METTL16在多發性骨髓瘤患者中的臨床應用價值

汪萬杰,許 晗,許婷婷,鮑 靜,夏瑞祥

多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是目前第二大常見的血液系統惡性腫瘤,近年來發病率逐漸增加。其以骨髓中單克隆性漿細胞異常的惡性增殖為特點,常見的臨床癥狀表現為骨破壞、貧血、高鈣血癥及腎功能損害等。近年來,隨著治療方案的更新換代以及干細胞移植等技術的應用,MM的預后有了很大改善。但由于其發病機制至今仍未完全明確,治療藥物的耐藥和副作用、治療后復發等都提示著需要探索MM新的治療策略。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)在真核生物中是一種可逆的、動態的表觀遺傳修飾,其中甲基轉移酶樣蛋白16(methyltransferase like protein 16,METTL16)是人類細胞RNA修飾領域的新興參與者,現在已被證明可以結合MAT2A信使RNA (mRNA)和U6小核RNA (snRNA)并使其甲基化[1]。目前已發現METTL16與肝癌等惡性腫瘤有關[2],但其與MM的相關性還有待發掘。因此,該研究將進一步探尋m6A與MM的診斷及預后的相關性,探討METTL16在臨床診治中的意義,并初步探索其影響MM可能相關的信號通路。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2023年4-8月于安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科就診的MM初次就診患者26例以及標準方案治療后患者19例、健康人23例,收集患者的骨髓樣本及正常人的外周血樣本用于分離獲得淋巴細胞,所有患者均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2022年修訂)》診斷標準,采用ISS分期。參與本研究者均已簽署書面知情同意書。本研究方案遵循赫爾辛基宣言的原則,已獲得安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(No.20200040)。

1.2 試劑與儀器人骨髓單個核細胞分離液試劑盒及人全血單個核細胞分離購于北京索萊寶科技有限公司,TRIzol及RPMI1640培養基購自美國Thermofisher公司,引物由上海生工生物工程有限公司設計合成(表1),去基因組與逆轉錄一管化三代預混液及高特異化學染料法定量PCR預混液(無ROX)由莫納生物科技有限公司提供。離心機:美國BECKMAN COULTER公司,型號為Allegra X-15R Centrifuge;qRT-PCR儀:美國Bio-Rad公司,型號為CFX Connect。

表1 引物序列

1.3 相關性分析下載多發性骨髓瘤研究基金會(The Multiple Myeloma Research Foundation,MMRF)數據庫及基因型-組織表達項目(The Genotype-Tissue Expression,GTEx)數據庫中多發性骨髓瘤患者及正常人組織中m6A相關基因的表達數據集,檢驗MM患者與正常對照各m6A相關基因的表達差異,分析其與患者生存預后的相關性。

1.4 標本的采集與檢測采用 Ficoll 分離方法分離骨髓及外周血中的單個核細胞,將細胞于RPMI1640培養基中混懸,于含5%CO2、37 ℃培養箱中靜置24 h。吸取靜置后的細胞懸液于離心機中4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液,獲得骨髓及外周血淋巴細胞。加入TRIzol試劑提取淋巴細胞RNA,使用去基因組與逆轉錄一管化三代預混液逆轉錄合成cDNA,高特異化學染料法定量PCR預混液(無ROX)進行qRT-PCR。所有操作嚴格按照說明書執行。收集初診及復查患者相關的臨床指標(表2),包括性別、年齡、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、白細胞數(white blood cell count, WBC)、血小板數(blood platelet count, PLT)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、血清鈣離子(serum calcium, Ca2+)、β-微球蛋白(β-microglobulin, β-MG)、骨破壞、ISS分期、分型等。其中Hb、WBC、PLT由臨檢室提供,Scr、Ca2+、β-MG由生化室提供,骨破壞由影像學檢查判斷。

2 結果

2.1 MM患者與正常組織m6A各相關酶表達水平及生存分析通過分析MMRF及GTEx數據庫中MM患者及正常組織對照的基因表達量及臨床信息發現,METTTL3、METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2在MM患者中表達量均顯著高于正常組織,而METTL14和FTO則相反,差異有統計學意義(圖1)。預后分析顯示METTTL3、METTL14、METTL16、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因均與更短的生存期相關(圖2)。

圖1 MMRF及GTEx數據庫中m6A相關基因的表達水平

圖2 MMRF數據庫中m6A相關基因生存曲線

2.2 m6A各相關酶在MM患者及正常對照中的表達情況收集初診MM患者、標準方案治療后MM患者的骨髓標本及正常人外周血樣本,提取其中的淋巴細胞進行qRT-PCR,其結果(圖3)提示METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2在初診和復查的MM患者中表達均顯著高于正常對照,同時初診MM患者中的表達量也高于治療后復查的患者(P<0.05),而METTL3與FTO、YTHDF1在初診患者中的表達量也顯著高于治療后患者,METTL14及YTHDF2在初診患者中的表達量則顯著高于正常對照,差異均有統計學意義。計算初診患者中各基因表達量相對于正常對照中的倍數,觀察其中表達升高更加顯著的基因(圖4)。

圖3 MM初診患者、治療后復查患者及正常對照m6A表達水平

圖4 初診患者中m6A各基因相對于正常對照表達量升高倍數

2.3 METTL16與初診患者各臨床指標的相關性收集初診患者各臨床指標,與METTL16表達量進行臨床相關性分析(圖5)。根據分析結果可以發現,Hb、WBC、β-MG、生存期、分期及骨破壞等均與METTL16有顯著相關性(P<0.05)。其中Hb及生存期與METTL16的表達呈負相關性,WBC、β-MG及分期均與METTL16表達呈正相關性,而當患者出現骨破壞后,骨破壞的程度也與其表達量呈正相關。

圖5 初診MM患者METTL16表達與臨床各指標相關性分析

2.4 METTL16與炎癥因子和趨化因子表達的相關性在初診患者樣本中使用qRT-PCR檢測炎癥因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-18以及趨化因子CCL2、CCL3、CCL4的表達量。分析METTL16與炎癥因子及趨化因子表達的相關性(圖6),可以發現METTL16與CCL4的表達呈正相關(P<0.05)。

圖6 初診MM患者METTL16表達量與CCL4表達量相關性分析

3 討論

近年來,對于m6A各基因在多種腫瘤中發揮的調控作用研究非常多,其中包括肝癌、肺癌以及急性髓系白血病[3]等,其主要通過參與mRNA的翻譯、降解和剪切等來改變靶基因的表達。而在MM中,METTL3目前已被發現可以影響MM細胞的干性,抑制其凋亡[4],同時,FTO和ALKBH5均可以在YTHDF2依賴的情況下促進MM細胞的增殖和侵襲,抑制其凋亡[5-6]。HNRNPA2B1則可以通過介導多條通路,包括AKT3、TLR4等基因的表達與修飾,促進MM細胞的增殖和侵襲[7-8]。

本研究選取m6A中較為常見的11個相關基因,包括METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、RBM15、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1和YTHDC2,在MMRF及GTEx數據庫中對其表達量與MM的發病及預后進行相關分析,其結果顯示除METTL14和FTO外,其余基因在MM患者中表達量均顯著高于正常組織,其中METTTL3、METTL1、RBM1、ALKBH、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因的表達與生存時間呈負相關,均提示更差的預后。在臨床樣本中進一步驗證此結果,可以發現在MM患者中METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2的表達均顯著高于正常對照,同時經標準方案治療后上述基因的表達量也同樣均低于初診患者。而初診患者與正常對照相比的表達倍數顯示,METTL16、WTAP、ALKBH5、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2的表達倍數顯著較高。在上述基因中,METTL16與MM的相關性是顯著的,但目前對于METTL16調控MM疾病發生與進展的影響與機制尚不明確,因此本研究選取METTL16進一步探究其在MM疾病中的臨床應用價值。

對METTL16的基因表達量與初診MM患者的臨床指標進行相關性分析,顯示其與多個指標具有相關性,其中包括與Hb、生存期的負相關以及與WBC、β-MG、分期及骨破壞等的正相關。MM的主要癥狀包括貧血、骨破壞、高鈣血癥及腎功能損害,而METTL16與Hb的負相關以及骨破壞的正相關提示其表達量越高,患者的貧血程度越重,而當患者出現骨質破壞后,METTL16的表達越高則預示著更嚴重的骨破壞。這些都提示METTL16與MM疾病的進展相關。而既往的研究顯示,β-MG與MM的更差分期及預后相關[9],因此METTL16與β-MG以及分期的正相關提示其表達越高,預示著疾病的更差分期及預后。根據以上結果可以發現,METTL16的表達往往提示臨床MM患者的疾病進展,預示著更差的分期和預后,對于臨床的診治具有指導意義。

炎癥因子是指參與各種炎癥反應的細胞因子。在既往多年對于腫瘤相關的研究中已經發現,促進腫瘤的炎癥也是癌癥的特征之一。腫瘤微環境中的炎癥失調直接通過細胞因子誘導的惡性細胞刺激和(或)間接通過誘導生長因子、血管生成和組織重塑促進腫瘤生長。同樣的, IL-1β、IL-6、IL-18等多種炎癥因子也均已被證實與MM的發展與預后相關[10-12],參與到MM細胞的增殖、侵襲以及耐藥等過程。趨化因子則是炎癥反應中使免疫細胞定向趨化的細胞因子蛋白。其主要作用是誘導細胞的定向遷移,在炎癥及體內各平衡過程中管理白細胞向各位置的定向歸巢,其分泌通常由炎癥因子刺激,并與炎癥因子協同作用。趨化因子在MM的發展過程中也發揮著重要作用,包括趨化因子配體(chemokine ligand,CCL)3、趨化因子受體(chemokine receptor,CCR)1等多種趨化因子均被證明調控MM的進展和耐藥[13-14]等多種生物學過程。因此,本研究選取4種炎癥因子和3種趨化因子,探究METTL16的表達與其是否具有相關性,能否進一步研究METTL16調控MM可能的相關通路。

METTL16與炎癥因子及趨化因子的相關性分析表明其與CCL4的表達具有顯著的正相關性,METTL16表達越高,CCL4的表達也越高。該結果提示METTL16可能通過CCL4相關的信號通路調控MM的進展及預后。CCL4,一種CC趨化因子,也被稱為巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein , MIP)-1β,可以對各種類型的免疫和非免疫細胞具有多種作用。目前已知CCL4可以通過募集調節性T細胞和致瘤性巨噬細胞,并作用于腫瘤微環境中的其他駐留細胞,如成纖維細胞和內皮細胞,促進其致瘤能力,從而促進腫瘤的發生和進展[15]。但對于CCL4與MM的作用目前尚不清楚。因此,在進一步的研究中可以探究CCL4與MM的相關性,并明確METTL16是否通過CCL4相關的信號通路調控MM的疾病發生和發展。

綜上所述,MM患者的骨髓中m6A多種基因均呈高表達,其中METTL16的高表達對于評估疾病的進展以及預測預后具有重要的臨床價值。同時,METTL16與趨化因子CCL4的表達呈正相關,在未來的研究中可以進一步明確其與MM相關的信號通路,尋找能夠抑制METTL16表達的治療方式,為MM尋找新的治療策略。