有顯著優勢。

綜上所述,本研究利用自蒸發技術和熱壓技術成功構建了絲素蛋白基 GBR 膜,并對其微觀結構、濕態下的力學性能、溶脹性能、降解性能、細胞相容性及細胞黏附能力等進行了探究。相關實驗結果顯示,所制備的絲素蛋白基 GBR 膜有望作為新型的 GBR 膜在臨床中應用。而未來的研究需要進一步的體內實驗證據和長期的生物相容性評估,從而深入探究絲素蛋白基 GBR 膜在骨組織工程中的應用潛力,并進行更全面、系統的生物性能評價。