靶向STAT3通過調控糖酵解及間皮間充質轉分化改善腹膜透析相關腹膜纖維化

鄧啟磊, 符 姣,李 楠,何萌萌,黃大可,張 培

腹膜透析作為終末期腎病患者的一種治療方式,其使用在全球范圍內正在增加[1]。腹膜透析相關性腹膜纖維化是腹膜透析最常見的并發癥之一。信號轉導和轉錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3) 參與多種生物學過程,對細胞增殖、存活、分化和血管生成起到重要調節作用[2-3]。在高糖腹膜透析液誘導的小鼠腹膜纖維化模型和高糖刺激的間皮細胞以及脫落的人腹膜間皮細胞中發現STAT3 信號活化,且對STAT3的藥理抑制可通過調控缺氧誘導因子-1α減輕間皮細胞的上皮-間充質轉化[4]。間皮-間充質轉化(mesothelial-mesenchymal transition,MMT)是發生于胸膜、腹膜等間皮細胞的Ⅱ型上皮-間充質轉化,在致腹膜纖維化等過程中發揮重要作用。暴露于葡萄糖腹膜透析液會導致間皮細胞過度糖酵解,促進細胞表型轉變和增殖[5]。該研究旨在探討高糖是否通過激活STAT3上調 HMrSV5糖酵解相關酶的表達和促進MMT,闡明STAT3與糖酵解的交互對話機制以及抑制STAT3對腹膜透析過程中腹膜纖維化和血管新生的影響,為腹膜纖維化防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只,180～200 g,SPF級,4～6周齡,由安徽醫科大學實驗動物中心提供(批準號:LLSC20211055)。整個實驗期間,給予所有大鼠標準飲食,自由飲水,適應性飼養1周后開始正式實驗,整個實驗周期為10周。

1.1.2實驗藥物和主要試劑 STAT3抑制劑BP-1-102(S776901)購自Selleck公司,化學式:C29H27F5N2O6S,分子量:626.59,BP-1-102是高效的特異性的STAT3小分子抑制劑,可抑制Stat3與pTyr肽段的相互作用和STAT3的激活。人腹膜間皮細胞系(HMrSV5)來源于上海子實生物科技有限公司。通用二步法試劑盒PV-6000、DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術有限公司;胎牛血清、MEM培養基購自美國Gibco公司;葡萄糖購自美國Sigma公司。兔抗p-STAT3克隆抗體和鼠抗STAT3多克隆抗體購自美國CST公司;兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶-3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)購自美國Affinity Biosciences公司;鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔/鼠IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司;增強化學發光(ECL)試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、無蛋白快速封閉液均購自上海雅酶生物科技有限公司;PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1高糖腹膜透析液誘導建立腹膜纖維化大鼠模型 所有雄性SD大鼠在安徽醫科大學實驗動物中心的特定無病原體條件下飼養。將動物分為3組(n=6):假手術組、模型組和STAT3抑制劑組。在大鼠背側皮膚下手術植入微型腹膜透析導管,導管尖端置于腹膜內。假手術組:除了植入微型腹膜透析導管外,不進行其他任何處理;模型組:每天早晚通過腹膜透析導管注射10 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液 (peritoneal dialysis fluid,PDF)誘導腹膜纖維化; STAT3抑制劑組:為了探索靶向抑制 STAT3 對腹膜纖維化的影響,STAT3抑制劑BP-1-102以1 mg/kg 的劑量溶于10 ml含4.25%葡萄糖的 PDF中,并通過腹膜透析導管給藥。10周后,對大鼠進行腹膜平衡實驗并收集大鼠腹膜組織及PDF用于進一步分析。

1.2.2腹膜平衡實驗 在大鼠吸入麻醉后,給予腹腔注射20 ml 4.25%PDF,并在腹腔保留90 min。90 min后吸入麻醉下剪開大鼠腹腔,用注射器吸出PDF,記錄PDF總量,計算超濾量,超濾量=腹腔最后的出液量-20 ml。

1.2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 大鼠腹膜組織用4%多聚甲醛固定48 h,包埋在石蠟中,制成3 μm厚的切片,切片常規脫蠟后通過濃度梯度的二甲苯和乙醇進行洗脫再水化,然后根據制造商 (美國Sigma公司) 提供的方案進行HE染色。

1.2.4免疫組化檢測 大鼠腹膜組織經過脫水、透明、包埋后制成石蠟切片,將腹膜組織切片脫蠟、再水化,用內源性過氧化物酶阻斷劑封閉內源性過氧化酶。通過高壓鍋修復腹膜組織表面抗原、山羊血清封閉。去除山羊血清后,將標本在4 ℃下用1 ∶100稀釋TGF-β1抗體,孵育過夜。第2天,復溫后,加入二抗,使用 3,3′-二氨基聯苯胺 (DAB) 顯色。經過脫水、透明和封片后,用正置熒光顯微鏡進行觀察并捕獲圖像。

1.2.5細胞培養 人腹膜間皮細胞系(HMrSV5)培養在含有10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的MEM培養基中,所有細胞置于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的溫箱中常規培養。高糖處理前,將間皮細胞均勻接種至6孔板中培養過夜。MEM補充為葡萄糖濃度84、138、236 mmol/L的高糖溶液,用于模擬高葡萄糖透析環境,這相當于目前在臨床上用于腹膜透析的含有1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖的腹膜透析液。

1.2.6siRNA轉染 使用 siRNA 特異性靶序列實現基因表達的沉默。所有 siRNA 特異性靶序列均來自上海吉瑪制藥技術有限公司。將細胞接種至6孔板培養孔中,使轉染時細胞密度達 60%～80%,去除孔板中的培養基,用含有Lipofectamine2000(Invitrogen)的Opti-MEM將靶序列或陰性對照 (NC) 瞬時轉染HMrSV5細胞。分組進行處理: 對照組、HG組(236 mmol/L 葡萄糖)、HG+NC siRNA組、HG+STAT3 siRNA 組,其中,siRNA轉染6 h后換成完全培養基,加葡萄糖(236 mmol/L)刺激48 h后檢測相關蛋白(STAT3、p-STAT3、PFKFB3、LDHA、E-cadherin、α-SMA)的表達。

1.2.7免疫印跡分析 將6孔板置于冰上,PBS清洗細胞后,使用含有2%蛋白酶抑制劑、2%磷酸酶抑制劑和2%乙二胺四乙酸的RIPA緩沖液裂解后提取總蛋白,測定各組總蛋白濃度。用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后轉移到PVDF膜。用無蛋白快速封閉液封閉45 min,將蛋白質與一抗(抗STAT3 1 ∶1 000、抗p-STAT3 1 ∶1 000、抗E-cadherin 1 ∶1 000、抗α-SMA 1 ∶1 000、抗LDHA 1 ∶1 000、抗PFKFB3 1 ∶1 000、抗β-actin 1 ∶5 000)在4 ℃下過夜。次日,用TBST洗滌3次,然后與辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯的二抗室溫下孵育45 min。ECL試劑用于在全自動化學發光成像儀上檢測抗體-抗原復合物。對獲得的條帶進行可視化和分析,結果用內源性參照物β-actin進行標準化。

1.3 統計學處理采用Graphpad Prism 8 軟件、Image J 軟件進行分析,數據表示為平均值±標準誤。使用Levene方法進行方差齊性檢驗,多組數據間的差異通過單因素方差分析(one-way ANOVA) 比較,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腹膜結構和功能的改變SD大鼠每天注射高糖腹膜透析液,10周后發現假手術組腹膜組織結構未見異常,模型組腹膜組織病理改變明顯,表現為腹膜下區域增厚、膠原纖維沉積和血管新生,提示大鼠腹膜纖維化模型已成功構建。STAT3抑制劑組腹膜下區域增厚和血管新生情況較模型組明顯改善。免疫組化染色顯示,假手術組腹膜下區域TGF-β1表達較弱,模型組表達明顯高于Sham組(F=200.3,P<0.05),STAT3抑制劑組腹膜組織及腹膜下區域TGF-β1表達明顯低于模型組(P<0.05)。腹膜平衡實驗結果顯示,假手術組超濾量均值為8.3 ml,模型組的超濾量均值為3.3 ml(F=71.91,P<0.05),腹膜組織超濾功能受損,STAT3抑制劑組超濾量均值為5.8 ml,功能較模型組改善(P<0.05),見圖1、2。

圖1 各組大鼠腹膜組織HE染色 ×100

圖2 免疫組化檢測各組大鼠腹膜組織TGF-β1表達情況 ×100

2.2 高糖激活HMrSV5細胞中的STAT3使用蛋白質印跡分析探討高糖對間皮細胞 (HMrSV5) STAT3 活化的影響。蛋白質印跡結果表明,在不同濃度葡萄糖(84、138、236 mmol/L)刺激后,STAT3磷酸化水平較對照組升高,差異有統計學意義(F=55.54,P<0.05),其中236 mmol/L葡萄糖處理的HMrSV5細胞中STAT3磷酸化最明顯,見圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測不同濃度高糖作用于HMrSV5細胞48 h p-STAT3、STAT3蛋白的表達水平

2.3 高糖引起HMrSV5細胞糖酵解增加和MMT使用蛋白質印跡分析探索高糖對人腹膜間皮細胞(HMrSV5)糖酵解和MMT的影響。結果表明,HMrSV5細胞在138、236 mmol/L的葡萄糖環境培養48 h后,LDHA蛋白表達升高(F=9.859,P<0.05),高糖(236 mmol/L)誘導HMrSV5細胞PFKFB3蛋白的表達增加(F=13.36,P<0.05)。同時測定與MMT相關的上皮間黏附蛋白標志物 E-cadherin和間充質標志物α-SMA的表達。蛋白印跡

分析顯示高糖(138、236 mmol/L)培養基處理HMrSV5細胞上調α-SMA的表達(F=33.81,P<0.05),高糖(236 mmol/L)處理下調E-cadherin的表達(F=4.457,P<0.05)。由此推斷236 mmol/L葡萄糖可引起HMrSV5細胞高糖酵解和MMT,見圖4。

圖4 蛋白質印跡法檢測不同濃度高糖(84、138、236 mmol/L)作用于HMrSV5細胞48 h PFKFB3、LDHA、E-cadherin、α-SMA蛋白的表達水平

2.4 STAT3 siRNA抑制高糖環境中STAT3信號通路的激活與對照組(未處理的細胞)相比,HG組(236mmol/L葡萄糖處理的細胞)的STAT3的磷酸化蛋白增多(F=29.20,P<0.05); HG+NC siRNA組磷酸化STAT3較高糖組無變化(P>0.05);與HG+NC siRNA組相比,HG+STAT3 siRNA組降低高糖誘導的HMrSV5細胞中STAT3蛋白磷酸化(P<0.05),見圖5。

圖5 敲低STAT3對高糖刺激的HMrSV5中相關蛋白的影響

2.5 STAT3 siRNA抑制高糖誘導的糖酵解相關代謝酶的高表達和MMT使用蛋白質印跡檢測PFKFB3和LDHA的表達變化,結果顯示高糖刺激后可以使PFKFB3和LDHA表達上調(F=40.92,P<0.05;F=22.74,P<0.05)。此外,高糖刺激后E-cadherin表達下調(F=14.67,P<0.05),α-SMA表達上調(F=9.589,P<0.05)。HG+NC siRNA組上述相關蛋白的表達較HG組無變化。STAT3 siRNA預處理的HMrSV5細胞中PFKFB3、LDHA和α-SMA的表達較HG+NC siRNA組下降,E-cadherin的表達較HG+NC siRNA組上調,見圖6。

圖6 敲低STAT3對高糖刺激的HMrSV5中糖酵解與MMT相關蛋白的影響

3 討論

完整的腹膜結構和功能有助于達到良好的腹膜透析效果。長期腹膜透析治療中的各種不利因素損傷腹膜結構和功能,最終導致腹膜纖維化。STAT3是一種關鍵的信號蛋白,參與多種生物學過程,包括細胞增殖、分化、纖維化和血管生成[2-3]。研究[6]表明,抑制腎小管上皮細胞中的STAT3 可以預防鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠腎纖維化和腎病。BET-溴結構域抑制劑JQ-1可抑制STAT3信號的激活進而部分改善日本血吸蟲卵誘導的肝纖維化[7]。STAT3在腎臟、腹膜以及肝臟等器官纖維化過程中激活,介導器官損傷[4, 6, 8-9]。本研究通過構建腹膜透析動物模型,模擬人體長期腹膜透析環境,用以闡明STAT3參與腹膜纖維化的分子機制。HE染色結果顯示腹膜纖維化大鼠模型中膠原纖維積累、皮下區域增厚和血管密度增加。免疫組化顯示腹膜中TGF-β1(一種關鍵的纖維化因子)陽性表達增加。這些變化與接受長期腹膜透析的患者中發現的腹膜透析相關腹膜纖維化的關鍵病理特征相似[10]。本研究顯示STAT3抑制劑BP-1-102顯著降低血管密度、減輕TGF-β1陽性表達和皮下區域增厚,說明 STAT3 信號傳導的藥理學抑制可減弱高糖腹膜透析液介導的腹膜纖維化及血管新生。在腹膜纖維化患者中,由于間皮細胞的丟失、細胞外基質聚集、炎性細胞的滲出和血管新生,最終導致腹膜超濾衰竭。在模型組大鼠,發現超濾量降低,STAT3抑制劑BP-1-102明顯改善透析所致的超濾量的減少,證明抑制STAT3信號傳導有助于改善透析所致的腹膜超濾損傷。

腹膜纖維化的發展過程中,可以檢測到與上皮-間充質轉化相類似的間皮細胞轉變的一種特殊形式,稱為MMT[11]。上皮-間充質轉化過程中上皮細胞的極性消失,轉移和侵襲能力增強,同時伴有上皮細胞標志物的缺失和間充質標志物的獲得,E-cadherin和α-SMA為腹膜間皮細胞MMT的特異性生化標志物。本研究利用高糖刺激腹膜間皮細胞,以此模擬腹膜透析時的高糖微環境,結果顯示高糖誘導間皮細胞E-cadherin的低表達和α-SMA的高表達,證明高糖刺激誘導間皮細胞發生MMT。通過抑制腹膜透析刺激的MMT來預防腹膜纖維化已成為腹膜纖維化機制研究的主要策略。對正常腹膜活檢中獲得的間皮細胞和腹膜透析治療患者的流出物的單細胞轉錄組進行分析,發現MMT的發展伴隨著糖酵解相關代謝酶的改變,暴露于腹膜透析液會導致間皮細胞過度糖酵解,阻斷過度糖酵解在兩種類型的間皮細胞中都極大地抑制了MMT[5]。進而,本研究檢測間皮細胞中糖酵解相關代謝酶的表達,結果顯示高糖誘導間皮細胞高表達PFKFB3和LDHA,同時伴隨STAT3激活。研究[12]表明,缺氧條件下STAT3通過下調LINC00671的表達激活LDHA,調節甲狀腺癌的糖酵解、生長和轉移。在肝細胞癌中,靶向抑制STAT3可阻止糖酵解關鍵酶的表達,并誘導免疫原性細胞死亡從而重建腫瘤免疫微環境[13]。LCN2可通過激活JAK2/STAT3信號通路促進有氧糖酵解,加速肝癌細胞的惡性增殖[14]。本研究中用siRNA影響細胞STAT3 的基因表達后,下調高糖誘導的糖酵解相關代謝酶PFKFB3和LDHA的高表達,表明靶向抑制STAT3可以調控高糖誘導的腹膜間皮細胞糖酵解活化,同時且逆轉高糖誘導間皮細胞MMT標志性蛋白E-cadherin和α-SMA的表達。本研究結果表明,siRNA抑制STAT3 信號通路通過下調間皮細胞PFKFB3、LDHA的表達減輕HMrSV5 細胞MMT。

本研究表明抑制STAT3可部分減緩腹膜纖維化和血管新生的進展,高糖微環境中STAT3信號通路的激活在促進HMrSV5細胞 MMT過程中發揮促進作用,而抑制 STAT3 信號通路的激活能通過下調間皮細胞PFKFB3、LDHA的表達減輕HMrSV5 細胞MMT。綜上所述,在腹膜纖維化中,靶向STAT3 信號通路通過調控腹膜間皮細胞糖酵解減緩腹膜透析相關腹膜纖維化和血管新生,為腹膜纖維化防治提供新思路。