甲狀旁腺激素樣激素與肝細胞癌免疫浸潤相關性及其對患者預后預測價值

楊 新, 劉志新, 劉 嬌, 楊 卓, 安 娜

北部戰區總醫院 內窺鏡科,遼寧 沈陽 110016

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤[1-12]。2021年世界癌癥報告顯示,肝癌是全球癌癥相關的主要死因之一[13]。肝細胞癌是原發性肝癌的主要病理類型,起病隱匿且易轉移,患者整體預后極差。甲狀旁腺激素樣激素(parathyroid hormone like hormone,PTHLH)是腫瘤產生的一種分泌因子,可導致副腫瘤性高鈣血癥[14-15],其參與多種細胞過程,包括細胞內鈣的調節、增殖/肥大、分化等[16-17]。PTHLH在肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中均表達上調,參與腫瘤發生發展的不同階段[18-24]。本研究旨在探討PTHLH與肝細胞癌免疫浸潤的相關性,以及其對患者預后的預測價值。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據提取及表達分析 從癌癥基因組圖譜Cancer Genome Atlas(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov)和基因型組織表達Genotype-Tissue Expression(GTEx,https://www.gtexportal.org)中下載數據,使用UCSC Xena(https://xena.ucsc.edu)進行分析。通過合并TCGA和GTEx訪問的正常組織數據探索PTHLH在肝細胞癌與正常樣本之間的差異表達。應用R語言軟件和公開的Rpackage“ggplot2”繪制方框圖來評估差異表達水平。蛋白表達的免疫組化染色來自于HPA數據庫。患者生存曲線Kaplan-Meier曲線來自Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)。

1.2 列線圖模型的建立及評價 根據患者的臨床特征和風險評分建立列線圖,獨立預測肝癌的預后。應用校準曲線分析評估預測結果與實際結果之間的一致性,應用一致性指數(C指數)評估列線圖的預測準確性。使用R軟件包RMS生成列線圖和校準圖。

1.3 免疫浸潤分析 肝細胞癌患者的免疫浸潤情況提取自TIMER 2.0數據庫,使用R軟件處理。

1.4 相關基因分析 利用Ualcan數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/)分析與PTHLH表達相關的基因,gene symbol處輸入PTHLH,腫瘤類型選擇肝細胞癌,點擊correlation檢索。

1.5 統計學方法 使用Log2轉化對基因表達數據進行歸一化。采用R軟件(4.0版)進行統計分析。采用兩組t檢驗比較正常組織和癌癥組織。采用Kaplan-Meier曲線、對數秩檢驗、Cox比例風險回歸模型進行生存分析。采用Spearman或Pearson相關分析評估變量之間的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTHLH的表達水平及其與肝細胞癌臨床特征的關系 基于TCGA數據庫發現,PTHLH在肝細胞癌組織中的表達水平高于正常組織(P<0.05)(圖1a),進一步在相同患者的肝細胞癌組織和正常組織中配對比較得到了驗證(圖1b);在HPA數據庫中,PTHLH的免疫組化染色存在一樣的表達差異,提示PTHLH蛋白水平的表達也在肝細胞癌中升高(圖1c)。生存分析發現,PTHLH高表達組和低表達組的總生存期具有差異(P<0.05)(圖2a),提示PTHLH基因高表達與肝細胞癌患者預后不良有關;PTHLH高表達組和低表達組在性別、T分期、病理分期、甲胎蛋白水平方面均存在顯著差異(P<0.05),而在年齡、N分期方面無明顯差異(P>0.05)(圖2b～g)。

圖1 PTHLH在正常和肝細胞癌組織中的表達差異(a.正常肝細胞組織和肝細胞癌組織中PTHLH表達的差異;b.相同患者的肝細胞癌和癌旁組織樣本中PTHLH表達的配對差異;c.PTHLH在肝細胞癌和正常組織中的免疫組化結果,200倍)

圖2 PTHLH的表達水平與肝細胞癌臨床特征的關系(a.Kaplan-Meier曲線顯示PTHLH的表達與肝細胞癌患者總生存期的關系;b～g.PTHLH的表達與肝細胞癌患者性別、T分期、N分期、病理分期、年齡、甲胎蛋白水平的關系)

2.2 列線圖模型的構建及評價 基于Cox回歸分析的結果繪制列線圖進行可視化呈現,校準曲線評估1、3、5年的預測準確性。結果表明,PTHLH對肝細胞癌的總存活期具有預后貢獻,且顯示出良好的預測能力(圖3a)。1、3、5年總存活率的校準曲線表明,列線圖模型在預測總生存期方面表現出很高的準確性(圖3b)。

圖3 列線圖模型的構建與評價(a.通過將PTHLH值和階段圖年齡、病理分期的單項得分相加得到總體得分,總分投影為預測的1、3、5年存活率;b.諾模圖用于評估1、3、5年存活率列線圖的校準曲線)

2.3 PTHLH表達水平及肝細胞癌免疫細胞浸潤的關系 繪制肝癌中PTHLH表達水平與24種免疫細胞亞型浸潤豐度的棒棒糖圖,可見PTHLH的表達與其中的17種免疫細胞浸潤相關,與DC、Tgd、T17細胞呈負相關,與NK CD56bright細胞、巨噬細胞、TFH、Tem、Th2、T helper、iDC、Th1、T、NK、NK CD56dim、肥大細胞、aDC、B細胞呈正相關。進一步檢測5種主要的免疫細胞,發現PTHLH的表達水平與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞,中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞豐度呈正相關。PTHLH與免疫細胞CD4+Th2細胞浸潤的差異影響患者預后(P=0.024 1)。見圖4。

圖4 肝細胞癌中PTHLH表達與不同免疫細胞浸潤豐度的關系(a.PTHLH在肝細胞癌中表達水平與24種免疫細胞亞型浸潤關系的棒棒糖圖;b.肝細胞癌中PTHLH表達和CD4+Th2細胞評分組合的總生存期分析;c.肝細胞癌中6種免疫細胞浸潤水平與PTHLH表達的相關性)

2.4 與PTHLH表達相關的基因 通過Ualcan數據庫篩選出前65個實驗確定的與PTHLH相互作用的基因之間的網絡圖(圖5a)。在肝細胞癌基因相關系數中,DDX11最高,Pearson相關系數為0.88(P<0.001)(圖5b)。

圖5 肝細胞癌中PTHLH的相關基因(a.Ualcan數據庫篩選的肝細胞癌中前65個與PTHLH mRNA最相關的基因之間相互作用的網絡圖;b.肝細胞癌中PTHLH的表達與所篩選基因之間的相關分析熱圖)

3 討論

對PTHLH基因結構的研究發現,PTHLH通過轉錄、翻譯、修飾等基因過程生成N端、中間區域或C端的成熟肽,通過自分泌/旁分泌方式與甲狀旁腺激素受體-1結合,以激活下游效應物,如細胞外信號調節激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、AKT、細胞周期蛋白D1、RUNX和cAMP反應元件結合蛋白轉錄因子[22-23,25-27]。PTHLH表達的上游驅動因素包括通過SMAD轉錄因子發出信號的轉化生長因子β超家族成員[28-29]、通過成紅細胞轉化特異性轉錄因子發出的RAS家族成員[30-33],以及有絲分裂刺激,如表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1[32-34]。TP63是胰腺導管腺癌鱗狀亞型中PTHLH表達的主要驅動因素[35]。但關于PTHLH在肝細胞癌中的分子作用研究較少。為了確定PTHLH在肝細胞癌的發生、發展、臨床結局中的潛在作用及作用機制,本研究對TCGA肝細胞癌中的PTHLH進行了分析。

本研究結果顯示:PTHLH在肝細胞癌組織中的表達水平高于正常組織(P<0.05),PTHLH高表達組和低表達組的總生存期具有差異(P<0.05);PTHLH高表達組和低表達組在性別、T分期、病理分期、甲胎蛋白水平方面均存在顯著差異(P<0.05),而在年齡、N分期方面無明顯差異(P>0.05);列線圖及其校準曲線顯示PTHLH對肝細胞癌患者預后具有良好的預測能力。這些結果證實,PTHLH作為評估肝細胞癌預后的生物標志物具有廣闊的應用前景。本研究結果還顯示:PTHLH的表達與多種免疫細胞浸潤豐度相關,免疫細胞CD4+Th2細胞浸潤的程度影響患者預后(P<0.05)。上述結果證實了PTHLH基因與肝細胞癌免疫微環境中的基質細胞和免疫細胞的相關性,PTHLH基因的表達影響了肝細胞癌的腫瘤微環境,其可能在肝細胞癌的發生、發展、轉移及免疫應答中發揮重要作用。本研究中,DDX11與PTHLH相關性最高,Pearson相關系數為0.88(P<0.001)。DDX11是一種DNA解旋酶,參與各種基因組維持途徑和姐妹染色單體凝聚力的建立,在多種腫瘤中發揮促癌作用[36]。有學者揭示了DDX11在肝細胞癌發病和進展中的潛在作用[37-38],其通過激活PI3K/AKT/mTOR信號促進肝細胞癌的進展[37]。

綜上所述,PTHLH在肝細胞癌組織中高表達,其可作為肝細胞癌免疫和預后的生物標志物,并可能成為潛在的肝細胞癌免疫治療的新靶點。