T細胞條件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鑒定

王卉卉,朱向玲,吳旭銘,張慧茹,周園園,王安琪,劉 崇,涂佳杰

PU.1作為E26 transformation-specific(ETS)轉錄因子家族的成員之一,由Spi1基因編碼,重要的功能區域包括羧基端高度保守的DNA結合區,也就是ETS結構域,可以識別擁有GGA(A/T)序列的DNA結合位點[1]。PU.1主要在造血細胞中表達,能夠調控多種免疫細胞的分化和功能,從而影響一些自身免疫性疾病的病程,比如類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephakmyelitis, EAE)等[2]。課題組前期研究[3]已證實,PU.1可以通過直接靶向巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞中的FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase, FLT3)來促進類風濕關節炎的發展。同時,許多研究也表明PU.1在T細胞的發育及相關疾病中也發揮了重要作用,PU.1對于T細胞的調控有望在未來成為RA新的藥物靶點[4]。因此該研究利用Cre/LoxP系統和CRISPR/Cas9 技術,構建出T細胞條件性敲除Spi1基因的小鼠,并對其進行繁育及基因型鑒定,為進一步探索PU.1在T細胞相關疾病中的具體作用和潛在機制提供可靠的模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物所有小鼠的遺傳背景均為C57BL/6,由賽業(蘇州)生物科技有限公司提供,生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0003。實驗動物均飼養于SPF級動物房,并且所有實驗均通過了安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準,批準號為PZ-2022-024。

1.2 主要試劑核酸染料、100bp Ladder DNA Marker和2×HotStrat Taq PCR Master Mix(北京博邁德基因技術有限公司);Agarose(德國BioFroxx公司);淋巴細胞分離液(北京達科為生物科技有限公司);CD4 MicroBeads mouse(德國Miltenyi Biotec公司);山羊抗鼠IgG(美國Proteintech公司);TRIzol、固定/破膜液(美國Thermo Fisher Scientific公司);BCA試劑盒、qPCR試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司);PU.1抗體(美國GeneTex公司,貨號:GTX17997);PE抗PU.1流式抗體(美國BioLegend公司,貨號:681307)。

1.3 主要儀器熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司);通用型電泳儀DYY-7C型(北京六一生物科技有限公司);Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像分析系統、Tanon-5200成像系統(上海天能科技有限公司);QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Cytoflex十色流式細胞儀(美國Bectman Coulter公司)。

1.4 方法

1.4.1T細胞Spi1條件性敲除小鼠的建立與繁育 利用CRISPR/Cas9系統中的Cas9酶識別gRNA切割Spi1基因第2外顯子的兩側,隨后將兩個LoxP分別置于切割位點,在淋巴細胞蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase,Lck)啟動子的控制下表達Cre,使用Cre重組酶特異性地切除T細胞中被LoxP位點標記的序列,構建策略示意圖見圖1。將Lck-Cre小鼠與Spi1flox/flox小鼠雜交獲得Lck-Cre×Spi1flox/+基因型的F1代雜合子小鼠,再將F1代小鼠進行交配,篩選后得到Lck-Cre×Spi1flox/flox基因型的小鼠。

圖1 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的構建策略示意圖

1.4.2小鼠的基因型鑒定

1.4.2.1 小鼠尾部DNA的提取 小鼠3周齡時,剪取3 mm左右的鼠尾,向EP管中加入50 μl A液(50 μl 5 mol/L氫氧化鈉與4 μl 0.5 mol/L pH 8.0 EDTA溶于10 ml ddH2O所得),使鼠尾沉至管底,置于95 ℃電熱恒溫水箱中進行裂解,30 min后取出加入50 μl B液(400 μl 1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl溶于10 ml ddH2O所得),于渦旋震蕩器上震蕩并充分

混勻,以3 000 r/min的速度離心5 min,取上清液作為DNA模板。

1.4.2.2 PCR擴增反應及瓊脂糖凝膠電泳 首先分別進行兩次PCR擴增反應。小鼠Spi1flox/flox基因型的PCR引物為flox×F和flox×R,Lck-Cre基因型的引物為 Primer-1和Primer-2,具體引物序列見表1。PCR反應體系為:總體積25 μl;ddH2O 9 μl,2×HotStrat Taq PCR Master Mix 12.5 μl,正反向引物均為1 μl,DNA 1.5 μl。PCR擴增程序為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s,35個循環;72 ℃ 5 min終止反應。其次取10 μl PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,120 V電泳30 min,用全自動數碼凝膠圖像系統分析成像并保存。

表1 PCR擴增反應引物序列

1.4.3磁珠分選小鼠脾臟CD4+T細胞 將小鼠頸椎脫臼處死后,分離脾臟,用PBS清洗2次后包裹于200目細胞篩網中,加入4 ml淋巴細胞分離液,將脾臟充分碾碎,收集組織懸液,在液面上添加1ml RPMI 1640 培養基,2 200 r/min離心30 min,收集中間薄膜層于新的15 ml離心管中,用PBS洗滌1次。加入80 μl PBS和20 μl CD4+T細胞磁珠,4 ℃孵育15 min。添加PBS洗滌1次后,用1 ml PBS重懸,加到已安裝在磁分選器上的分選柱中,待液體自然流盡后,再用PBS洗脫1次,最后取下分選柱,沖出CD4+T細胞。

1.4.4Western blot檢測小鼠PU.1表達水平 提取脾臟CD4+T細胞總蛋白,應用BCA法進行定量后,按一定比例加入上樣緩沖液,100 ℃恒溫煮沸10 min使其變性。采用10% SDS-PAGE電泳后,轉移至PVDF膜,快速封閉液室溫封閉15 min,加入PU.1一抗(1 ∶1 000),37 ℃孵育1 h,TBST洗3次,6 min/次,加入山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,TPBS洗3次,6 min/次,PBS洗3 min,化學發光成像分析儀進行曝光拍照并保存。Image J軟件分析目的條帶灰度值。

1.4.5qPCR檢測小鼠Spi1表達水平 應用TRIzol法抽提脾臟CD4+T細胞的RNA,將其定量后進行逆轉錄,得到的cDNA再進行實時熒光定量PCR。逆轉錄擴增程序為:50 ℃ 15 min;85℃ 5 s;4℃ ∞。設計Spi1基因的qPCR引物為Left Primer: ACTTCACAGAGCTGCAGAGT;Right Primer:TCACCCTCCTCCTCATCTGA;內參GAPDH基因的引物為Left Primer:CAAGGTCATCCATGACAACTTTG;Right Pri-mer:GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG。qPCR反應體系為:2×AceQ qPCR SYBP Green Master Mix 10 μl,50×ROX Reference Dye 2 0.4 μl,正反向引物均為0.4 μl,cDNA 2 μl,ddH2O補至20 μl。qPCR反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。

1.4.6流式細胞術檢測小鼠PU.1表達水平 對脾臟CD4+T細胞進行細胞計數和固定破膜后,分成Blank組、Spi1flox/flox及Lck-Cre×Spi1flox/flox組,Blank組適量PBS重懸后直接用十色流式細胞儀進行分析,其余兩組用100 μl PBS重懸,加入PU.1抗體(0.125 μg/106個細胞),4 ℃孵育30 min。離心棄上清液,適量PBS重懸后,上機分析最終樣品細胞。

2 結果

2.1 T細胞Spi1條件性敲除小鼠的鑒定T細胞Spi1條件性敲除小鼠的基因型鑒定結果見圖2A、2B,可見編號1、2、3號在flox擴增產物220 bp處有陽性條帶,Cre擴增產物460 bp處沒有條帶,為Spi1flox/flox基因型小鼠;編號4、5、6號在flox擴增產物220 bp處有陽性條帶,Cre擴增產物460 bp處有陽性條帶,為Lck-Cre×Spi1flox/flox基因型小鼠。以上結果說明初步構建出了T細胞條件性敲除Spi1基因的小鼠。

圖2 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的構建及基因鑒定結果

2.2 T細胞Spi1條件性敲除小鼠的表型驗證Western blot、qPCR及流式細胞術檢測發現Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠脾臟CD4+T細胞的Spi1表達水平與Spi1flox/flox小鼠相比顯著降低,分析結果見圖3A-3C。此結果驗證了條件性敲除小鼠T細胞中的Spi1已被成功敲除。

圖3 Lck-Cre×Spi1flox/flox小鼠的表型驗證結果

3 討論

CRISPR是原核生物基因組內的一段重復序列,CRISPR相關蛋白Cas9是一種內切酶,CRISPR/Cas9技術就是通過利用單鏈向導RNA(small guide RNA,sgRNA)介導Cas9與DNA靶序列形成堿基對,對靶位點進行切割,進而造成DNA位點特異性的雙鏈斷裂,以此達到對一個或者多個等位基因進行可遺傳性修飾的目的。目前,這項技術在一系列基因治療和生物技術等多個應用領域上都展現出了極大的應用前景[5]。隨著基因敲除技術的廣泛應用,基于Cre/LoxP系統的條件性敲除小鼠模型得到了越來越多的關注。Cre/LoxP系統的構建策略是由帶有LoxP序列的基因突變小鼠和帶有Cre重組酶基因的轉基因小鼠雜交并篩選,得到特異性地刪除目的片段的小鼠[6]。LoxP位點是由1個非回文核和2個反向重復序列組成,Cre是一種可以使2個LoxP位點之間發生特異性DNA重組的酶,Cre-LoxP 系統具有很高的組織及空間特異性,能夠準確地控制目的基因在何時何地表達[7-8]。CRISPR/Cas9技術與Cre-LoxP系統的結合具有容易操作、精確靶向等多種優點[9],是基因研究領域的重要實驗工具。

根據NCBI數據庫提供的參考序列,Spi1基因位于小鼠的2號染色體上,其中共有5個外顯子,本模型選擇外顯子2作為條件性基因敲除(conditional knockout,CKO)區域,CKO的有效區域大小為597 bp,且這段區域并沒有任何其他已知基因。為了進一步研究PU.1對T細胞的調控在類風濕關節炎疾病中所起到的作用,以及避免PU.1全身性敲除可能導致胚胎致死的問題[10],采用CRISPR/Cas9介導的基因組工程技術以及Cre/LoxP重組系統,將Cas9 mRNA、CKO片段的gRNA和含有loxP位點的靶向載體共同注射到受精卵中,Cas9通過識別gRNA先導鏈切割CKO片段的兩側,隨后將兩個loxP分別放置于切割位點,經過數代雜交并篩選后得到基因型為Spi1flox/flox的小鼠。在與Lck-Cre小鼠交配后,Cre重組酶會切割loxP位點,即實現特異性地刪除CKO區域,從而建立起T細胞Spi1基因條件性敲除的小鼠模型,同時依據PCR擴增反應和瓊脂糖凝膠電泳法確保小鼠的基因型背景符合預期,利用qPCR和Western blot及流式細胞術檢測小鼠的Spi1表達水平及敲除效果,證實了PU.1特異性缺陷的小鼠模型建立成功。

既往研究[4]表明,PU.1對T細胞的前期增殖和后期分化有著重要作用。在自身免疫性疾病中,PU.1對于T細胞的調控也扮演著重要角色。例如,在SLE中,PU.1與T細胞的過度激活有關;在EAE中,PU.1能夠作用于T細胞來促進疾病的進展[2]。然而,RA中PU.1對于T細胞的調控機制有待進一步研究。因此,借助CRISPR/Cas9技術結合Cre/LoxP系統,成功構建出T細胞中Spi1基因特異性敲除小鼠,有利于在整體動物水平上研究PU.1在T細胞相關癌癥及自身免疫性疾病中調控T細胞的具體作用機制,并為相關藥物靶點的研發提供理論基礎和實驗基礎。