牙齦卟啉單胞菌感染在食管鱗癌中的作用及機制研究

孔金玉,劉怡文,錢夢凡, 孫 蔚,邢 玲 綜述 高社干審校

食管癌是中國發病率較高的惡性腫瘤,其發病(32.4萬)及死亡人數(30.1萬)占全球發病人數55%左右[1]。盡管食管癌的診療取得了一定的進展,但早期診斷率和5年生存率仍然較低,我國以食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)為主[2]。食管癌病因復雜,涉及多種因素,包括吸煙、飲酒、飲食習慣、遺傳因素和生活環境等[2]。自幽門螺桿菌與胃癌的關系被證實后,病原微生物感染逐漸成為腫瘤研究的熱點,大約20%的惡性腫瘤與微生物感染有關[3]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭陰性厭氧菌,具有調節宿主免疫反應,促進微生物生物膜的增殖,破壞宿主體內平衡,引起生態失調和疾病,與慢性牙周炎與惡性腫瘤密切相關[4-5]。本文旨在介紹P.gingivalis與ESCC的發生發展的相互作用及其潛在機制,為食管癌防治提供依據。

1 P.gingivalis的生物學特征

P.gingivalis是革蘭陰性無芽孢球桿菌,表面有纖毛,專性厭氧,分布在口腔齦溝或牙周袋內,直接與齦溝上皮、袋內上皮接觸或位于附著性齦下菌斑的表面,是牙周病的主要病原體,與腫瘤發生發展相關[5]。P.gingivalis分泌多種毒力因子,包括菌毛(FimA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、牙齦蛋白酶(Gingipains)、核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase, NDK)等[5]。FimA通過與宿主細胞的β1整合素相互作用并引起細胞骨架重排來促進口腔上皮細胞的侵襲,其中,FimA II和FimA IV具有更強的黏附性和侵襲性,與牙周病有關[5]。P.gingivalisLPS通過與Toll樣受體1(Toll-likereceptors,TRL1)和Toll樣受體4(Toll-likereceptors,TLR4)相互作用來破壞宿主的先天免疫系統,分泌細胞因子如白介素6(interleukin 6,IL-6)、白介素8(interleukin 8,IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),并產生炎癥[6]。Gingipains是一種半胱氨酸蛋白酶,可分為精氨酸(RgpA和RgpB)和賴氨酸(Kgp)特異性半胱氨酸蛋白酶,它具有多種功能,包括上皮細胞黏附和侵襲,紅細胞血凝和溶血,炎癥反應和宿主蛋白降解[7]。NDK作為ATP酶,裂解ATP,阻止ATP與嘌呤能受體(P2X7)的結合,從而抑制細胞凋亡[5]。

2 牙周病與食管癌的流行病學關系

牙周病是一種與多種細菌相關的慢性感染性疾病,可破壞牙周結構,影響多種全身系統性疾病,如癌癥、心血管疾病、糖尿病等。近年來發現,牙周炎、牙齒缺失與食管癌密切相關。Nwizu et al[8]進行一項前瞻性隊列研究,結果表明,絕經后婦女牙周病增加食管癌患病風險(HR=3.28,95%CI1.64～6.53)。2001年,Abnet et al[9]對28 868人進行了5.25年的前瞻性研究,發現牙齒脫落顯著增加患食管癌的風險,這可能與口腔細菌菌群的改變以及隨后體內致癌物(如亞硝胺)產生的增加有關。Chen et al[10]進行了一項基于中國人群的病例對照研究,發現口腔衛生不良與ESCC的發生密切相關,推測口腔衛生習慣及微生態環境變化可能發揮重要作用。

3 P.gingivalis在ESCC患者口腔微生物群中的作用

人類口腔微生物群包括700多種細菌,這些細菌構成了復雜的口腔微生態, 其組成可能受宿主遺傳、年齡、地理環境、口腔健康、生活習慣、社會因素、藥物等多種因素的影響[11]。口腔微生態的平衡對口腔健康至關重要,并影響宿主對疾病的反應。在正常生理狀態下,口腔微生態保持動態平衡,當暴露于某些環境因素時,會引起口腔微生物群組成失衡,從而破壞菌群與宿主免疫系統之間的動態平衡,導致免疫激活和食管黏膜慢性炎癥,從而增加微環境中的細胞因子、趨化因子和活性氧,促進食管癌的發生發展[2]。因此,口腔微生物組成的變化在食管癌發展中起重要作用。牙周病是多種細菌感染介導的慢性炎癥性疾病,所以,牙周病與食管癌的相關性可能與牙周致病菌有關,而P.gingivalis感染是牙周病和牙齒脫落的主要致病菌[4],因此,P.gingivalis在食管癌中的作用引起了研究者的關注。

Chen et al[12]在一項大型病例對照研究中,收集了87例ESCC患者、63例不典型增生患者和85名健康對照者的空腹唾液樣本,通過16S rRNA基因測序,與健康對照組和不典型增生組相比,ESCC組的口腔微生物多樣性顯著減少(P<0.001),而卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)在ESCC中顯著富集。Meng et al[13]收集了30例ESCC患者和22名健康對照組的唾液樣本,通過16S rRNA測序結果顯示,ESCC患者唾液中Porphyromonas、鏈球菌屬(Streptococcus)和纖毛菌屬(Leptotrichia)含量最高。最近的一項研究表明,ESCC患者唾液中Leptotrichia、Porphyromonas、Streptococcus、羅氏菌屬(Rothia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和消化鏈球菌屬(Peptostrecoccus)含量均高于健康對照組[14]。以上結果表明,口腔微生態失衡可能與ESCC有關。

Peters et al[15]采用16S rRNA基因測序技術對81例食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, ECA)和25例ESCC患者的診斷前漱口水樣本進行口腔細菌評估,結果顯示P.gingivalis增加了ESCC患病風險。Kageyama et al[16]進行了一項病例對照研究,檢查了不同胃腸道癌癥患者的唾液微生物群,包括12例食管癌患者及其年齡和性別匹配的對照組。食管癌患者唾液中P.gingivalis和棒狀桿菌(Corynebacterium)比健康對照組更豐富。此外,Chen et al[17]發現,與健康志愿者相比,ESCC患者的口腔生物膜中含有更多的Streptococcus、小韋榮球菌(Veillonellaparvula)和P.gingivalis。雖然目前研究較少,且樣本量少,但這些研究表明P.gingivalis可能增加了ESCC的風險。

4 P.gingivalis在ESCC患者食管微生物群中的作用

由于食管鄰近口腔,均為鱗狀上皮,因此極有可能成為口腔細菌的定植場所。與胃腸道微生物組類似,食管微生物組構成也極其復雜。2004年,Pei et al[18]采集4名成人正常食管活檢標本,利用16S rRNA基因測序技術,在正常食管微生物組中鑒定出6門41屬95種細菌,最常見的是Streptococcus(占39%)、普雷沃氏菌(Prevotella,占17%)和韋榮氏球菌屬(Veilonella,占14%)。Yang et al[19]發現食管微生物群可分為2類。I型微生物組以革蘭陽性鏈球菌為主,與正常食管的關系更為密切。II型微生物含有更多的革蘭陰性厭氧菌,主要與食管異常相關,包括食管炎和Barrett食管。Yu et al[20]研究證明,食管微生物菌群相對豐度與食管不典型增生呈負相關,該研究認為上消化道微生物群可能在食管癌的發生發展中起重要作用。Yang et al[21]通過16S rRNA基因測序對18例ESCC患者和11例生理正常食管患者的食管菌群進行了前瞻性研究,結果表明,Porphyromonas在ESCC中顯著富集。冼博鴻 等[22]對105例ESCC患者腫瘤組織標本和54例健康對照者的食管組織標本進行16S rRNA基因測序,與健康對照組相比,ESCC組Porphyromonas、梭桿菌屬(Fusobacterium)豐度升高。經qPCR驗證結果表明ESCC組織內P.gingivalis、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,F.nucleatum)含量明顯升高。上述研究結果提示食管微生態改變可能在ESCC癌變進程中發揮著重要作用。

5 P.gingivalis對ESCC診斷及預后的意義

P.gingivalis作為牙周病的重要病原菌,近年來發現它與ESCC密切相關。2016年,Gao et al[23]收集100例ESCC患者癌組織及鄰近癌旁組織,30例正常食管黏膜組織,采用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測P.gingivalis的感染率,結果顯示,P.gingivalis在ESCC組織中的感染率(61%,71%)顯著高于鄰近癌旁組織(12%,12%)和正常食管黏膜組織(0%,1%)。此外,P.gingivalis與多種臨床病理特征(腫瘤分化程度、淋巴結轉移和TNM分期)和預后相關,P.gingivalis表達陽性患者平均生存時間(20.139個月)顯著低于陰性患者(25.971個月)。該研究不僅首次證明了P.gingivalis感染是ESCC發生發展的高危因素,而且有望成為食管癌預后生物標志物。2021年,Chen et al[17]也得到了非常相似的結果,ESCC患者中,P.gingivalis感染率為57%,同樣發現P.gingivalis與ESCC臨床分期和預后不良有關。2017年,Yuan et al[24]發現P.gingivalis在食管癌中的感染率顯著高于賁門癌,而在胃癌中不存在。這可能與P.gingivalis不耐受酸性環境有關。此外,作者在ESCC組織中檢測了3種常見細菌的感染率,P.gingivalis的檢出率為48.3%,F.nucleatum和咽峽炎鏈球菌(S.anginosus)分別為35%和17.5%,表明P.gingivalis可能是ESCC的主要厭氧菌。2023年,Gao et al[25]采用IHC檢測205例經內鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection, ESD)后早期ESCC或高級別上皮內瘤變(high-grade dysplasia, HGD)患者中P.gingivalis的表達,分析P.gingivalis對局部復發的影響。研究表明,HGD和早期ESCC中存在P.gingivalis的富集,P.gingivalis高表達與侵襲深度和局部復發呈正相關,P.gingivalis感染是 ESD術后早期ESCC或HGD局部復發的危險因素和潛在的預測因子。因此,清除P.gingivalis可改善預后和預防早期ESCC。2012年,在美國國家健康和營養檢查調查報告III中,采用ELISA檢測7 852例受試者的血清P.gingivalisIgG抗體水平,結果發現P.gingivalisIgG 抗體水平(>69.1 EU)增加消化系統惡性腫瘤死亡風險(RR=3.03; 95%CI: 0.99～9.31),該研究表明P.gingivalis可作為口腔消化系統癌癥死亡風險的生物標志物[26]。2018年,Gao et al[27]采用ELISA法對96例ESCC、50例食管炎以及80例健康對照人群的血清P.gingivalisIgG和IgA 抗體水平進行了測定,結果發現,ESCC患者血清P.gingivalisIgG 和 IgA 抗體水平明顯高于食管炎患者及健康對照組(P<0.01)。P.gingivalisIgG 和 IgA 水平與患者預后相關,P.gingivalisIgG>138.23 EU 或 IgA>56.56 EU的ESCC患者預后較差,生存時間短,IgG和IgA水平均較高的患者預后最差。綜上所述,P.gingivalis在食管的定植不僅與ESCC發生有關,而且與疾病的嚴重程度和預后密切相關,其血清生物標志物 IgG 和 IgA 可能對ESCC早期診斷及預后具有重要意義。

口腔P.gingivalis的主要檢查方法有分離培養法、DNA提取法,這些檢測方法或靈敏度較低或耗時耗力,不適合大規模的現場檢測,因此,需要一種無創的、簡單快速且靈敏特異的檢測方法。Gu et al[28]利用TE-直接qPCR法快速有效擴增樣本,建立了一步法核酸檢測體系,其靈敏度和特異性分別達100%和97.3%。與常規qPCR相比,該法是一種無需提取DNA,簡便快速靈敏的口腔P.gingivalis定量方法,適合ESCC大規模流行病學研究。目前,臨床上常用抗生素治療P.gingivalis的感染,但因其耐藥性、毒副作用及治療時間長等問題,效果較差。因此,迫切需要尋找高效、副作用較小的新型抗菌藥物。已有研究發現植物提取物,如丁香酚、姜黃素和白藜蘆醇等,對P.gingivalis具有良好的抗菌和抗生物膜活性,通過降低P.gingivalis主要毒力因子編碼基因的表達,減弱了P.gingivalis的毒力,并抑制生物膜的形成[29]。另外,小分子化合物唾液酸酶抑制劑(2-deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminic acid, DANA)抑制了P.gingivalis的生長和生物膜的形成,并顯著降低了FimA、FimR和FimS基因的表達以及牙齦蛋白酶的活性[30]。1,25-二羥基維生素D3通過降低黏附素(FimA、HagA和HagB)和蛋白酶(RgpA、RgpB和Kgp)等重要毒力因子編碼基因的表達,降低了P.gingivalis的毒力,起到抗菌作用[31]。Suwandecha et al[32]合成了一種較短的抗菌肽Pep-7,在最低殺菌濃度為1.7 μmol/L時,對P.gingivalis具有抑制作用。Halkai et al[33]利用真菌生物合成的銀納米粒子(AgNPs)對P.gingivalis具有良好的抗菌效果。對于多種新型抗菌物質,目前缺乏臨床試驗,其療效需要進一步證實。

6 P.gingivalis促進ESCC發展的可能機制

目前,關于P.gingivalis與食管癌機制的研究較少,P.gingivalis的長期定植可能參與了ESCC的發生發展。P.gingivalis可能通過產生毒力因子或活性代謝物、激活致癌信號通路、促進異常免疫反應、抑制宿主細胞凋亡等途徑促進癌癥的發生發展(圖1)。

圖1 P.gingivalis促進ESCC發展的分子機制

Rousseau et al[34]通過食管癌繼發性肝轉移體內實驗模型,證實了TLR4在LPS刺激下增加食管癌細胞的黏附能力,此外,確定了選擇素及其配體在LPS誘導的內皮黏附中的重要作用,食管癌細胞在LPS刺激下對纖維連接蛋白和肝竇內皮的黏附增加了兩倍。因此,LPS通過TLR4信號通路和選擇素配體增強食管癌細胞的遷移能力。張慶慧 等[35]采用CCK-8、Transwell 和劃痕實驗檢測P.gingivalisLPS對ESCC細胞的增殖和遷移能力,結果發現,和空白對照組相比,加入特定濃度P.gingivalis的 LPS可促進ESCC細胞增殖、遷移。P.gingivalis的LPS作用于ESCC細胞后,神經鞘胚素(artemin, ARTN)蛋白表達升高,進一步促進絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1, AKT1)、細胞周期蛋白D1(cyclinD1, CCND1)、腫瘤轉移相關基因1(metastasis associated protein 1, MTA1)、趨化因子受體4(CXC chemokine receptor type 4, CXCR4,)表達,進而影響ESCC細胞的生物學行為,該研究表明,LPS可能為ESCC的潛在致癌因素。Meng et al[13]通過體外研究發現,P.gingivalis感染后,細胞核中核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)及下游關鍵靶基因CCND1、c-Myc表達上調;此外,熒光素酶檢測結果顯示,P.gingivalis刺激Eca109和KYSE510細胞后,NF-κB活性顯著升高;這些數據表明,P.gingivalis在ESCC的發生和進展中發揮了至關重要的作用,可能誘導NF-κB的激活進而促進 ESCC 細胞的增殖、遷移和侵襲。Liang et al[36]通過高通量測序發現,P.gingivalis感染后,miR-194顯著上調;雙熒光素酶實驗證實GRHL3是miR-194的直接靶點。P.gingivalis感染后,GRHL3及PTEN表達下調,p-Akt表達水平上調,這些結果表明,P.gingivalis可能通過miR-194/GRHL3/PTEN/Akt信號軸促進ESCC的增殖、遷移和侵襲。此外,Gao et al[37]對P.gingivalis感染的ESCC細胞進行轉錄組測序,發現P.gingivalis感染增加轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)水平;通過裸鼠皮下荷瘤和肺轉移模型,發現P.gingivalis感染顯著激活TGF-β信號,促進腫瘤生長和肺轉移;此外,通過體外細胞模型,發現P.gingivalis感染可通過增強A重復優勢蛋白(glycoprotein A repetitions predominant, GARP)表達,激活TGF-β/Smad信號促進ESCC細胞惡性發展。Jia et al[38]發現感染P.gingivalis后,正常人食管上皮細胞的增殖和遷移上調,并出現異倍體細胞。P.gingivalis可通過激活Sonic hedgehog基因通路中的關鍵基因HHIP和GLI1誘導正常食管上皮細胞惡性轉化。該研究為牙周致病菌對正常食管的致癌作用提供了直接的因果證據。以上結果證實了P.gingivalis通過激活多種信號轉導途徑增強ESCC細胞的惡性病變的能力。

P.gingivalis分泌的Gingipains誘導基質金屬蛋白酶表達,降解細胞外基質,破壞免疫球蛋白和補體系統(C3和C5成分)以及中性粒細胞衍生的α-防御素來損害宿主的防御機制[39]。Yuan et al[40]發現P.gingivalis感染ESCC細胞后,可使免疫檢查點分子B7-H4及組蛋白去甲基化酶(lysine demethylase 5B,KDM5B)表達升高;兩者上調不僅可抑制CD8+效應T細胞的活化和增殖,還可抑制T淋巴細胞浸潤,從而逃避或破壞宿主免疫應答,進而持久定植。該研究為食管癌免疫靶向藥物研發提供了理論基礎,為P.gingivalis陽性感染ESCC患者治療提供新策略。Chen et al[17]發現,P.gingivalis感染誘導ESCC細胞中IL-6表達,此外,還發現P.gingivalis感染通過促進骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)招募,調節局部ESCC微環境,從而使癌細胞逃離宿主免疫反應。郭靜宜 等[41]也發現P.gingivalis感染ESCC細胞,IL-6和IL-10表達升高,促使腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)向 M2型極化,使腫瘤細胞逃避宿主免疫系統的殺傷,進而促進ESCC惡性進展。

Gao et al[42]通過體內外實驗驗證了P.gingivalis感染可通過激活STAT3信號通路,削弱ESCC細胞對化療藥物的敏感性。在化療藥物的作用下,P.gingivalis感染可激活STAT3,降低caspase-3的表達,抑制宿主細胞凋亡,誘導ESCC細胞化療抵抗。此外,P.gingivalis可通過誘導糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)高表達,增強ESCC細胞的線粒體功能,并降低其對化療藥物的敏感性,促進其惡性演進[43]。提示有效清除P.gingivalis,抑制其對GSK3β介導的線粒體氧化磷酸化的促進作用可能為ESCC治療提供新策略和治療手段。

7 總結與展望

近年來,微生態在食管癌中的作用引起了學者的關注。P.gingivalis作為牙周疾病的重要病原體,已證實與ESCC的發生發展密切相關,但腫瘤的發生是多因素協同的結果,P.gingivalis是否單獨致病或協同其他相關致病因素,以及與相關因素的關系,均需進一步探索。目前,多數研究僅停留在兩者之間的相關性方面,P.gingivalis引起食管癌的機制以及對藥物治療的影響機制研究較少,且缺乏臨床試驗證據。由于微生物群組與腫瘤之間復雜的關系,因此,想要通過檢測及清除P.gingivalis來達到防治食管癌的效果,并通過P.gingivalis引起食管癌的相關機制研究尋找治療靶點,仍需要大樣本、多中心前瞻性隊列研究以及多學科聯合研究,最終制定更有價值的惡性腫瘤防治策略。總之,保持口腔衛生、尋找更多的生物標志物、改善治療措施和食管癌的預后是未來臨床研究和工作的重點。