葛根素靶向線粒體抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的機制

余才翰,李 岱,謝 敏

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬例,其中乳腺癌新增人數(shù)達226萬,成為全球第一大癌癥[1]。癌癥不僅是一種遺傳疾病,更是一種代謝疾病[2],線粒體作為能量代謝的主要細胞器,在腫瘤發(fā)生、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[3]。線粒體功能受損可顯著降低腫瘤細胞增殖和致瘤能力[4]。研究[5]表明,線粒體DNA缺失的小鼠無法形成腫瘤。

葛根素是從葛根屬豆科植物中提取的一種黃酮類分子,具有抗腫瘤活性。葛根素可阻斷核因子-κB p65 (NF-κB p65)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)抑制乳腺癌細胞遷移、侵襲和黏附[6],還可通過降低葡萄糖代謝誘導胰腺癌細胞線粒體依賴性凋亡[7]。然而,葛根素在乳腺癌中的機制尚未明確,有待進一步探索。該研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接預測葛根素的潛在靶點和分子途徑,通過體內(nèi)外實驗進行驗證,為乳腺癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌細胞HCC1806和人正常乳腺上皮細胞MCF10A均購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。HCC1806細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中,MCF10A細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中。兩種培養(yǎng)基均含有10%胎牛血清、50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素,并置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2實驗動物 20只雄性BALB/c裸鼠,SPF級,8周齡,體質(zhì)量20～25 g,購自湖北貝恩特生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2021-0027]。

1.1.3藥物、試劑與儀器 葛根素購于上海源葉生物科技有限公司(批號:B20446)。RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:8121368)、DMEM培養(yǎng)基(批號:8123037)購自美國Gibco公司,DMSO(批號:ST038)購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。CO2培養(yǎng)箱(新加坡藝思高科技有限公司),超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),酶標儀(美國伯騰儀器有限公司),顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)收集 通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)收集乳腺癌和正常乳腺組織數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)集編號為GSE42568;收集線粒體疾病與對照組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)集編號為GSE42986。在線GEO2R分析差異性表達基因。使用韋恩圖分析乳腺癌與線粒體數(shù)據(jù)集之間的重疊基因。對重疊基因進行GO和KEGG功能富集分析,使用STRING數(shù)據(jù)庫分析重疊基因的相互作用網(wǎng)絡,使用Cytoscape可視化重疊基因相互作用網(wǎng)絡,并通過介數(shù)中心篩選核心基因。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)在線分析樞紐基因在乳腺癌患者中的差異性表達。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)下載對相關(guān)蛋白的乳腺癌和正常乳腺組織的免疫組化染色圖像。

1.2.2CCK-8細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細胞,以每孔5×103個細胞接種于96孔板(Corning,USA)中。然后,用不同濃度的葛根素(0、3、10和30 mol/L)處理細胞。處理24 h后,向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑,然后培養(yǎng)2 h,利用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.2.3細胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細胞,以每孔5×105個細胞接種于6孔板,培養(yǎng)箱中孵育24 h,融合率達到90%左右,用 20 μl無菌槍頭在孔內(nèi)垂直橫線劃痕,用 PBS洗除脫落細胞后,加入葛根素含1%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并在0、24 h顯微鏡下觀察各孔并拍照,每組實驗重復3次及以上。用 Image J 軟件測量劃痕面積,用 Graphpad Prism8軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.4Transwell細胞遷移侵襲實驗 將含5×104個細胞的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基200 μl加入上室,在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,在37 ℃條件下細胞浸潤24 h。4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,再用結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌3次,用棉簽去除上室細胞,顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5EdU細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細胞,以每孔5×103個細胞接種于24孔板,培養(yǎng)約24 h后葛根素干預。配制EdU工作液,等體積混合孵育2 h,去除培養(yǎng)液,PBS洗滌2次。免疫染色固定液室溫固定15 min,去除固定液,PBS洗滌2次,免疫染色強力通透液室溫孵育15 min,去除通透液,PBS洗滌2次。加入配制好的Click反應液,室溫避光孵育30 min,吸除反應液,PBS洗滌2次。加入預熱的細胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6TUNEL細胞凋亡實驗 葛根素誘導細胞凋亡,免疫染色固定液固定30 min。PBS清洗2次,含0.3% Triton X-100的PBS重懸細胞,室溫孵育5 min。PBS洗滌2次,用50 μl TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次,加入預熱的細胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7線粒體膜電位水平檢測 Mito-Tracker Red CMXRos是一種紅色線粒體特異性探針,用于檢測線粒體膜電位。取對數(shù)生長期乳腺癌細胞,以每孔5×103個細胞接種于24孔板,培養(yǎng)約24 h后葛根素干預。去除細胞培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,加入配制好的工作液,37 ℃避光孵育30 min。去除工作液,PBS洗滌2次,加入預熱的細胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8乳腺癌裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建及處理 本研究中所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學院實驗動物倫理委員會批準(批準號:2022-03-042),并按照當?shù)睾蛧H的動物護理和使用指南進行。雄性裸鼠在SPF級無菌動物室適應性飼養(yǎng)5 d。取對數(shù)期生長乳腺癌細胞消化離心后重懸,最終細胞濃度為4×106個/μl。裸鼠深度麻醉后,于裸鼠背部皮下注射接種,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型。當腫瘤平均體積約為50 mm3時,將裸鼠隨機分為對照組、葛根素給藥組。給藥組每日腹腔注射葛根素(按20 mg/kg給藥),對照組每日腹腔注射等量生理鹽水。14 d后處死小鼠,剝離瘤體計算體積,計算公式如下:體積=a×b2/2 (a=長,b=寬,單位為mm)。

1.2.9免疫組化實驗 瘤體組織進行常規(guī)脫水、包埋,制作石蠟切片(4 μm),脫蠟,抗原修復 20 min,PBS 漂洗 3 次,每次 10 min,過氧化氫孵化 10 min,PBS 漂洗 3 次, 每次 10 min,封閉液封閉 1 h,Ⅰ 抗(1 ∶100)孵育過夜,PBS 清洗3次,每次10 min,Ⅱ抗(1 ∶1 000)孵育 1 h,PBS 清洗3次, 每次10 min,DAB染色5 min,PBS清洗,蘇木精染色5 min,PBS 清洗,脫水、透明,中性樹脂封片,熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.10分子對接 分子對接PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載DST(ID為5YNV)結(jié)構(gòu);Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載葛根素二維(2D)結(jié)構(gòu);ChemBio3D優(yōu)化葛根素;Autodock_vina將葛根素分別與DST對接;OpenBabel(v2.3.1)39分離文件,添加氫鍵并分配可旋轉(zhuǎn)鍵和電荷;PDBQT進一步對接;PyMOL可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及線粒體相關(guān)基因差異性表達分析乳腺癌數(shù)據(jù)集GSE42568包含9 667個差異性表達基因(圖1A),線粒體疾病數(shù)據(jù)集GSE42986包含256個差異性表達基因(圖1B),兩個數(shù)據(jù)集的重疊基因共132個(圖1C)。使用GO和KEGG富集分析對132個重疊基因分析。GO功能富集分析得到生物過程、細胞組分和分子功能三方面的注釋和分類,將排名前8的條目繪制柱狀圖,結(jié)果見圖1D。KEGG通路富集篩選出3條信號通路,結(jié)果見圖1E。

圖1 乳腺癌和線粒體疾病相關(guān)基因分析

2.2 乳腺癌線粒體差異性表達基因相互作用網(wǎng)絡及核心基因分析將乳腺癌線粒體差異性表達基因相互作用在線分析并可視化,篩選出10個核心基因,結(jié)果見圖1F。GEPIA分析10個核心基因在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 085 例乳腺癌患者中,DST在乳腺癌組織中蛋白水平呈低表達,見圖2A。同時,HPA數(shù)據(jù)庫查詢到DST在免疫組化染色圖像中乳腺癌組織呈現(xiàn)更低的陽性率,見圖2B。分子對接結(jié)果顯示,葛根素可與DST蛋白的60位精氨酸、207位谷氨酸和277位天冬氨酸結(jié)合,結(jié)合能量為-9.2 kcal/mol,見圖2C。同時,免疫印跡結(jié)果顯示,DST蛋白的相對表達量給藥組(1.55±0.13)顯著高于對照組(1.00±0.05)(t=-6.74,P<0.05,n=3),見圖2D。

圖2 DST與乳腺癌的相關(guān)性分析

2.3 葛根素抑制乳腺癌細胞增殖CCK-8法檢測結(jié)果顯示,在3～30 μmol/L時葛根素對正常乳腺上皮細胞存活沒有顯著影響,但明顯抑制乳腺癌細胞存活,并隨著葛根素的濃度增大乳腺癌細胞存活率逐漸降低(P<0.05),IC50=14.51 μmol/L,后續(xù)給藥濃度選擇10 μmol/L,見圖3A。EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示,EdU陽性細胞給藥組(0.30±0.07)顯著少于對照組(0.73±0.07)(t=10.05,P<0.05,n=3),見圖3B。

圖3 葛根素對乳腺癌細胞存活率和增殖的影響

2.4 葛根素抑制乳腺癌細胞侵襲Transwell實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組細胞遷移穿過Transwell小室的細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),見表1和圖4A。劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組24 h后劃痕距離顯著增寬(P<0.05),見表1和圖4B。

表1 葛根素對乳腺癌細胞遷移的影響

圖4 Transwell和細胞劃痕實驗分析葛根素對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

2.5 葛根素誘導乳腺癌細胞凋亡TUNEL實驗結(jié)果顯示,乳腺癌細胞經(jīng)葛根素處理48 h后,凋亡率明顯增加(P<0.05),見表2、圖5A。同時免疫印跡實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組顯著增加凋亡因子Cleaved-Caspase3和Bax的表達水平,并下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(P<0.05),見表2、圖5B。

表2 葛根素對乳腺癌細胞凋亡水平的影響

圖5 TUNEL和免疫印跡分析葛根素對細胞凋亡的影響

2.6 葛根素降低線粒體功能Mito-Tracker Red 法檢測線粒體膜電位,結(jié)果顯示,葛根素處理后,與對照組(1.00±0.06)相比,給藥組(0.53±0.70)的相對熒光強度明顯減弱(t=9.16,P<0.05,n=3),見圖6。

圖6 葛根素對線粒體膜電位的影響 ×60

2.7 葛根素對乳腺癌移植瘤的影響HCC1806 細胞皮下異種移植瘤,連續(xù)給藥 14 d,與對照組相比,給藥組顯著減慢腫瘤的生長(P<0.05) ,見表3和圖7A。免疫組化顯示葛根素連續(xù)給藥14 d后,給藥組瘤體組織中DST陽性細胞明顯增加(P<0.05),見表3和圖7B。

表3 葛根素對乳腺癌皮下異種移植瘤體積以及瘤體組織DST表達的影響

圖7 葛根素對乳腺癌皮下異種移植瘤生長及對瘤體組織中DST表達的影響

3 討論

本研究顯示葛根素可能通過結(jié)合DST抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲,同時誘導其凋亡。DST是一種獨特的具有磷酸化酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì),是多種癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵蛋白質(zhì),并與不良臨床結(jié)果相關(guān)。DST的表達與肝癌、非小細胞癌、腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌以及乳腺癌患者的生存相關(guān)[8]。6.4%的肺癌患者據(jù)報告存在DST基因改變,DST基因組擴增的患者表現(xiàn)出較差的生存率[9]。DST可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)移促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移并增加隨后的化療耐藥性[10]。DST低表達也可增加細胞周期蛋白依賴性激酶14表達,并促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲,并增加體內(nèi)的致瘤性[11]。DST基因突變通過激活ERK1/2和 MMP2/9信號通路,促進單發(fā)纖維性腫瘤/血管外皮細胞瘤細胞轉(zhuǎn)移[12]。在慢性化療藥物治療存活的三陰性乳腺癌患者的細胞中發(fā)現(xiàn)DST的表達量明顯高于未治療組[13]。因此,DST可作為癌癥治療的一個有效靶標。

DST的穩(wěn)定與線粒體的完整性密切相關(guān),從而維持有效的線粒體形態(tài)和生理功能。DST過表達可在應激條件下抑制線粒體磷酸化解偶聯(lián),減少ATP形成,引發(fā)線粒體功能障礙及線粒體適用性降低,從而抑制肺癌的進展[9]。DST可激活線粒體動力相關(guān)蛋白1介導的線粒體分裂,降低氧化磷酸化和糖酵解,從而促進多形性膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲性[14]。本研究表明葛根素可降低線粒體功能。因此,推測葛根素通過激活DST表達降低線粒體功能從而抑制腫瘤的進程。

本研究創(chuàng)新點在于通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)篩選出核心基因DST,然后進行體內(nèi)和體外實驗驗證DST在乳腺癌中的作用及可能機制,為后期研究乳腺癌治療方法提供了新思路和新靶點。然而,本研究未深入探討DST蛋白在乳腺癌中的作用機制,在后續(xù)研究中可將DST作為靶點采用藥理學方法激活或抑制其活性、病毒學方法過表達或敲降該基因,分析其下游信號的改變,從而闡明其在乳腺癌中的作用機制。

(致謝:感謝湖北科技學院基礎醫(yī)學院胡美純博士在乳腺癌移植瘤實驗中提供的支持和幫助。)