METTL3通過mRNA m6A甲基化促進類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移及分泌炎癥因子

李 娟,蔣揚青,沈瑞明,李國銓,王 敏,徐逢皇

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以侵襲性對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病,RA關節病理特征是滑膜增生、血管翳形成,表現為滑膜成纖維細胞(synovial fibroblast,SF)類瘤樣增生、浸潤軟骨和骨,并導致關節破壞[1]。目前,我國RA的發病率約為0.34%,3年致殘率達70%,每10年死亡的總體危險增加1.3～2倍,且患者出現心血管疾病的風險顯著增高[2],給個人、家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。迄今RA的發病機制尚未明確,SF是RA疾病進展最主要的效應細胞[3],深入研究病理狀態下SF表型發生變化的機制、尋找可能干預的靶點將對未來開發潛在的治療藥物具有重大意義。研究[4-6]顯示表觀遺傳學的異?？蓪е骂愶L濕關節炎滑膜成纖維細胞活化及炎癥反應的發生,表現為異常增殖,具有侵襲性,破壞軟骨和骨。mRNA腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenosine,m6A)是高等真核生物基因轉錄后mRNA最主要的修飾[7],m6A是否參與RA-SF表型的改變及其中的調節機制尚未明確。該研究以RA關節滑膜組織、滑膜成纖維細胞為研究對象,采用免疫組化、酶聯免疫吸附試驗、流式細胞術、基因過表達及敲低等技術探討METTL3對滑膜細胞增殖、遷移及分泌細胞因子的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2020年1月-2021年12月海南醫學院第一附屬醫院風濕免疫科及關節外科收治的行關節置換或關節鏡下滑膜切除術的RA及骨關節炎(osteoarthritis, OA)患者各25例,兩組患者年齡、性別比例差異無統計學意義。RA患者符合1987年美國風濕病協會或2010年美國風濕病協會和歐洲抗風濕聯盟發布的分類標準。本研究經過醫院倫理委員會的批準[批準號:2020(科研L)第(114)號)],所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1主要試劑及儀器 兔抗METTL3單克隆抗體(ab195352)、鼠抗人METTL14單克隆抗體(ab220030)、兔抗WTAP單克隆抗體(ab195380)、兔抗ALKBH5單克隆抗體(195377)、m6A RNA甲基化定量試劑盒(ab185912)購自英國Abcam公司;抗兔IgG過氧化物酶(31460)、抗鼠IgG過氧化物酶(32430)購自美國賽默飛公司;STM2457(HY-134836,MedChemExpress公司),TRIzol試劑(A33250)、轉染試劑Lipofectamine 3000(L3000001)購自美國Invitrogen公司;細胞計數試劑盒-8(FY600001)購自弗元生物公司;凋亡試劑盒(22839)購自AAT Bioquest公司; 5×PrimeScript RT Master Mix(RR036A)、TB Green qPCR Premix Ex Taq II(RR820Q)購自TAKARA公司;METTL3-siRNA及METTL3-pcDNA3.1購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

NanoDrop 2000分光光度計(nd2000)、Pikoreal 96 real-time PCR系統(PikoReal)、iBright CL750 成像系統(iBright CL750)購自美國賽默飛公司。

1.2.2RA滑膜成纖維細胞的分離培養及分組 RA患者滑膜組織中加入RPMI 1640洗滌,解剖剪銳性切碎。用4 mg/ml I型膠原酶的RPMI 1640消化37 ℃孵育120 min。收集細胞懸液,經細胞濾網過濾,反復離心洗滌,重懸,接種到培養瓶中培養。取P3代SFs制細胞爬片,細胞免疫組化檢查抗原Vimentin和CD68的表達水平。對滑膜細胞分別轉染針對METTL3-siRNA(si-METTL3組)、METTL3-pcDNA3.1(hi-METTL3組)及陰性對照(MOCK組),以及給予STM2457(METTL3抑制劑) 10 μmol/ml干預組。分別在細胞培養的12、24、48 h檢測每組細胞的增殖活性、凋亡比例、遷移能力及培養液上清液白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白介素-17A (interleukin-17A, IL-17A)、 腫瘤壞死因子-κB活化受體配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand, RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin, OPG) 的濃度。

1.2.3m6A檢測 使用m6A RNA甲基化定量試劑盒檢測總RNA中的m6A水平。根據實驗操作步驟,使用TRIzol試劑提取滑膜組織中總RNA。分別加入200 ng總RNA、捕獲抗體溶液和檢測抗體溶液,用比色法測量每個孔在450 nm的吸光度,根據標準曲線定量m6A水平。

1.2.4免疫組化檢測甲基轉移酶樣3 (methyltransferase-like 3, METTL3)、甲基轉移酶樣14 (methyltransferase-like 14, METTL14)、腎母細胞瘤 1 相關蛋白(Wilms′tumor 1-associating protein,WTAP)、AlkB 同系物5(AlkB homologue 5,ALKBH5)的表達 滑膜組織浸泡于10%的多聚甲醛中24 h后石蠟包埋。石蠟塊切片(5 μm)后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,免疫組化檢測METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5表達。石蠟切片干燥、脫蠟和水合、抗原修復、蛋白封閉后,加入特異性一抗進行孵育,4 ℃過夜,加入二抗孵育2 h后顯色。顯微鏡下觀察目的蛋白表達情況。將免疫組化圖片輸入Image J軟件中計算陽性細胞數占比。

1.2.5細胞轉染 小干擾RNA轉染:METTL3 siRNA的序列為5′-GUCAGUAUCUUGGGCAAAUTT-3′(正向)和5′-AUUUGCCCAAGAUACUGACTT-3′(反向)。在6孔板中培養滑膜成纖維細胞(3.0×105/孔),按照操作流程使用轉染試劑Lipofectamine 3000轉染1 μg小干擾RNA,RT-qPCR和Western blot驗證METTLE轉染后mRNA及蛋白的表達。質粒轉染:在6孔板中培養滑膜成纖維細胞(3.0×105/孔),按照操作流程使用轉染試劑Lipofectamine 3000轉染1 μg METTL3-pcDNA3.1,RT-qPCR和Western blot驗證METTLE轉染后mRNA及蛋白的表達。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖 原代RA滑膜細胞在96孔培養板(每孔6 000個細胞)中培養,每組分別在培養12、24、48 h,加入10 μl CCK-8溶液,并共培養1.5 h。用酶標儀在450 nm下測試吸光度值。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 在6孔板中培養滑膜成纖維細胞(2.0×105/孔),各組分別在培養12、24、48 h收集細胞,采用凋亡試劑盒對細胞進行染色,使用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 4組滑膜成纖維細胞分別培養在6孔板中(1.0×105/孔),用10 μl移液管尖端在每個孔的單細胞層中間刮劃一痕,PBS洗滌未附著的細胞,每組分別在培養12、24、48 h,用4%多聚甲醛固定細胞,用0.1%結晶紫染色后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.9RT-qPCR檢測 為檢測METTL3 mRNA表達,首先根據操作說明使用TRIzol試劑提取總RNA,使用NanoDrop 2000分光光度計測量濃度。使用5×PrimeScript RT Master Mix通過反轉錄獲得互補DNA(cDNA)。在實驗說明的基礎上利用TB Green qPCR Premix Ex Taq Ⅱ制備反應混合物。反應在Pikoreal 96 real-time PCR系統中進行,使用以下條件檢測mRNA水平:95 ℃持續10 min,然后在95 ℃下循環40次持續15 s,60 ℃持續60 s。使用2-ΔΔCT方法計算相對表達,以β-actin mRNA表達作為內參。

1.2.10Western blot檢測 等量(約0.2 g)的組織或計數細胞在RIPA緩沖液(0.1 g/ml)中勻漿,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,收集上清液蛋白質。測量蛋白濃度后,在1×SDS緩沖液中煮沸(100 μl /106cells)5 min。在10%SDS-PAGE凝膠上加等量(50 μg)蛋白,分離后轉移到PVDF膜,之后分別與特異性抗METTL3(1 ∶2 000)、抗METTL14(1 ∶5 000)、抗WTAP(1 ∶5 000)、抗ALKBH5(1 ∶2 000)、二抗(1 ∶5 000)一起孵育后用蛋白印跡成像系統檢測。

1.2.11ELISA法檢測細胞培養上清液IL-6、IL-17A、RANKL、OPG濃度 在6孔板中培養滑膜成纖維細胞(2.0×105/孔),各組分別在培養12、24、48 h收集細胞培養液上清液,按照人IL-6、IL-17A、RANKL、OPG ELISA試劑盒操作步驟進行檢測。

2 結果

2.1 RA和OA滑膜組織m6A含量RA滑膜組織m6A含量顯著高于對照組(OA組),差異有統計學意義(圖1),說明RA滑膜組織m6A甲基化水平增高。

圖1 RA與OA滑膜組織m6A的含量

2.2 RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP及ALKBH5的表達與OA滑膜組織相比,免疫組化(陽性細胞數占比,圖2)及Western blot(圖3)結果顯示RA滑膜組織METTL3的表達顯著高于OA組(P<0.05),METTL14、WTAP及ALKBH5的表達在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 免疫組化檢測RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP及ALKBH5的表達 ×200

圖3 Western blot檢測RA及OA滑膜組織中METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5的表達

2.3 RA滑膜細胞培養及鑒定體外培養RA滑膜成纖維細胞,P3時呈較為均一的長梭形細胞(圖4)。流式細胞術檢測體外培養滑膜樣成纖維細胞:CD68-CD14-CD90+(圖5)。

圖4 體外培養RA滑膜細胞 ×400

圖5 流式細胞術檢測體外培養滑膜樣成纖維細胞

2.4 METTL3促進RA滑膜成纖維細胞增殖、遷移及分泌炎癥因子與陰性對照相比,RT-qPCR及Western blot顯示si-METTL3組滑膜成纖維細胞中METTL3表達顯著降低,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞中METTL3表達顯著增高,見圖6A-6C。

圖6 RT-qPCR及Western blot檢測si-METTL3及hi-METTL3細胞METTL3的表達

2.4.1METTL3對RA滑膜成纖維細胞增殖的作用 細胞培養12、24 h,四組細胞增殖差異無統計學意義,48 h后,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞增殖能力顯著高于對照組(P<0.05),si-METTL3組和STM2457組滑膜成纖維細胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.05),見圖7。

圖7 CCK-8法檢測四組滑膜成纖維細胞12、24、48 h增殖能力

2.4.2METTL3對RA滑膜成纖維細胞凋亡的作用 hi-METTL3組滑膜成纖維細胞凋亡比例低于對照組,差異無統計學意義(P>0.05);si-METTL3組和STM2457組細胞凋亡比例高于對照組,差異無統計學意義(P>0.05),見圖8。

圖8 流式細胞術檢測四組滑膜成纖維細胞凋亡比例

2.4.3METTL3對RA滑膜成纖維細胞遷移的作用 滑膜成纖維細胞培養12 h開始,hi-METTL3組細胞遷移能力顯著高于對照組,si-METTL3組及STM2457組細胞遷移能力顯著低于對照組,并持續至24 h和48 h,差異有統計學意義(P<0.05),見圖9。

圖9 劃痕實驗檢測四組滑膜成纖維細胞 12、24、48 h細胞遷移能力

2.4.4METTL3對RA滑膜成纖維細胞分泌細胞因

子的作用 滑膜成纖維細胞培養48 h后上清液IL-6的濃度在si-METTL3組和STM2457組均顯著低于對照組,hi-METTL3組顯著高于對照組(P<0.05)?；こ衫w維細胞培養24 h后,培養上清液中RANKL的濃度在hi-METTL3組顯著高于對照組,并持續至48 h;培養48 h后,hi-METTL3及STM2457組上清液RANKL的濃度顯著低于對照組(P<0.05)。滑膜成纖維細胞培養24、48 h時,hi-METTL3組細胞培養上清液OPG濃度顯著低于對照組(P<0.05),si-METTL3組及STM2457組濃度顯著高于對照組(P<0.05)。四組間在各培養時間點IL-17A濃度無顯著差異(圖10)。

圖10 ELISA法檢測四組滑膜成纖維細胞12、24、48 h細胞培養上清液中IL-6、IL-17A、RANKL、OPG濃度

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病,如未及時正規治療可導致關節畸形、殘疾,嚴重影響患者的生活質量。類風濕關節炎的病因目前尚未明確,SF是RA疾病進展最主要的效應細胞,在生理條件下,SF是滑液和滑膜基質中分子成分的關鍵制造者,保證關節的平衡與功能優化。在RA病理條件下,滑膜襯里層SF可由正常的1～3層增至15層甚至更多層細胞。SF表現為失去接觸抑制的非依賴性生長,具有異常的增殖和侵蝕特性[8]。

表觀遺傳調控是以獨立于基因組序列的方式,在核苷酸序列不發生改變的情況下調控基因的表達,并影響蛋白功能等重要的生命過程。研究[9]顯示表觀遺傳學異?？蓪е翿A-SF活化及炎癥反應的發生,表現為異常增殖,具有侵襲性,破壞軟骨和骨。mRNA m6A甲基化是高等真核生物基因轉錄后mRNA最主要的修飾。mRNA m6A修飾由甲基轉移酶復合體對mRNA進行甲基化,去甲基化酶移除甲基,RNA結合蛋白與其特異性結合后可讀取相關信息。其中甲基轉移酶復合體是由METTL3、METTL14和WTAP組成。ALKBH5作為去甲基酶從而實現去甲基化[7]。因正常關節滑膜組織較難獲得,因此本課題組研究了RA和OA患者關節滑膜組織RNA m6A甲基化情況,發現RA滑膜組織RNA m6A甲基化程度顯著增高,進一步研究了參與RNA m6A甲基化的相關甲基化酶及去甲基化酶,發現METTL3在RA滑膜組織中的表達顯著增高。接下來本課題組對SF進行體外培養,發現與對照組相比,過表達METTL3組SF細胞RNA m6A顯著增加,細胞增殖活性、遷移能力顯著增強[10],細胞凋亡無明顯差異;敲低METTL3細胞RNA m6A顯著減少,SF細胞增殖活性、遷移能力顯著下降[11]。STM2457干預SF后,細胞增殖、遷移的變化與siMETTL3組相似。說明METTL3通過調控SF mRNA m6A甲基化促進SF細胞增殖和遷移。

SF除了具有異常的增殖特性,也能夠刺激炎癥,更能夠直接破壞關節軟骨和骨。研究[12]表明SF可分泌一系列細胞因子,對單核巨噬細胞、淋巴細胞和骨細胞發揮多效性作用。RA SF能夠產生及(或)應答的炎癥介質包括IL-6、IL-17、RANKL、OPG等。IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子,是RA的發生發展中重要炎癥因子之一[13-14]。IL-17是重要的促炎細胞因子,由T輔助細胞17產生,IL-17能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌IL-6,從而導致炎癥產生[15-16]。RANKL也叫做破骨細胞分化因子,其與受體結合后可激活破骨細胞,促進骨破壞[17-18]。OPG屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族,是RANKL的誘導受體,通過與RANKL的結合減少破骨細胞的產生,發揮骨保護作用[19-20]。本研究顯示,與對照組相比,hi-METTL3組滑膜成纖維細胞RNA m6A甲基化程度增加,細胞分泌IL-6、RANKL顯著增加、OPG顯著減少;si-METTL3組SF RNA m6A甲基化程度顯著下降,細胞分泌IL-6、RANKL顯著減少,OPG顯著增加,說明METTL3調控RNA m6A甲基化后可促進炎癥因子IL-6的表達及破骨細胞分化因子RANKL的表達,減少骨保護素OPG的表達,可能會促進骨破壞。各組細胞培養上清液中IL-17A濃度無明顯變化,說明METTL3對IL-17A的作用影響小。METTL3對SF合成分泌IL-6、RANKL及OPG的具體調控機制,如蛋白基因轉錄的影響、mRNA m6A甲基化的區域或位點值得進一步探討,這也是課題組下一步的研究方向。本研究顯示給予METTL3特異性抑制劑STM2457干預后,SF細胞增殖活性、遷移能力顯著下降,分泌IL-6及RANKL顯著減少,OPG表達顯著增加,STM2457作為METTL3特異性抑制劑是未來RA治療的潛在藥物之一,本課題組下一步將對STM2457干預RA動物模型的體內作用進行研究。

總之,本研究表明RA滑膜成纖維細胞mRNA m6A甲基化顯著增加,且主要為METTL3所調控。METTL3可通過促進RA-SF細胞mRNA m6A甲基化,促進SF增殖和遷移,同時促進SF分泌IL-6及RANKL。METTL3特異性抑制劑STM2457是RA治療的潛在靶點藥物,值得后續進一步研究。