丹參酮ⅡA對膿毒癥肺微血管內皮細胞損傷的保護作用*

邵沙沙 殷惠美 楊家樂 潘勇軍 王 敏 劉俊雅△ 馮 俊

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030；2.新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州人民醫院，新疆 博樂 833499；3.南方科技大學醫院，廣東 深圳 518055）

膿毒癥被定義為宿主對感染的反應失調導致危及生命的器官功能障礙［1］。全世界每年膿毒癥患者超過30 萬例［2］。器官功能障礙是膿毒癥的主要并發癥，膿毒癥誘發的肺功能障礙非常普遍。在致病因素中，膿毒癥相關性急性肺損傷（ALI）的發病率最高，死亡率最高，超過40%的膿毒癥患者發展為ALI［3-4］。單層內皮細胞附著在血管內壁上，構成血-組織交換界面，是維持組織和器官正常功能的基礎。內皮功能障礙是膿毒癥和ALI/ARDS 的標志［5］。目前臨床上膿毒癥所致ALI 和急性呼吸窘迫綜合征的治療手段有限，因此，研究有效的藥物對該病的治療極為重要。丹參臨床常用于通經止痛、活血化瘀、清心除煩等；丹參酮ⅡA 是丹參中最重要的有效活性成分，也最為穩定，有良好的生物利用度和保護內皮細胞、調節免疫、抗炎、抗氧化、改善微循環等多種藥理效用［6］。既往研究表明丹參酮ⅡA 可通過TLR/核轉錄因子-κB（NF-κB）和MAPKs/NFκB 通路抑制炎癥反應保護脂多糖誘導的小鼠肺損傷［7］；也可以通過抑制NF-κB 和HIF-1α 通路，抑制炎癥反應和細胞凋亡，減輕脂多糖誘導的小鼠ALI［8］，但丹參酮ⅡA 在膿毒癥ALI 中對肺微血管內皮細胞的作用少有報道。因此本研究通過對小鼠進行盲腸結扎穿刺（CLP）手術建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，觀察不同劑量的丹參酮ⅡA 對模型小鼠肺血管內皮細胞損傷及炎性因子的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級72只C57BL/6小鼠，8周齡，體質量18～22 g，生產許可證號SCXK（鄂）2021-0027，使用許可證號SYXK（鄂）2021-0057。購自湖北省實驗動物研究中心，飼養于華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，溫度20 ℃，相對濕度50%，12 h 光照/12 h 黑暗循環。本研究已獲得倫理委員會批準。

1.2 試藥與儀器

丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（上海第一生化），小鼠白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢艾美捷），小鼠白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（武漢博士德），BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天公司），細胞總蛋白提取試劑盒（武漢艾美捷）。顯微鏡（OlympusIX71型，日本OLYMPUS）；離心機（AvantiJ-15R 型，美國貝克曼庫爾特）；電泳儀（EPS-300 型，上海天能科技）等。

1.3 分組與造模

將小鼠隨機分為假手術組、模型組、丹參酮1 組（10 mg/kg）、丹參酮2組（30 mg/kg）、丹參酮3組（50 mg/kg）、丹參酮4 組（100 mg/kg），每組12 只。適應性飼喂3 d后進行實驗。術前禁食12 h，不禁水。小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉100～120 mg／kg 麻醉，置于仰位，于中下腹部做1 cm 縱切，打開腹腔，通過鈍性分離及游離操作，充分暴露盲腸，于距盲腸末端1 cm處采用3號縫合線環形結扎，保證腸道通暢，距結扎處5 mm 位置采用9 號針頭貫穿盲腸2 次，輕擠壓確保糞便溢出，并進行后續的關閉腹腔手術。假手術組除開腹后不做盲腸結扎與穿刺外，其他操作相同。

1.4 干預方法

造模后即刻，4 個丹參酮組小鼠腹腔分別注射相應劑量的丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液，假手術組和模型組注射生理鹽水。完成干預后為所有小鼠提供相同環境和飲食。

1.5 標本采集與檢測

造模24 h 后，在頸椎脫臼法處死小鼠前30 min 至1 h，用2%伊文思藍液（2 mg/kg）從尾靜脈注射。1 h后將小鼠腹腔注射麻醉并固定，于胸骨中線處行開胸手術，暴露胸腔臟器后剪開左心房，用生理鹽水從左心房處充分灌洗心臟及血管內的Evans Blue，直至左心房處無血性液體流出。進一步暴露肺組織及氣管，肉眼觀察雙肺顏色并拍照。用留置靜脈針進行氣管插管，用4 號手術線結扎固定右側主支氣管，并將右肺切除放于冰盒。用2.0 mL PBS 進行肺泡灌洗持續約1 min，抽取灌洗液1.5 mL，重復3 次，收集肺泡灌洗液，離心后-80 ℃冰箱保存。

1.5.1 肺毛細血管通透性 稱取100 mg 左右肺組織，剪碎后研磨勻漿，加入1 mL 甲酰胺后水浴、離心，取上清液，用酶標儀測液620 nm 波長處吸光度OD 值，計算肺組織的Evans Blue含量（μg/g）。

1.5.2 肺組織病理改變及損傷評分 取右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片4 mm進行HE染色，二甲苯脫蠟，無水乙醇水化，蘇木精染色，酒精脫水，二甲苯透明。封片后于光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理變化，根據中性粒細胞浸潤、肺泡腔內出血及滲出、透明膜形成、肺泡水腫等肺組織病理變化評估肺組織損傷程度。

1.5.3 肺組織干濕重比 取右肺中葉組織，濾紙擦干，稱重并記錄即濕重（W）。放入烤箱中，每12 小時稱1次，直至質量不再變化，記錄即干重（D）。計算小鼠肺組織濕/干重比（W/D）。

1.5.4 肺組織及肺泡灌洗液（BALF）中炎性因子 將肺泡灌洗液室溫解凍后，按照BCA 試劑盒的操作步驟檢測BALF 蛋白濃度，依據檢測說明書按步驟采用ELISA 法檢測BALF 中白細胞計數（WBC）、IL-6、TNFα及IL-1β的濃度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠Evans Blue法測肺毛細血管通透性比較

肉眼觀察，假手術組小鼠肺藍染不明顯；相較于假手術組，模型組小鼠肺藍染明顯；丹參酮各組藍染程度相較模型組有不同程度的減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織Evans Blue染色

各組小鼠肺組織Evans Blue 含量的統計描述見表1。模型組EB 含量顯著高于假手術組；丹參酮各組小鼠EB 含量較模型組明顯減少（P＜0.05）；在丹參酮各組內，2 組、3 組與4 組之間差異無統計學意義（P＞0.05），而2、3、4 組小鼠肺組織EB 含量較丹參酮1 組明顯下降（P＜0.05）。

表1 各組小鼠EB含量、W/D及肺損傷評分比較（±s）

表1 各組小鼠EB含量、W/D及肺損傷評分比較（±s）

注：與丹參酮1組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別假手術組模型組丹參酮1組丹參酮2組丹參酮3組丹參酮4組n 12 12 12 12 12 12 EB 含量（μg/g）1.74±2.23 7.69±2.66 5.62±1.76△4.02±1.32*△3.82±1.16*△3.88±1.43*△W/D 4.00±0.21 4.78±0.15 4.35±0.17△4.09±0.15*△3.97±0.17*△4.00±0.12*△肺損傷評分（分）0.22±0.02 0.69±0.05 0.55±0.04△0.35±0.02*△0.33±0.03*△0.33±0.04*△

2.2 各組小鼠肺組織HE染色結果比較

見圖2。光鏡下，假手術組小鼠肺組織結構清晰完整，完整肺泡數量多，肺泡腔及間質內無充血滲出，無中性粒細胞浸潤；模型組小鼠肺組織結構遭到嚴重破壞，肺泡邊緣不清晰，數量明顯減少，肺泡腔和間質內大量炎性細胞浸潤、充血，肺泡間隔增寬，間隔內血管擴張，內皮細胞脫落；丹參酮各組較模型組肺組織結構破壞減輕，大部分肺泡尚完整，肺泡腔內及肺間隔充血滲出緩解。

圖2 各組小鼠肺組織病理組織觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組小鼠肺W/D比較

見表1。丹參酮組（TanⅡA干預組）小鼠肺組織含水量較模型組明顯減少（P＜0.05）；在丹參酮各組內，丹參酮2 組、丹參酮3 組與丹參酮4 組之間差異無統計學意義（P＞0.05），而丹參酮2、3、4 組的肺組織含水量較丹參酮1組明顯下降（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠肺損傷評分比較

見表1。與模型組比較，丹參酮各組小鼠損傷評分明顯降低（P＜0.05）；在丹參酮各組內，與1 組比較，2、3、4 組肺損傷評分降低（P＜0.05）。2、3、4 組之間肺組織損傷評分差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 各組小鼠肺組織及BALF中白細胞計數、蛋白質、炎性因子水平比較

見表2。丹參酮各組細胞、蛋白質含量計數以及各種炎性因子明顯小于模型組（CLP）（P＜0.05）；在丹參酮各組內，與丹參酮1 組相比，其他3 個丹參酮組白細胞計數、蛋白質含量以及炎性因子明顯降低（P＜0.05）；而丹參酮2 組、丹參酮3 組和丹參酮4 組之間白細胞計數、蛋白含量以及IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠BALF白細胞計數、蛋白含量及炎性因子水平比較（±s）

表2 各組小鼠BALF白細胞計數、蛋白含量及炎性因子水平比較（±s）

組別假手術組模型組丹參酮1組丹參酮2組丹參酮3組丹參酮4組n 12 12 12 12 12 12白細胞計數（×109/L）6.90±0.90 13.00±0.82 10.94±0.90△7.92±1.07*△7.45±0.66*△7.46±0.74*△蛋白含量（mg/mL）0.21±0.03 0.58±0.07 0.51±0.05△0.40±0.04*△0.40±0.02*△0.40±0.04*△IL-6（pg/mL）57.69±7.70 542.31±23.08 373.08±23.08△192.31±15.38*△188.46±15.38*△180.77±19.23*△TNF-α（pg/mL）41.38±6.90 396.55±20.69 296.55±20.69△165.52±10.35*△158.62±10.35*△155.17±13.80*△IL-1β（pg/mL）9.80±0.82 34.29±2.45 29.94±1.63△25.03±1.36*△23.13±1.09*△23.40±1.09*△

3 討 論

膿毒癥并發的ALI/ARDS 會增加膿毒癥患者器官功能障礙和死亡的風險，而ALI/ARDS 的重要病理生理機制是肺微血管內皮細胞的損傷［9］，其中，內皮細胞的屏障功能的破壞和代謝與分泌功能的亢進是其損傷的突出表現。血管內皮細胞（VEC）是位于血管內壁的一層多功能細胞，其最重要的功能之一是作為循環血液和周圍組織中間的半滲透屏障，在血-組織交換中發揮重要作用，對維持器官內環境穩態有重要作用。相關研究已經明確，內皮屏障完整性的破壞是導致膿毒癥和ALI/ARDS 發病的關鍵因素［5，10］。除了具有屏障功能外，內皮細胞還具有代謝和分泌功能，在生理狀態下參與炎癥反應、血栓形成、影響血管通透性及液體平衡等；而在膿毒癥的發生發展過程中，作為病原體及其毒素的主要靶器官，血管內皮細胞的代謝與分泌功能被過度激活，釋放大量炎性因子，參與炎癥-免疫反應、補體系統激活和凝血紊亂等病理改變。此外高水平的炎性因子會引起肺血管內皮屏障功能障礙，從而導致ALI。由于肺由大量的毛細血管網組成，因此肺組織的微血管內皮細胞更易受到諸如缺氧、內毒素等疾病因素的侵襲，肺也因此成為膿毒癥過程中的主要靶器官［11］。和一般的血管內皮細胞相似，當肺微血管內皮細胞受到病原體及毒素等因素刺激后，屏障功能破壞，微血管通透性增加；代謝和分泌功能亢進，參與補體系統的過度激活、免疫應答異常、炎癥風暴和凝血紊亂等病理學改變，從而進一步加重肺微血管內皮細胞的損傷，引起彌漫性肺微血管血栓形成。上述病理生理反應促進大量液體及炎癥因子通過肺微血管滲入肺組織，導致肺組織損傷及肺間質水腫形成，臨床上表現為進行性低氧血癥，最終可進展為ARDS，嚴重影響治療及患者預后。叢迪迪等［12］的綜述性文獻報告了中藥材干預膿毒癥急性肺損傷研究的最新進展。多種中藥材從干預炎性因子及炎癥信號通路、抗氧化應激以及抑制細胞凋亡等途徑實現干預膿毒癥ALI 的目的。

丹參具有活血祛瘀、涼血消癰之功效，有著廣泛的臨床應用［13］。丹參酮ⅡA是丹參中最重要也最為穩定的有效活性成分，有良好的生物利用度和保護內皮細胞、調節免疫、抗炎、抗氧化、改善微循環等多種藥理效用［6］，在臨床上有抗炎解毒、活血祛瘀之功效［14］。多項研究發現，丹參酮ⅡA 可有效拮抗膿毒血癥中多種炎癥因子和氧自由基等水平的異常改變［15-17］。已有研究表明，丹參酮ⅡA 可通過TLR/NF-κB 和MAPKs/NF-κB 通路抑制炎癥反應、保護脂多糖誘導的小鼠肺損傷［7］；也有研究發現丹參酮ⅡA 可以通過抑制NFκB 和HIF-1α 通路，抑制炎癥反應和細胞凋亡，減輕脂多糖誘導的小鼠ALI［8］；此外，TanⅡA 能夠明顯改善大鼠腸缺血再灌注導致的肺損傷［18］也被研究證實?；谇叭说膶嶒灲Y果，在本研究中，我們采用盲腸結扎穿孔術（CLP）構建膿毒癥肺損傷模型，并使用TanⅡA（每日10、30、50、100 mg/kg）腹腔注射干擾丹參酮組，觀察丹參酮ⅡA 對膿毒癥肺損傷中肺微血管內皮細胞的保護作用。根據實驗結果，可以將丹參酮ⅡA 對肺的保護作用分為以下幾點：1）從宏觀角度，丹參酮ⅡA 改善膿毒癥小鼠肺組織損傷。各組小鼠肺組織HE 染色的結果比較直觀地證明了這一點。與模型組相比，所有丹參酮組小鼠肺組織光鏡下病理變化均發生不同程度的減輕。此外，各組小鼠的肺損傷評分比較提供了可靠的數據支持。數據顯示丹參酮ⅡA 干預對膿毒癥小鼠的急性肺損傷具有明顯保護作用。2）從微觀角度，丹參酮ⅡA 減輕了膿毒癥小鼠肺血管的高通透性。在Evans Blue 法測肺毛細血管通透性實驗中通過肉眼觀察各組小鼠雙肺顏色變化直觀感受到丹參酮ⅡA 干預后肺通透性明顯降低，而進一步的Evans Blue 含量測量量化了模型組與各丹參酮組的肺毛細血管通透性。此外，各組小鼠肺W/D比值比較實驗從另一個角度再次驗證丹參酮ⅡA 干預措施減輕了膿毒癥過程中小鼠肺毛細血管通透性。3）從微觀角度，丹參酮ⅡA 減輕了膿毒癥小鼠肺血管的炎性滲出。在肺組織及BALF中白細胞計數、蛋白質含量以及炎性因子的比較實驗中，炎性滲出物被定量測定并通過統計學檢驗，證明丹參酮ⅡA 干預措施可以減輕膿毒癥小鼠肺血管的炎性滲出，且干預效果呈劑量依賴性，丹參酮ⅡA 30 mg/kg即可達到最佳效果。

根據上述結果可以推測丹參酮ⅡA 對膿毒癥小鼠肺組織損傷的保護作用可能來自對肺毛細血管屏障功能的保護以減輕膿毒癥肺血管的高通透性，以及對肺毛細血管過度代謝和分泌功能的抑制以減輕肺血管的炎性滲出。本實驗的不足之處在于未分析丹參酮ⅡA在膿毒癥過程中保護肺毛細血管屏障功能、抑制肺毛細血管過度代謝和分泌功能的分子生物學機制。在已經明確丹參酮ⅡA 對膿毒癥小鼠肺組織損傷的保護作用后，進一步的實驗應該著眼于對其作用機制和信號途徑的研究，這可能有助于開發針對ALI/ARDS 的藥物開發。