脂多糖通過TREK-1參與妊娠子宮收縮調控的機制研究

汪星星,俞慧慧,李 璇,尹宗智

早產是指妊娠28周后、37周之前發生的分娩,早產發生危害巨大[1]。要實現早產的提前干預,需要從源頭明確早產的病因。以往的研究[2-3]表明,炎癥感染與早產發生密切相關。但感染如何觸發孕期子宮平滑肌細胞收縮增強引起早產的機制尚不明確。子宮平滑肌細胞由舒張狀態轉變為收縮狀態的過程,是分娩發動的關鍵節點。子宮平滑肌細胞受到特定信號的刺激,引起細胞膜去極化,產生動作電位,導致細胞收縮。雙孔鉀離子通道(TWIK-related K+channel 1, TREK-1)是一種雙孔鉀離子通道蛋白,在哺乳動物妊娠子宮中高表達,受多種理化因素調控,在開放鉀離子外流及維持平滑肌細胞靜息狀態中發揮重要作用[4]。然而TREK-1在炎癥性早產中發揮的作用尚未可知。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理妊娠小鼠及細胞被廣泛用于早產研究[5]。該研究使用C57BL/6J小鼠和原代妊娠小鼠子宮平滑肌細胞分別建立LPS炎癥模型,檢測LPS處理組織的收縮變化,以及妊娠子宮平滑肌細胞上高表達的TREK-1蛋白的收縮調控作用,從組織和細胞水平探討LPS對妊娠子宮平滑肌收縮調控的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器LPS(貨號:0111:B4)、TREK-1抗體、花生四烯酸、Ⅱ型膠原酶、脫氧核糖核酸酶I、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;GAPDH購自北京中杉金橋公司;縮宮素購自美國MedChemExpress公司;KCl購自Biosharp生物技術有限公司;RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司;DAPI染色液及防熒光淬滅封片液購自北京索萊寶生物公司;多通道生理信號采集系統(型號:RM6240E)購自中國成都儀器廠;超高分辨率激光共聚焦顯微鏡(型號:LSM880)購自德國蔡司公司。

1.2 實驗動物C57BL/6J小鼠,SPF級,8周齡,體質量為 22～25 g,購自合肥青源生物科技有限公司,飼養于無特定病原體(SPF)環境,12 h的光/暗周期(07:00—19:00),自由獲取食物和水。適應性飼養1周后,按雌雄2 ∶1進行合籠,次日清晨觀察有無陰道栓,若觀察到陰栓記為妊娠第0天。受孕小鼠隨機分為對照組、LPS組,LPS組小鼠在妊娠第16天時腹腔注射20 μg的LPS。對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。注射8 h后以二氧化碳窒息法處死小鼠。所有動物實驗均經過安徽醫科大學機構動物保護與使用委員會審查和批準(倫理編號:20211044)。

1.3 原代細胞培養及處理分離原代妊娠小鼠子宮平滑肌細胞。取孕晚期小鼠子宮,用無菌刀片將子宮內膜和上皮輕輕刮離子宮肌層表面,然后用組織剪刀將子宮肌層盡量剪碎,向剪碎的子宮組織加入含Ⅱ型膠原酶、脫氧核糖核酸酶、牛血清白蛋白的細胞消化液消化,然后置于搖床上37 ℃孵育1 h。消化后的溶液經100 μm過濾器過濾,去除組織碎片后將濾液轉移到無菌離心管中,以1 000 r/min離心5 min,丟棄上層。將細胞沉淀物重懸于10%完全培養基中,細胞懸液置于25 cm2的細胞培養瓶中,置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。培養24 h待細胞貼壁進行第1次換液,以后每2～3 d換液1次,待細胞融合達80%時用胰蛋白酶-EDTA混合液消化傳代。將小鼠子宮平滑肌細胞用不同濃度的LPS處理,其中LPS(0 μg/ml)組僅用完全培養基培養24 h,LPS(10 μg/ml)組和LPS(20 μg/ml)組分別用含有10 μg/ml和20 μg/ml LPS的完全培養基處理24 h。

1.4 等長收縮實驗取離體的小鼠子宮,顯微鏡下清除結締組織。立即將子宮浸泡在Krebs液(120 NaCl,5.9 KCl,25 NaHCO3,1.2 NaH2PO4,11.5葡萄糖,2.5 CaCl2,1.2 MgCl2,單位:mmol/L) 中備用。將子宮組織沿肌肉縱軸切成7 mm×3 mm大小的肌條用于收縮實驗,肌條垂直懸掛在含有5 ml Krebs溶液的37 ℃恒溫水浴槽中,含95% O2和5% CO2的混合氣體持續泵入Krebs溶液。每個子宮條的一端固定在恒溫水浴槽底部,另一端連接在張力傳感器上。課題組前期研究[6]證實,子宮肌條在2 g拉伸時的收縮性能最優。記錄等長收縮的變化,在產生穩定和規則的收縮曲線后,用96 mmol/L KCl和不同濃度的縮宮素(10-11～10-6mol/L)刺激對照組和LPS組小鼠的子宮肌條,并記錄收縮反應。為了確定TREK-1是否參與LPS引起的子宮收縮變化,在TREK-1激活劑花生四烯酸(arachidonic acid, AA) (10-5mol/L)存在的情況下進行收縮實驗,最后對子宮肌條進行稱重校準。采用多通道生理信號采集系統(RM6240E,中國成都儀器廠)計算收縮曲線的曲線下面積(area of the contraction curve, AUC),然后將該值除以肌肉條的質量,得到AUC/g,定量分析子宮肌條的收縮力。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平使用含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液分別提取各組妊娠小鼠子宮平滑肌細胞與妊娠小鼠子宮平滑肌組織的總蛋白,BCA 法檢測并調整蛋白濃度,通過SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白,然后將蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上。將膜在用TBST緩沖液配置的5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后在TREK-1(1 ∶200)兔多克隆抗體中4 ℃下孵育過夜,以GAPDH(1 ∶2 000)作為內參。TBST緩沖液洗去一抗,室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗 (1 ∶10 000) 2 h;TBST緩沖液洗去二抗,加入ECL發光液,曝光顯影,使用Image J軟件分析顯影條帶的灰度值,并對蛋白表達定量。

1.6 免疫熒光

1.6.1組織免疫熒光 取小鼠子宮,石蠟包埋組織后切片,切片脫蠟水化后分別以0.5% TritonX-100通透、改進型檸檬酸鈉抗原修復,PBS清洗后以10%驢血清封閉2 h,一抗(TREK-1:1 ∶100)4 ℃過夜孵育。次日回收一抗,復溫40 min后PBS洗滌,滴加熒光二抗室溫避光孵育2 h后,PBS洗滌。DAPI孵育10 min,PBS洗滌后滴加防熒光淬滅劑,封片,固定,激光共聚焦成像顯微鏡下觀察、拍照。使用Image J軟件進行分析,并對熒光強度定量。

1.6.2細胞免疫熒光 將細胞接種于6孔板內的圓形蓋玻片上,按照上述分組及處理后,各組去除培養液,加入PBS 洗滌3次,然后加入適量4%多聚甲醛固定30 min后棄去,PBS洗滌后加入0.5% TritonX-100通透30 min,加入5% BSA封閉1 h,隨后一抗(TREK-1:1 ∶100)4 ℃孵育過夜;次日,回收一抗,PBS洗滌后用熒光標記二抗避光孵育1 h,期間注意避光操作。PBS洗滌,DAPI孵育10 min,再次用PBS洗滌;取適量抗熒光淬滅劑滴加在載玻片上,封片,固定,用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。使用Image J軟件進行分析,并對熒光強度定量。

2 結果

2.1 LPS組小鼠子宮收縮力增強為了研究LPS對子宮收縮的影響,用96 mmol/L KCl和濃度遞增的縮宮素刺激子宮肌條。LPS組小鼠子宮肌條對KCl刺激反應迅速,收縮力迅速達到峰值,此后一直保持在較高水平。對照組小鼠的子宮肌條對KCl反應也迅速,但收縮力峰值低于LPS組水平。LPS組KCl刺激子宮肌條5 min時產生的收縮力總和顯著高于對照組(P<0.000 1),見圖1A。對照組和LPS組子宮肌條收縮力對縮宮素的響應呈濃度依賴性,縮宮素誘導的子宮肌條收縮曲線呈周期性振蕩,收縮頻率隨縮宮素濃度的增加而增加,收縮力峰值隨縮宮素濃度的增加而增加。縮宮素處理下,LPS組誘導的子宮肌條收縮力較對照組強(F=9.242,P<0.05),各濃度亞組縮宮素誘導的收縮均顯示LPS組較對照組強(P<0.05),見圖1B。

圖1 妊娠小鼠子宮組織的收縮力(n=3)

2.2 LPS組小鼠子宮組織TREK-1蛋白表達降低對妊娠小鼠子宮組織中提取的總蛋白進行Western blot分析,在47 ku位置檢測到TREK-1對應的條帶。LPS組小鼠子宮平滑肌組織中TREK-1 蛋白水平明顯低于對照組(P<0.000 1),見圖2A。同時采用免疫熒光法觀察子宮平滑肌組織中的TREK-1表達情況,結果表明LPS顯著降低組織中TREK-1的表達(P<0.000 1),見圖2B。

圖2 TREK-1在小鼠子宮組織中的表達 (n=3)

2.3 激活TREK-1可降低LPS激發的小鼠子宮收縮為了確定子宮條之間的收縮差異是否與TREK-1有關,使用TREK-1激動劑AA(10-5mol/L)預處理LPS組小鼠子宮條1 h,與未經AA預處理的LPS組小鼠子宮肌條相比,發現AA可顯著降低LPS組小鼠KCl(圖3A,P<0.01)和縮宮素(圖3B,F=18.48,P<0.05)誘導的子宮收縮。各濃度亞組縮宮素誘導的收縮均顯示加AA處理后子宮組織收縮減弱(P<0.05),見圖3B。

圖3 TREK-1參與的妊娠子宮收縮調控(n=3)

2.4 LPS對原代妊娠小鼠子宮平滑肌細胞的TREK-1蛋白表達沒有影響對提取的原代妊娠小鼠子宮平滑肌細胞給予不同濃度的LPS刺激, Western blot分析結果顯示在47 ku位置檢測到TREK-1對應的條帶,但是LPS刺激并不能降低小鼠子宮平滑肌細胞TREK-1蛋白表達(F=1.67,P>0.05)。采用細胞免疫熒光觀察子宮平滑肌細胞TREK-1蛋白的表達和位置,結果顯示LPS未對子宮平滑肌細胞TREK-1蛋白的表達及定位產生影響(F=2.443,P>0.05)。見圖4。

圖4 TREK-1在小鼠子宮平滑肌細胞中的表達(n=3)

3 討論

TREK-1是在子宮平滑肌組織中表達的雙孔鉀離子通道蛋白,既往研究[6-7]表明,TREK-1激活劑AA可顯著降低人子宮肌條的收縮力,而在使用TREK-1 通道特異性抑制劑L-甲硫氨酸抑制通道功能后,大鼠子宮組織的收縮力顯著增強,證實了TREK-1在調節子宮收縮力中的重要性。TREK-1受溫度、pH、拉伸、AA、L-甲硫氨酸、黃體酮等因素調節,有研究[4]也證實TREK-1蛋白表達升高在妊娠期糖尿病患者子宮收縮減弱中起重要作用,高糖通過TREK-1參與了妊娠期子宮平滑肌收縮的調節。而本研究首次將TREK-1與炎癥性早產關聯,TREK-1可能是未來調節子宮收縮力和治療炎癥性早產的潛在靶點。然而直接使用LPS刺激妊娠小鼠子宮平滑肌細胞發現,TREK-1蛋白并沒有出現與組織上相同的表現,這提示LPS通過TREK-1實現的收縮調控可能需要細胞間信號的作用。

細胞間相互作用是指在生物體內不同細胞之間通過信號傳導、物質交換等方式進行的相互影響和調控。細胞之間可以通過配體、受體、代謝物等信號分子進行信號傳遞,并構成復雜的相互作用網絡,從而與細胞內調控網絡一并實現對細胞形態與功能的動態調控。細胞間相互作用在多細胞生物的發育和功能中起著至關重要的作用[8-9]。Boros-Rausch et al[10]在關于LPS誘導人子宮肌細胞炎癥進而影響收縮的研究中發現,廣譜趨化因子抑制劑通過抑制子宮肌細胞促炎細胞因子分泌、收縮相關蛋白表達和破壞肌細胞與組織巨噬細胞的相互作用來阻止感染誘導的子宮平滑肌細胞收縮。Zhang et al[11]的另一項研究指出,在LPS誘導的小鼠早產模型中,LPS不僅顯著和特異性地誘導肌層中細胞因子CXCL12的表達,還可增強免疫細胞的浸潤,體外研究中LPS處理的原代平滑肌細胞條件培養基有誘導巨噬細胞遷移、M1極化和上調炎癥相關細胞因子的作用。這些研究結果提示,LPS對子宮平滑肌收縮的影響是通過多種細胞與細胞間相互作用實現的。大量證據表明,早產發生時子宮內胎盤、羊膜、蛻膜和子宮肌層均有炎癥發生[10,12]。在LPS誘導的小鼠早產模型中,可能存在子宮平滑肌與子宮內不同組織以及其內的免疫細胞、細胞因子間相互作用。通過多種細胞間相互作用,實現妊娠子宮平滑肌細胞收縮與收縮關鍵信號TREK-1蛋白的調控變化,而非LPS直接作用于子宮平滑肌細胞。這進一步提示,在炎癥性早產研究中不能完全以離體細胞實驗代替整體動物及組織學實驗。離體細胞實驗無法模擬復雜器官中存在的所有分子和細胞與細胞間相互作用。

綜上所述,LPS通過降低妊娠小鼠子宮組織中的TREK-1表達及功能,使得子宮組織的收縮能力增強,但在細胞層面上卻沒有發現相同的作用,這可能與細胞間相互作用有關。然而本研究僅從組織和細胞層面對LPS以及相關的TREK-1蛋白及功能方面進行了初步的探討,截止目前尚未發現LPS影響平滑肌細胞膜上TREK-1存在的具體細胞間信號傳遞通路,需要進一步研究完善。目前已知炎癥感染會伴隨內環境酸堿度的變化[13],而TREK-1的表達受酸堿度調控[4]。因此酸堿度是否參與炎癥感染對TREK-1的調控是未來的重要研究方向。