敲低PRDX6對利福平誘導HepG2細胞膽汁酸轉運體適應性表達的影響

屈柳芳,黃夢雪,曹世國,陳 剛,許建明,張衛平

抗結核藥是導致藥物性肝損傷的常見藥物,膽汁淤積適應性反應是藥物性肝損傷領域中的重要研究方向。過氧化物還原酶-6(peroxiredoxin-6, PR-DX6)具有過氧化物酶活性和磷脂酶A2酶活性,通過減少H2O2和各種脂質過氧化物來保護細胞免受氧化損傷[1]。此外,PRDX6 是PRDX家族中唯一在其基因啟動子中具有轉錄因子核因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)結合位點的成員[2],而Nrf2介導的適應性反應在藥物性肝損傷的發生過程中發揮重要的保護作用。有研究[3]表明利福平(rifampicin, RFP)可誘導膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistant protein 1,MDR1)、多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-related protein 2,MRP2)、鈉離子-牛磺膽酸鈉共轉運多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、有機陰離子轉運蛋白2 (organic anion transporting protein 2,OATP2)、有機溶質轉運體(organic solute transporter β,OSTβ)和Nrf2的蛋白和基因表達適應性增加,從而減輕HepG2細胞損傷。此外,PRDX6磷脂酶A2活性與Nrf2之間的關系已在多項研究中得到證實[4-5]。因此,在膽汁淤積時,PRDX6是否參與膽汁酸轉運體適應性表達的調節還需進一步研究。該研究通過敲低HepG2細胞的PRDX6基因,觀察敲低 PRDX6后對RFP誘導HepG2細胞損傷及膽汁酸轉運體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HepG2細胞購自中科院上海分院細胞庫;PRDX6-siRNA購自上海吉瑪制藥公司;DMEM高糖培養基、胎牛血清購自以色列BI生物公司;胰酶細胞消化液、雙抗(青鏈霉素混合液) 購自上海碧云天生物公司;PVDF 膜購自美國Millipore公司;ECL顯影液購自蘇州新賽美生物公司;蛋白 Marker、TRIzol 購自美國Thermo scientific公司;PRDX6、MRP4購自美國CST公司;MRP3、NTCP購自美國Immunoway公司;MDR1購自武漢 Proteintech公司;MRP2購自美國Novus抗體公司;β-肌動蛋白(β-actin) 抗體及二抗(山羊抗小鼠、山羊抗兔)購自北京中杉金橋生物公司;PCR逆轉錄及擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司;實時熒光定量PCR引物均購自上海生物工程有限公司;RFP、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司;丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL) 、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL) 、總膽汁酸(total bile acid,TBA) 試劑盒購于南京建成生物工程研究所;CCK-8試劑盒購自安徽白鯊生物技術有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司;流式細胞儀(CytoFLEX)購于美國貝克曼公司;酶標儀(型號:MQX200)購自美國Bio-Tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞分組及培養 使用特異PRDX6-siRNA和control-siRNA分別轉染HepG2細胞構建敲減細胞株和對照細胞株,再根據是否加RFP刺激,將實驗分為5組:空白對照組、陰性對照control-siRNA+DMSO 組、control-siRNA+RFP組、PRDX6-siRNA+DMSO組、PRDX6-siRNA+RFP組。HepG2細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基進行培養。細胞放置在37 ℃含5%CO2的培養箱中培養,每12 h換液1次,取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2細胞轉染 取對數生長期的細胞以每孔2.0×105個細胞的密度均勻接種在6孔板上,當細胞生長密度達到50%～60%時,按照Lipofectamine2000試劑說明書進行瞬時轉染。轉染采用不含血清及雙抗的DMEM高糖培養基培養,培養6～8 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。

1.2.3實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 收集各組細胞,用TRIzol 提取各組細胞中的總 RNA,分光光度儀檢測RNA濃度及純度,根據TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書將 RNA逆轉錄成 cDNA,逆轉錄條件:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s 、4 ℃。按照PCR擴增試劑說明書配好反應體系,反應條件: 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,共40個循環。每個樣本設置3個復孔,數據采用2-ΔΔCT法進行統計處理,計算各組PRDX6、MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP的相對表達量。所用qRT-PCR引物序列見表 1。

1.2.4蛋白質免疫印跡(Western blot) 收集6孔板中各組細胞樣本,加入混有2%蛋白酶抑制劑、2%磷酸酶抑制劑、1%PMSF的 RIPA 裂解液裂解細胞,將其置于冰上,搖床40 min,于4℃、14 000 r/min離心10 min,收集上清液。加入上樣buffer后99 ℃煮10 min,于SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白,再轉至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,再分別加入PRDX6(1 ∶5 000) 、MRP2 (1 ∶500) 、MRP3(1 ∶1 500) 、MRP4 (1 ∶1 000) 、MDR1 (1 ∶1 000) 、NTCP (1 ∶1 500)一抗抗體,4 ℃孵育過夜,用 TBST 洗膜3次,10 min /次,洗膜后分別加入二抗(1 ∶5 000),于室溫孵育1 h, 再次TBST 洗膜3次,10 min /次,將ECL 顯影液均勻滴于PVDF膜上蛋白的位置進行顯影,Image J 圖像軟件分析各目的蛋白的表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡 將對數生長期的細胞以每孔2.0×105個細胞的密度均勻接種在 6孔板上,轉染24 h后給予100 μmol/L RFP誘導24 h。用不含EDTA的胰酶消化收集細胞沉淀, 預冷PBS洗滌細胞2次,800 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入400 μl Annexin結合液重懸細胞,再加入5 μl Annexin V-FITC染色液和5 μl PI混勻后在避光條件下孵育15 min,用流式細胞儀檢測。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖 按照前述的分組,將已轉染好的細胞及未處理的對數生長期的細胞按每1×104個細胞的密度均勻接種于96孔板中,邊緣孔用無菌 PBS 填充。當細胞生長密度達到60%～70%時,給予100 μmol/L RFP誘導24 h 后每孔分別加入 10 μl CCK-8試劑和90 μl DMEM純培養基,于 37 ℃培養箱中避光孵育1～2 h后置于酶標儀中檢測450 nm處吸光度值(OD450 nm),各孔的OD450 nm值代表每孔的增殖活性,實驗重復3次。

1.2.7測定細胞培養上清液中細胞損傷標志物的含量 收集各組細胞培養上清液1 ml,檢測各組細胞損傷標志物水平變化,如ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA。根據檢測試劑盒的操作說明,設定標準孔、樣品孔、對照孔和空白孔,按要求加入一定量的樣本和試劑,輕輕敲擊96孔板使之混勻,于37 ℃ 培養箱中避光孵育一定時間,按照各自所要求的檢測波長,用酶標儀測定吸光度值,根據計算公式或者標準曲線計算出各組細胞損傷標志物的相對含量。

2 結果

2.1 RFP對PRDX6表達的影響及PRDX6基因敲低驗證為了解RFP誘導的肝損傷如何影響PRDX6的表達,給予100 μmol/L RFP誘導HepG2細胞24 h,與control-siRNA+DMSO組比較,control-siRNA+RFP組PRDX6的蛋白(F=71.21,P<0.001)及基因(F=89.13,P<0.001)表達水平均上升,結果表明RFP可誘導HepG2細胞PRDX6蛋白及基因表達上調。使用特異PRDX6-siRNA轉染HepG2細胞敲低PRDX6基因,并通過Western blot 和 qRT-PCR檢測敲低效率,結果顯示,與control-siRNA+DMSO組比較,PRDX6-siRNA+DMSO組PRDX6的基因表達水平降低約80%(F=89.13,P<0.001),蛋白表達量降低約50%(F=71.21,P<0.01),提示HepG2細胞中的PRDX6基因敲低成功。見圖1。

2.2 敲低PRDX6后對RFP誘導膽汁酸轉運體表達的影響與control-siRNA+DMSO組比較,control-siRNA+RFP組MRP2(F=86.87,P<0.05)、MRP3(F=44.32,P<0.05)、MRP4(F=55.51,P<0.05)、MDR1(F=86.88,P<0.05)、NTCP(F=19.47,P<0.05)基因表達水平均有不同程度的升高,見圖2C;MRP2(F=93.07,P<0.05)、MRP3(F=45.52,P<0.05)、MRP4(F=106.8,P<0.05)、MDR1(F=26.77,P<0.05)、NTCP(F=169.1,P<0.05)的蛋白表達量也有不同程度的升高,見圖2A、2B。敲低PRDX6并給予100 μmol/L RFP 誘導24 h后,與control-siRNA+RFP組相比,PRDX6-siRNA+RFP組MRP2(F=86.87,P<0.05)、MRP3(F=44.32,P<0.05)、MRP4(F=55.51,P<0.05)、MDR1(F=86.88,P<0.05)、NTCP(F=19.47,P<0.05)的基因表達水平均有不同程度的降低,并且MRP2(F=93.07,P<0.05)、MRP3(F=45.52,P<0.05)、MRP4(F=106.8,P<0.05)、MDR1(F=26.77,P<0.05)、NTCP(F=169.1,P<0.05)的蛋白表達水平也有不同程度的降低,見圖2。表明PRDX6在RFP誘導的HepG2細胞損傷中可適應性上調膽汁酸轉運體的表達水平。

圖2 敲低PRDX6對膽汁酸轉運體表達的影響

2.3 敲低PRDX6對RFP誘導HepG2細胞損傷的影響Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡結果顯示:與control-siRNA+RFP組比較,PRDX6-siRNA+RFP組的凋亡率上升 (F=125.7,P<0.05),見圖3A;CCK-8增殖實驗結果顯示:PRDX6-siRNA+RFP組的OD值較control-siRNA+RFP組的OD值低(F=30.51,P<0.01),HepG2細胞的增殖能力減弱,見圖3B;細胞培養上清液檢測結果顯示:與control-siRNA+RFP組上清液標志物ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA比較,PRDX6-siRNA+RFP組細胞培養上清液損傷標志物ALT(F=307.3,P<0.001)、AST(F=278.2,P<0.001)、TBIL(F=155.5,P<0.01)、DBIL(F=671.8,P<0.05)、TBA(F=64.45,P<0.001)的水平均較高,見圖3C-3G。這些結果表明敲低PRDX6后,RFP誘導的HepG2細胞損傷進一步加重。

圖3 PRDX6敲低后對HepG2細胞損傷的影響

3 討論

肝毒性是一線抗結核藥物的重要副作用之一,而抗結核藥所致藥物性肝損傷的確切機制尚不清楚。研究[6-8]表明肝臟在發生膽汁淤積時通過增加肝細胞基底外側膽汁酸排泄和減少基底外側膽汁酸攝取被認為是膽汁淤積的適應性反應。有研究[9]表明PRDX6是Nrf2通路的抗氧化基因下游分子,在調節活性氧穩態中發揮作用, 輕至中等強度的氧化應激會誘導Nrf2和Nrf2-prdx6介導的細胞保護的激活。此外,其他研究[10]顯示丹參酮Ⅱa通過激活Nrf2調控BSEP/NTCP表達而預防RFP誘導的肝損傷。本研究在體外實驗結果顯示,RFP可誘導HepG2細胞中MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP蛋白及基因表達水平升高,通過上調膽汁酸轉運體的表達水平,減輕RFP誘導的肝細胞損傷,這一結果與先前的研究[3,11]結果一致。HepG2細胞敲低PRDX6基因后,MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP的表達水平較未敲低組下降,細胞損傷明顯加重。這表明PRDX6可能在RFP誘導的HepG2細胞損傷中參與膽汁酸轉運體表達的調控,并在膽汁淤積中發揮適應性保護作用。推測RFP誘導機體應激時,通過上調保護性分子Nrf2的表達,增加PRDX6的轉錄,進而增加膽汁酸轉運體的表達,恢復膽汁酸代謝的穩態,促進肝臟對損傷的適應。

PRDX6是廣泛存在的過氧化物酶家族中的特殊一員,參與細胞內和細胞間信號轉導,抑制由多種因素引起的細胞凋亡。有研究[12]表明PRDX6在缺血再灌注引起的氧化應激刺激時轉運至線粒體中,發揮對抗肝細胞損傷的作用。此外,López-Grueso et al[13]在研究中發現HepG2細胞的PRDX6基因缺失會導致細胞內的線粒體功能和完整性喪失,活性氧增加,細胞數量和增殖減少。本研究結果顯示敲低PRDX6基因后,HepG2細胞的凋亡率升高,增殖能力降低。這可能與PRDX6有抗凋亡及抗氧化應激的作用有關。

本研究表明,在RFP的作用下,肝細胞損傷標志物(ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA) 的水平升高,在臨床上這些指標是反映肝功能狀態的重要指標。敲低PRDX6基因后,這些損傷標志物進一步升高。綜合以上結果,表明PRDX6在RFP誘導的HepG2細胞適應性反應中發揮保護作用。本研究將有助于更進一步認識RFP誘導膽汁淤積適應現象的分子機制,為臨床實踐提供參考。