基于Wnt/β-catenin信號通路探討子宮內(nèi)膜來源間充質(zhì)干細胞抑制子宮內(nèi)膜纖維化的機制

靳 濤,顏望碧,殷 琦

子宮內(nèi)粘連(intrauterine adhesion,IUA)是阻礙生育的幾大難題之一,其由子宮內(nèi)膜纖維化引起并導(dǎo)致功能性子宮內(nèi)膜部分或全部喪失[1]。目前認為,子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙可能是IUA形成的主要機制[2]。因此,探索恢復(fù)子宮內(nèi)膜的正常組織結(jié)構(gòu)和功能的有效治療方法,對于改善IUA患者的子宮生育功能具有重要意義。近年來研究[3]強調(diào)了干細胞移植作為IUA治療的替代選擇策略。研究[4-5]表明,少量間充質(zhì)干細胞和子宮內(nèi)膜干/祖細胞持續(xù)存在于子宮內(nèi)膜中,可促進月經(jīng)脫落后的子宮內(nèi)膜再生。因此,自體或同種異體干細胞移植可用于治療IUA[6]。子宮內(nèi)膜來源間充質(zhì)干細胞(endometrial mesenchymal stem cells,eMSCs)位于人類子宮內(nèi)膜的基底層和功能層,并參與組織重塑,其是維持子宮內(nèi)膜再生能力所必需的[7]。有研究[8]顯示,當(dāng)eMSCs異種移植到小鼠腎被膜下時,可重建子宮內(nèi)膜間質(zhì),表明其再生潛力。該研究在IUA大鼠模型中評估eMSCs促進子宮內(nèi)膜再生的能力,并探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司),4%多聚甲醛、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、PKH26親脂性紅色熒光連接染料(美國Sigma公司),抗p-Keratin、抗CK7、Vimentin、N-cadherin、CyclinE、C-myc、Axin2、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、抗Ⅰ型膠原、Vimentin和抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)(美國Abcam公司),RIPA裂解緩沖液(北京Solarbio公司),BCA蛋白檢測試劑盒(美國Thermo Scientific公司),PVDF膜(美國Millipore公司),抗抗ZEB1、E-cadherin (美國CST公司)。FACS Canto Ⅱ流式細胞儀和FACSCount Ⅱ軟件(美國BD Biosciences公司),直立顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司),生物成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)人eMSCs購自杭州易文賽生物技術(shù)有限公司。細胞維持在補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每3 d更換一次培養(yǎng)基。在細胞培養(yǎng)物達到匯合后,用EDTA/胰蛋白酶溶液對細胞進行傳代培養(yǎng)。第3～5代的eMSCs用于研究其特性[9]。

1.3 流式細胞術(shù)使用FACS Canto Ⅱ流式細胞儀表征eMSCs的表面標記。將1×106個細胞用一組抗體染色1 h:異硫氰酸熒光素(FITC)-CD45、藻紅蛋白(PE)-CD34、別藻藍蛋白-CD90、PE-CD74、PE-CD44、PE-CD106和同種型匹配的對照。用PBS洗滌細胞2次。使用FACSCount Ⅱ軟件對表面標記表達進行定量。

1.4 PKH26熒光染料標記的骨髓基質(zhì)細胞為了追蹤移植后eMSCs的分布,收集細胞并用PKH26標記。PKH26親脂性紅色熒光連接染料。當(dāng)eMSCs達到80%匯合時,加入含有1 ml稀釋劑C和4 μl PKH26試劑的培養(yǎng)基。然后,將混合物在離心管中混合,并在室溫下孵育5 min。隨后,加入2 ml胎牛血清以停止染色。棄去上清液,將細胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。在熒光顯微鏡下檢測PKH26標記的eMSCs。在將細胞移植到大鼠的子宮腔中之前,將細胞維持在生長培養(yǎng)基中。

1.5 實驗動物雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司,體質(zhì)量220～250 g,年齡8～12周。環(huán)境溫度保持在22～24 ℃,相對濕度為70%～85%,自由進食和飲水。每天08:00-10:00取大鼠陰道涂片觀察發(fā)情周期。選擇發(fā)情周期正常的大鼠進行實驗。所有大鼠在發(fā)情期進行手術(shù),手術(shù)前12 h禁食。

1.6 IUA大鼠模型的建立參照文獻[10]方法,通過制造由機械損傷和LPS外科縫合組成的雙重損傷,建立了IUA大鼠模型。將18只雌性SD大鼠隨機分為假手術(shù)(Sham)組、Model組和eMSCs組,每組6只。Sham組大鼠在剖腹手術(shù)后不接受任何形式的子宮介入手術(shù)。在Model組和eMSCs組中,每只大鼠的左側(cè)子宮在剖腹后用機械性子宮內(nèi)膜損傷和LPS溶液的組合進行處理;右側(cè)子宮未進行任何治療。將大鼠麻醉,以仰臥位固定在手術(shù)臺上。在子宮的遠端做一個小的縱向切口(長約0.3 cm)。然后用16 G的針刮去子宮內(nèi)膜。接下來,將0.3～0.5 ml LPS溶液(10 mg/L)緩慢注入子宮腔。30 min后,除去LPS溶液。eMSCs組在模型損傷后立即給予治療,移植的eMSCs細胞懸液總量為每子宮0.05 ml(2×107細胞/ml)[11];用1 ml注射器將它們注射到子宮漿膜下。在第3周對所有大鼠實施安樂死,收集單側(cè)損傷子宮用于以下實驗。

1.7 蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色將子宮內(nèi)膜組織樣品在4%多聚甲醛中固定24 h,然后在脫水和透明化后包埋在石蠟塊中。將石蠟包埋切片切成4 μm連續(xù)切片,并根據(jù)常規(guī)程序進行HE和Masson染色。使用直立顯微鏡觀察切片。選擇3個不同的高倍視野,分別用HE和Masson染色計算子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量和纖維化程度。使用Image J對各組的平均比例進行統(tǒng)計分析。

1.8 免疫組織化學(xué)染色將樣品固定在4%多聚甲醛中并包埋在石蠟中。橫向石蠟切片使用二甲苯脫蠟,通過一系列酒精梯度再水合。然后,將切片在3%過氧化氫中孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性,并與下列一抗孵育2 h:抗p-Keratin(1 ∶200)、抗CK7(1 ∶200)、Vimentin(1 ∶200)和抗α-SMA(1 ∶200)。隨后,用抗兔或抗小鼠免疫球蛋白(IgG)二抗處理切片。在高倍顯微鏡下觀察陽性染色細胞的數(shù)量,并在5個隨機選擇的視野中定量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡分析從大鼠子宮組織中提取總蛋白樣品,并使用RIPA裂解緩沖液裂解,然后使用無菌剪刀勻漿。在冰上裂解1 h后,將提取物以12 000 r/min離心20 min,然后收集上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品(30 μg)在10% SDS-PAGE凝膠上分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h,并在4 ℃下與下列初級抗體一起孵育過夜:抗N-cadherin(1 ∶1 000)、CyclinE(1 ∶1 000)、C-myc(1 ∶1 000)、Axin2(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、抗I型膠原(1 ∶1 000)、抗ZEB1 (1 ∶1 000)、抗α-SMA (1 ∶2 000)、抗E-cadherin(1 ∶1 000)、抗Vimentin(1 ∶2 000)。用PBS洗滌膜3次,然后與第二抗體在37 ℃黑暗中孵育1 h。最后,在生物成像系統(tǒng)中使用ECL對蛋白質(zhì)進行可視化。GAPDH被用作內(nèi)部對照來標準化目標蛋白質(zhì)的相對表達。使用Image J軟件分析條帶的密度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)至少重復(fù)了3次獨立實驗,以平均值±標準差表示。兩組均數(shù)比較采用t檢驗,三組及以上均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eMSCs的體外培養(yǎng)和表型鑒定當(dāng)eMSCs擴增并傳代至第三代,細胞趨于穩(wěn)定并呈現(xiàn)成纖維細胞樣形態(tài),并以螺旋模式排列。然后對eMSCs的成脂和成骨分化進行鑒定,結(jié)果表明,在相應(yīng)的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后,細胞形態(tài)由原來的長梭形變?yōu)閳A形,細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡,茜素紅染色顯示細胞中出現(xiàn)鈣化的細胞外基質(zhì),表明eMSCs可以分化為成骨細胞。油紅O染色顯示細胞內(nèi)形成脂滴,表明eMSCs可以分化為脂肪細胞(圖1A)。通過流式細胞儀檢測細胞表面表型。如圖1B所示,細胞表面標志物CD44、CD73、CD90和CD105呈陽性表達,而CD34和CD45陰性表達。這些結(jié)果與間充質(zhì)干細胞的特性一致。

圖1 eMSCs的體外培養(yǎng)、分化和鑒定

2.2 PKH26標記eMSCs的遷移為了追蹤和確定eMSCs是否能遷移到受損的子宮內(nèi)膜以修復(fù)組織再生,P3代細胞用紅色熒光細胞膜染料PKH26標記并移植到IUA模型中。對冰凍OCT包埋的子宮組織切片進行觀察,發(fā)現(xiàn)隨著移植時間的延長,子宮內(nèi)膜腺體周圍分散的紅色熒光分布增加。表明eMSCs可遷移到受損的子宮內(nèi)膜。見圖2。

圖2 PKH26標記的eMSCs體內(nèi)示蹤 × 100 A:1 d;B:3 d;C:5 d

2.3 eMSCs改善子宮內(nèi)膜損傷在第3周收集各組子宮組織,觀察eMSCs治療在促進子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能方面的作用。HE染色結(jié)果顯示,Sham組宮腔形態(tài)規(guī)則,大量單層柱狀上皮細胞覆蓋子宮和腺腔,上皮細胞結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)腺體豐富,呈橢圓形。Model組宮腔結(jié)構(gòu)破壞,腺體數(shù)量明顯減少(P<0.001),結(jié)締組織碎片增多,但在eMSCs治療后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量顯著增加(P<0.001)(圖3A、3B)。Masson染色顯示Sham組子宮內(nèi)膜間質(zhì)中幾乎沒有藍色膠原沉積。相比之下,Model組宮腔內(nèi)形成并積聚大量藍色膠原纖維,形成明顯的粘連帶,但在eMSCs治療后纖維化面積的比例顯著降低,膠原纖維排列有序(圖3A、3C)。三組在子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量和子宮內(nèi)纖維化面積的比例存在顯著差異(F=35.47、25.32,P<0.001)。

圖3 eMSCs對子宮內(nèi)膜形態(tài)恢復(fù)的影響

2.4 eMSCs減少子宮內(nèi)膜纖維化三組在I型膠原和α-SMA的表達水平存在顯著差異(F=14.56、24.71,P<0.001);與Sham組相比,Model組中I型膠原和α-SMA蛋白的表達水平顯著增加(P<0.05),但在eMSCs組中I型膠原和α-SMA蛋白的表達水平均顯著減少(P<0.05)(圖4A)。同時,免疫組織化學(xué)染色顯示,α-SMA的表達在Model組中顯著增加,纖維化程度加重,而在eMSCs組中降低(圖4B、4C)。此外,通過免疫組織化學(xué)染色評估了p-Keratin的表達,一種腺上皮標志物。如圖4B所示,與Sham組相比,Model組中p-Keratin陽性染色顯著增加(P<0.05),并且eMSCs組中p-Keratin陽性染色較Model組進一步增加(P<0.05)(圖4C)。

圖4 eMSCs治療后子宮內(nèi)膜纖維化的變化

2.5 eMSCs抑制EMT的發(fā)生三組在N-cadherin、Vimentin、ZEB1和E-cadherin的表達水平存在顯著差異(F=12.83、21.37、15.60、14.49,P<0.001);在Model組中,N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表達顯著增加,而E-cadherin的表達減少。然而,在eMSCs組中,上述分子蛋白質(zhì)的變化完全相反(圖5A)。為了進一步驗證eMSCs治療對EMT的影響,進行免疫組織化學(xué)染色以分析CK7和Vimentin在子宮腔中的豐度和分布。結(jié)果顯示Model組中CK7幾乎不表達,而Vimentin表達顯著升高。在eMSCs治療后,CK7表達顯著增加,并且主要位于腺體和周圍組織中,而Vimentin的表達減少,并且主要位于子宮內(nèi)膜間質(zhì)中(圖5B、5C)。

圖5 eMSCs抑制EMT的發(fā)生

2.6 eMSCs治療對Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響三組在β-catenin、C-myc和CyclinE的表達水平存在顯著差異(F=10.96、13.16、8.72,P<0.001);與Sham組相比,Model組β-catenin和C-myc表達增加(P<0.05)。與Model組相比,eMSCs組中CyclinE、β-catenin和C-myc表達增加(P<0.05),見圖6。

圖6 Wnt信號通路核心分子在子宮內(nèi)膜的表達

3 討論

IUA的常見治療方案包括宮腔鏡粘連松解術(shù)和激素治療。盡管IUA的治愈率有所提高,但復(fù)發(fā)率仍然很高,治療仍然是一個挑戰(zhàn)[12]。據(jù)報道,子宮內(nèi)膜的再生和修復(fù)依賴于基底層干細胞的增殖和分化[10]。最近,用間充質(zhì)干細胞理論治療IUA引起了廣泛關(guān)注。研究[13]表明,eMSCs可以遷移到子宮腔的損傷區(qū)域以促進子宮內(nèi)膜再生。PKH26是一種簡單有效的體內(nèi)示蹤標記技術(shù),可以追蹤MSC的遷移和分布。本研究將PKH26標記的eMSCs移植到IUA模型的子宮腔中,發(fā)現(xiàn)eMSCs主要位于子宮內(nèi)膜腺體和周圍基質(zhì)中,表明eMSCs可能分化為上皮細胞,促進受損子宮內(nèi)膜修復(fù)。此外,隨著移植時間的延長,eMSCs逐漸增加。這些結(jié)果表明,eMSCs可能參與促進子宮內(nèi)膜修復(fù),這與相關(guān)研究[14]結(jié)果一致。

細胞療法是臨床醫(yī)學(xué)的一個新興領(lǐng)域。許多成人干細胞或多能細胞衍生物正應(yīng)用于治療慢性和退行性疾病的臨床試驗中,最常見的是骨髓間充質(zhì)干細胞,其次是干細胞[4]。盡管用于細胞治療的間充質(zhì)干細胞有很多來源,但用于子宮內(nèi)膜修復(fù)的研究很少。證據(jù)表明,eMSCs可能為子宮內(nèi)膜修復(fù)提供一種改進的治療選擇。eMSCs是具有高增殖潛力的小群體,其能分化成大的腺樣結(jié)構(gòu),并能在常規(guī)活檢中輕易獲得[15]。先前研究[16]顯示,皮下筋膜缺損模型大鼠接種了eMSCs后,缺損部位血管分布密度更高,并在接種細胞的周圍形成卷曲的、更有組織的膠原纖維沉積,表明eMSCs可能促進生理膠原的產(chǎn)生,這有助于生物力學(xué)性能的改善。在體外,eMSCs可分化為表達平滑肌-肌球蛋白重鏈的平滑肌細胞和產(chǎn)生膠原的成纖維細胞,伴隨著SUSD2表達的下調(diào)[17]。成纖維細胞和平滑肌細胞是再生人陰道壁以及合成和組織細胞外基質(zhì)的理想細胞類型。本研究顯示,在IUA大鼠模型中施用eMSCs明顯增加了子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量并降低了子宮內(nèi)膜纖維化的程度,這與以前的研究[11]結(jié)果一致,表明eMSCs治療可以通過減少子宮內(nèi)膜纖維化來促進子宮內(nèi)膜修復(fù)。因此,eMSCs移植可用于治療大鼠子宮內(nèi)膜損傷。在未來的研究中,將繼續(xù)深入探討如何提高eMSCs在子宮內(nèi)膜修復(fù)中的利用率,以更好地促進eMSCs遷移和分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞。

IUA最重要的病理特征是子宮內(nèi)纖維化[18]。纖維連接蛋白、I型膠原和α-SMA是纖維形成的特異性標志,與細胞纖維化密切相關(guān)。在目前的研究中,這些標志物的表達在eMSCs治療組中顯著降低,表明eMSCs抑制了纖維化的進展,并有助于子宮內(nèi)膜上皮的修復(fù)。在IUA期間,EMT總是伴隨著纖維化[19]。因此,本課題組還探討了eMSCs對EMT的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明eMSCs治療組上皮標志物的表達增加,間質(zhì)標志物的表達減少,表明eMSCs可以通過逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生促進上皮再形成。先前的研究[20]表明,Wnt/β-catenin信號通路與子宮內(nèi)膜纖維化中的EMT密切相關(guān)。因此,本研究探討了Wnt信號在eMSCs移植治療IUA中的作用和機制。在eMSCs組IUA大鼠模型中,在子宮組織中檢測到Wnt信號傳導(dǎo)中關(guān)鍵蛋白的表達。