MRE11-RAD50-NBS1復合物的功能與人類疾病的研究進展

許曉慧 劉一丹

摘要：生物體的DNA常遭受著來自體外和體內各種因素的攻擊，其中DNA雙鏈斷裂（DSB）是嚴重的一種DNA損傷方式。為了保證遺傳信息的穩定性，生物體自身存在應對DNA損傷的修復機制。同源重組修復是精確的修復DSB的方式，MRE11-RAD50-NBS1（MRN）復合物是參與同源重組修復的關鍵蛋白，在不同物種之間存在保守性。從前關于MRN復合物的功能研究主要來源于釀酒酵母和線蟲等低等生物，近些年來對哺乳動物MRN復合物的研究提示MRN復合物在高等動物DNA損傷修復中存在功能。本文綜述了MRN復合物的組成和結構及其在DNA損傷同源重組修復中的功能，同時也介紹了MRN復合物異常所帶來的人類疾病共濟失調性毛細血管擴張綜合征類似病癥、奈梅亨斷裂綜合征和奈梅亨斷裂綜合征類似病癥，并對這 3類DNA損傷修復缺陷疾病的臨床表型和相關小鼠模型研究進行了總結。

關鍵詞：DNA損傷修復；DNA雙鏈斷裂；同源重組；MRE11-RAD50-NBS1復合物

中圖分類號： R34文獻標識碼： A文章編號：1000-503X（2024）02-0232-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15556

Research Progress in the Roles of MRE11-RAD50-NBS1 Complex and Human Diseases

XU Xiaohui，LIU Yidan

Womens Hospital，School of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310006，China

Correspnding author：LIU Yidan Tel：18667040717，E-mail：yidanliu@zju.edu.cn

ABSTRACT：DNA is susceptible to various factors in vitro and in vivo and experience different forms of damage，among which double-strand break（DSB）is a deleterious form.To maintain the stability of genetic information，organisms have developed multiple mechanisms to repair DNA damage.Among these mechanisms，homologous recombination（HR）is praised for the high accuracy.The MRE11-RAD50-NBS1（MRN）complex plays an important role in HR and is conserved across different species.The knowledge on the MRN complex mainly came from the previous studies in Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans，while studies in the last decades have revealed the role of mammalian MRN complex in DNA repair of higher animals.In this review，we first introduces the MRN complex regarding the composition，structure，and roles in HR.In addition，we discuss the human diseases such as ataxia-telangiectasia-like disorder，Nijmegen breakage syndrome，and Nijmegen breakage syndrome-like disorder that are caused by dysfunctions in the MRN complex.Furthermore，we summarize the mouse models established to study the clinical phenotypes of the above diseases.

Key words：DNA repair；DNA double-strand break；homologous recombination；MRE11-RAD50-NBS1 complex

Acta Acad Med Sin，2024，46（2）：232-241

DNA承載著生物體的遺傳信息，是生物生存、發展和進化的基礎，所以保證DNA的完整性和穩定性對生物體至關重要。在復雜多變的環境之下，DNA常遭受著不同形式的損傷，其中DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是嚴重的一種DNA損傷類型，為了保證遺傳信息的穩定性，生物體自身存在應對DNA損傷的修復機制，一旦發生DSB，細胞將進行DNA損傷修復反應（DNA damage repair，DDR）^［1］。MRE11-RAD50-NBS1（以下簡稱MRN）復合物是DDR信號通路上的DSB信號感受器，可以第一時間感知DSB的發生，并聚集到DSB附近，通過與共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）相互作用傳導DNA損傷修復的信號；同時DSB附近的組蛋白也將發生不同形式的修飾，并憑借這些修飾位點特異性地招募下游DDR相關蛋白，最終完成DNA損傷修復過程^［2-4］。MRN復合物對DNA損傷修復的重要性不容置疑，其突變或者缺失會造成人類染色體不穩定的疾病。隨著高通量測序技術的發展，研究者發現了許多這類疾病，如共濟失調性毛細血管擴張綜合征類似病癥（ataxia-telangiectasia like disorder，ATLD）、奈梅亨斷裂綜合征（Nijmegen breakage syndrome，NBS）和NBS類似病癥（NBS like disorder，NBSLD），這些疾病的臨床表征不僅存在相似之處也有其獨特性，提示MRN復合物在響應DNA損傷修復和疾病的發生發展過程中可能還存在其他作用。因此，本文總結當前關于MRN復合物的一些研究成果，概括了其結構和功能并重點闡述了MRN復合物和相關人類疾病的臨床表征及其小鼠模型研究，可為臨床醫師在人類DNA損傷修復領域研究MRN復合物功能提供參考。

1 同源重組與MRN復合物

1.1 DNA損傷修復和同源重組

細胞主要通過兩條修復途徑對DSB進行修復：非同源末端連接和同源重組。

非同源末端連接是指DNA直接在斷裂位點進行連接的修復方式，此過程不需要同源模板的參與，該方式可以發生于細胞周期的各個階段，是一種快速但是容易出錯的修復方式。目前研究發現，非同源末端連接存在兩種類型，分別是經典的非同源末端連接和替代的非同源末端連接。經典的非同源末端連接過程需要兩種DNA解旋酶亞基形成的異源二聚體（低等生物中為Ku70/Ku80、哺乳動物同系物為X射線修復互補交叉蛋白5/6）和DNA依賴性蛋白激酶的參與；與之相反的是，替代的非同源末端連接過程是一種低效率的修復方式，這種方式可能是在經典的非同源末端連接存在缺陷時作為候補的一條修復通路^［5］。

同源重組是指斷裂DNA必須在同源模板的參與下，通過一系列因子的協同作用才能完成的一種修復方式，與非同源末端連接相比，同源重組是精確并且不易出錯的DSB修復途徑^［6］。當細胞選擇以同源重組的方式進行修復時，需要對DSB產生的DNA末端進行一定程度的切割，這一過程由MRN復合物及其他核酸酶對5DNA末端進行切除，產生3單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）^［7］。一旦ssDNA產生，復制蛋白質A作為單鏈結合蛋白結合到DNA上保護單鏈免于降解，隨后在乳腺癌易感蛋白1/2（breast cancer type 1/2 susceptibility protein，BRCA1/BRCA2）等DDR蛋白的幫助下，名為同源物輻射敏感蛋白51（radiation sensitive protein 51，RAD51）的重組酶取代復制蛋白質A與ssDNA結合形成RAD51-ssDNA的纖維狀結構。RAD51-ssDNA作為重組中間體負責同源模板的找尋和鏈侵入^［8-9］。同源模板一般是姐妹染色單體或者同源染色體。在鏈侵入過程中，RAD51-ssDNA會和同源模板形成置換環結構，隨著置換環結構的進一步擴展，斷裂位點相連，繼而生成霍利迪連接體結構；置換環結構和霍利迪連接體結構均可在酶和其他蛋白介導下進行解離，并最終生成兩種形式的同源重組修復產物（交叉產物或者非交叉產物），至此即完成同源重組修復DSB的過程^［10］。值得注意的是，生物體內生殖細胞的減數分裂中也存在同源重組修復，減數分裂是單倍體配子產生的生物學基礎。與體細胞不同的是，開啟減數分裂的精母細胞和卵母細胞中會自發產生大量的程序性DSB，然后通過同源重組的方式、以同源染色體作為模板對這些DSB進行修復，這也是生物體遺傳多樣性的來源。減數分裂的同源重組與體細胞中大體類似，許多體細胞中關鍵的同源重組蛋白也參與了此過程^［11］。

DNA末端切割是同源重組修復的起始，也是DNA損傷修復關鍵的一步^［12］。MRN復合物是負責DNA末端切割的關鍵蛋白，MRE11同時具有核酸內切酶和3-5核酸外切酶的活性。MRE11在RAD50和NBS1的協助下，首先對DSB位點進行短距離的切割，然后具有5-3端核酸外切酶活性的核酸外切酶1（exonuclease 1，Exo1）和DNA復制解旋酶/外切酶（DNA replication helicase/nuclease，DNA2）對5端DNA鏈進行長距離的切割，最后MRN復合物和Exo1/DNA2協同工作，對DSB進行雙向的末端切割，形成一段長的3端ssDNA^［7，13］。正確的DNA末端切割還需要其他因子參與，包括C端結合蛋白相互作用蛋白（C terminal binding protein interacting protein，CtIP）以及布盧姆氏綜合征解旋酶等^［14］。CtIP與MRN復合物結合，能夠激活MRE11核酸內切酶的活性，促進DSB位點短距離的切割，布盧姆氏綜合征解旋酶與Exo1/DNA2結合，能夠促進DNA鏈長距離的末端切割效率^［15］。

1.2 MRN復合物的結構和功能

MRN復合物是由MRE11、RAD50和NBS1蛋白組成的多聚復合物，具有參與DNA損傷修復同源重組過程、調控細胞周期和信號轉導以及維持端粒穩定性功能。

MRE11蛋白相對分子質量約為81×10³，是DNA結合蛋白，也是核酸酶。MRE11蛋白N端是形成MRE11二聚體的核心結構域，包含了與NBS1蛋白結合的位點，同時也是其核酸內切酶和3-5核酸外切酶活性中心，負責切割DNA末端；近N端存在一段帽子結構域，能夠誘導雙鏈DNA解旋和定位DNA鏈；MRE11蛋白的C端包含DNA結合結構域和RAD50蛋白結合結構域，是形成MRN復合物并介導復合物與DNA結合的關鍵結構域^［7］（圖1）。

NBS1蛋白是一個連接蛋白，相對分子質量約95×10³，故又稱為 p95。NBS1蛋白N端存在一個叉頭相關結構域（the forkhead-associated domain，FHA）和兩個串聯的BRCA1羧基末端結構域（BRCA1 C terminus domain，BRCT），負責識別DSB的發生。NBS1蛋白C端包含MRE11結合結構域，同時存在ATM結合結構域，可介導NBS1蛋白與ATM的相互作用，調控細胞信號通路；NBS1蛋白的中心結構域存在絲氨酸-谷氨酰胺基序能夠被ATM磷酸化，DNA損傷檢驗點介導蛋白1可以識別并結合在這些被磷酸化的氨基酸基序上，組裝形成下游DDR蛋白的招募平臺，負責進一步傳遞并響應DDR信號^［16］（圖2）。

RAD50蛋白是染色體結構維持蛋白家族的成員。RAD50在胞質內與MRE11結合形成四聚體M₂R₂。RAD50兩端具有三磷酸腺苷（adenosie triphosephate，ATP）酶的特定基序Walker A和Walker B，這兩種保守的氨基酸基序可以使得RAD50結合并水解ATP產生能量，對促進RAD50的蛋白二聚化、改變MRN復合物與DNA鏈之間的構象起到重要作用。此外，RAD50蛋白還具有兩個卷曲螺旋結構域，它們在三維結構中形成反向平行的連接并被鋅離子螯合的鋅鉤結構分開，使RAD50蛋白形成“V”狀結構，賦予蛋白高度的靈活性（圖3）。RAD50的柔性結構為MRN復合物之間的彼此溝通和找尋DNA模板提供了可能^［17］。

MRN復合物作為與DSB位點結合的效應器之一，其主要功能是參與同源重組的末端切割過程，還可以通過與ATM相互作用來參與DNA損傷信號的傳導和調控細胞周期^［18-19］。目前的研究發現ATM的激活并不完全依賴于MRN復合物的存在，MRN復合物缺失僅僅會導致活化的ATM水平降低，表明依然存在其他被激活的ATM^［20-21］。有研究發現NBS1蛋白第278和第343兩個位點處的絲氨酸可以被ATM磷酸化，參與調控S期內部檢查點，而MRE11和RAD50同樣可被ATM磷酸化后，參與DDR信號的傳導^{［4，22-23］}。酵母和擬南芥的研究中發現MRN復合物參與調控和維持端粒的長度^［24-25］。部分人類腫瘤細胞中存在不依賴端粒酶而能維持端粒長度的機制即端粒延長替代機制，該機制可能是基于DNA損傷修復的同源重組通路來修復斷裂端粒位點，所以有研究認為MRN復合物在腫瘤細胞的端粒維持過程中存在作用^［26-27］。

2 MRN復合物與人類疾病

MRE11蛋白是MRN復合物的核心蛋白，具有核酸酶的活性，并負責執行同源重組DNA的末端切割^［7］。NBS1蛋白負責MRN復合物的入核定位，并可識別DSB的發生^［28］。RAD50蛋白具有特殊的卷曲螺旋結構能夠增加MRN復合物的柔性，使得DSB附近的MRN復合物彼此交互，直至DSB達到能夠響應DDR的閾值^［29］。MRN復合物對于同源重組修復DSB這一過程至關重要，MRN復合物的功能缺失會導致一系列人類疾病，所以DNA損傷修復機制的研究熱點之一是針對MRN復合物的編碼基因突變后所致人類疾病的研究。

2.1 MRE11與ATLD

共濟失調性毛細血管擴張綜合征（ataxia-telangiectasia，A-T），是一類因ATM突變導致的常染色體隱性遺傳病。A-T患者由于控制平衡和運動的小腦存在異常，往往會出現共濟失調的癥狀，且隨著患者年齡的增長，還會出現運動神經系統的異常，同時也會出現毛細血管擴張、部分體液免疫系統的缺陷，伴有對惡性腫瘤易感、對電離輻射敏感和基因組不穩定等特征^［30］。有研究還發現了一類與A-T具有相似臨床表型的疾病，但其ATM基因并沒有發生突變，于是將這種與A-T表型相似的疾病稱之為ATLD。根據突變基因的不同可將ATLD分為兩類：第一類是MRE11突變造成的，另一類是由于增殖細胞核抗原基因發生突變^［31-32］。對第一類ATLD患者的生化分析發現，MRE11的突變會導致MRE11蛋白低水平表達或者截短表達，從而影響了MRE11蛋白的酶活性和MRN復合物的形成^［31］。

有研究先后報道了4例帶有MRE11基因突變的ATLD患者，分別是ATLD 1/2和ATLD 3/4：（1）ATLD 1/2患者為一對表兄妹，攜帶有相同的MRE11純合突變即MRE11 1897bp處發生了堿基替換由C轉變成T，引起MRE11蛋白在第633位的精氨酸處提前終止（R633 stop），均表現出明顯的A-T癥狀即共濟失調和小腦分區異常^［33-34］。進一步研究發現，正常的細胞在應對電離輻射誘導的DNA損傷時，MRE11蛋白會在DSB位點形成電離輻射誘導的焦點（irradiation-induced nuclear foci，IRIF）以響應DDR信號。然而攜帶ATLD 1/2患者突變的MRE11蛋白卻無法形成IRIF，說明MRE11基因突變會造成DDR應答的缺陷。（2）ATLD 3/4患者是攜帶有MRE11雜合突變的一對兄弟，測序后發現這對兄弟的MRE11基因在第350bp處發生了堿基的替換由A轉變成G，導致MRE11蛋白第117位上的天冬酰胺被替換成絲氨酸（N117S）。同時在1714bp處發生C到T的轉變造成MRE11蛋白在第571位的精氨酸處提前終止（R571X），該突變繼承了母本基因組的突變，但往往會因為無義介導的mRNA降解，幾乎不會表達或者低水平表達MRE11截短蛋白，兩位患者也均出現了共濟失調、小腦萎縮和眼球運動失能等癥狀^［34-35］。

2004年Delia等^［35］報道了意大利家族的兩例ATLD患者（ATLD 5/6），ATLD 5/6患者是攜帶MRE11復合雜合突變的一對兄妹，都繼承了來自母親的MRE11基因突變，即在1442bp處發生了堿基C到A的替換所造成MRE11蛋白第481位的蘇氨酸被替換成賴氨酸（T481K）的錯義突變，同時也存在與ATLD 3/4相同的在第571位的精氨酸處提前終止（R571X）的突變。2005年Fernet等^［36］報道了來自3個不相關阿拉伯家族的10例ATLD患者（ATLD 7-16），ATLD 7-16患者均攜帶純合的MRE11蛋白的錯義突變即第210位氨基酸處的色氨酸被替換成半胱氨酸（W210C），并表現出A-T類似的臨床表型。2009年Uchisaka等^［37］報道了一對患有肺腺癌的ATLD患者（ATLD 17/18），ATLD 17/18患者是一對兄弟，攜帶有MRE11第243位氨基酸處的色氨酸被替換成精氨酸（W243R）的錯義突變和內含子突變即基因組序列24994處核苷酸的替換（g.24994G>A），導致MRE11蛋白在其帽子結構域處丟失了27個氨基酸殘基。ATLD 17/18突變位于MRE11 N段核心區域和C端DNA結合區域，患者表現共濟失調同時伴有小腦萎縮和智力遲鈍等的臨床表征，分別在9歲和16歲時死于肺腺癌，這也是首次發現的ATLD感染惡性腫瘤的病例。

目前為止，公開報道的18例由MRE11突變導致的ATLD病例均存在共濟失調和小腦萎縮的臨床表征，但均未出現毛細血管擴張的癥狀，并且僅有2名ATLD患者存在惡性腫瘤的易感（表1）。

2.2 NBS1蛋白與NBS

NBS是因為NBS1第6～10號外顯子發生突變導致的一類隱性遺傳病，大約有90%以上的NBS患者攜帶的突變是在657bp處缺失了5個堿基造成的移碼突變，可表示為NBS1 657Δ5突變^［38］。NBS1 657Δ5突變會導致NBS1蛋白在第218位氨基酸處提前終止，并因閱讀框的變換在第221位氨基酸處又重新開始表達，理論上會存在兩段NBS1截短蛋白的表達：（1）NBS1 p26蛋白，相對分子質量約為26×10³，僅表達NBS1蛋白N端的FHA和BRCT結構域；（2）NBS1 p70蛋白，相對分子質量約為70×10³，表達NBS1蛋白C端MRE11結合結構域和ATM結合結構域^［38-39］。有研究發現在NBS患者的淋巴母細胞系中兩段截短蛋白都存在，但在其纖維細胞中只檢測到了NBS1 p26蛋白^［38］。NBS患者會表現出明顯的臨床特征，如鳥樣面部特征、頭小畸形和發育遲緩伴隨畸形等，還存在免疫缺陷和淋巴惡性腫瘤易感。除此之外，NBS女性患者多發生原發性卵巢功能不全，而男性患者多在青春期表現為弱精癥^［40］。NBS患者的細胞也會出現和A-T、ATLD患者細胞相同的表型，即輻射敏感、染色體不穩定、細胞周期檢查點異常和同源重組效率降低等^［41-42］。

2.3 RAD50與NBSLD

NBSLD是因RAD50發生突變而導致的類似NBS的人類疾病，目前報道還很少，僅有的一例是德國女性，具有NBS典型的臨床表型：頭小畸形和鳥樣狀面部特征。基因分析結果顯示，該患者并不攜帶NBS1基因的致病突變，反而攜帶了RAD50基因的復合雜合突變。對患者細胞RAD50基因的編碼區進行序列分析發現，在RAD50基因的第21號外顯子上帶有母系遺傳突變，導致RAD50蛋白在第1093位的精氨酸處翻譯提前終止，同時在第25號外顯子處攜帶有來自父本的單堿基突變，影響了RAD50蛋白翻譯時的終止密碼子，導致該突變可在RAD50蛋白的羧基端延長翻譯產生66個額外的氨基酸。進一步的生化分析發現，該患者的細胞中僅殘留極低水平的、不穩定的RAD50蛋白，這意味著來自母系遺傳的RAD50突變可能存在無義突變介導的mRNA降解，而在父系遺傳的RAD50突變占據主導地位時，RAD50蛋白也只能進行異常、不穩定的翻譯。除此之外這些細胞存在G1/S細胞周期檢查點激活缺陷，表現出耐輻射的DNA合成和G2期積累的現象。值得注意的是，該患者就診時體內免疫球蛋白水平是正常的，未發現任何惡性腫瘤的傾向性^［43］。

MRE11、RAD50和NBS1蛋白均為DDR過程中的關鍵蛋白，當這三個基因之一發生突變導致MRN復合物的形成和功能存在缺陷時，就會使得損傷的DNA鏈得不到正確有效的修復，產生染色體斷裂、重排或者缺失的異常現象，從而增加了染色體的不穩定性，導致人類疾病和腫瘤發生。ATLD、NBS和NBSLD三種疾病存在共同點和差異：（1）三種疾病的共同點是都存在DDR應答缺陷，具體表現為患者細胞染色體不穩定性和對輻射敏感增加；（2）通過對比試驗發現ATLD患者的癥狀與AT病癥更加相似，出現共濟失調和小腦萎縮等神經退行性變化；（3）NBS患者存在獨特的鳥樣面部特征和發育畸形等異常的臨床特征，同時還存在免疫缺陷和惡性淋巴腫瘤易感性；NBSLD患者雖然具有NBS典型的臨床特征，但是NBSLD患者不存在明顯的惡性腫瘤易感性。上述的三種疾病既存在DNA損傷應答缺陷又表現出各自獨特的臨床表征，說明MRN復合物對DDR應答通路同樣重要，也表明了MRN復合物各個蛋白又存在各自獨特的功能。

3 MRN復合物相關人類疾病的小鼠模型研究

3.1 MRE11相關疾病的小鼠模型研究

有研究設計了Mre11^ATLD1/ATLD1的小鼠模型，在小鼠Mre11 1894bp處進行A到T的突變導致蛋白的截短，該小鼠能夠比較完美地模擬ATLD患者的一些疾病表型，如Mre11^ATLD1/ATLD1的小鼠表現出染色體的不穩定性和細胞周期的缺陷，與ATLD患者一致，且沒有惡性腫瘤的易感性，可用于研究MRE11突變在ATLD中的作用機制^［44］。該研究還通過Mre11^ATLD1/ATLD1模型小鼠很好地解釋了ATLD女性群體存在的生殖問題，研究者通過Mre11^ATLD1/ATLD1小鼠純合交配觀察胚胎在小鼠子宮內的發育過程，發現Mre11^ATLD1/ATLD1純合胚胎能夠進入囊胚期，但是相比于正常組胚胎，大部分的Mre11^ATLD1/ATLD1純合胚胎不能從囊胚期的透明帶中孵化進入下一個胚胎發育時期，最終在體外培養的第1～3天內出現壞死細胞，與目前報道的ATLD女性患者不存在卵巢發育不良和卵泡發育缺陷的問題卻出現生育力低下的現狀高度一致。Mre11^ATLD1/ATLD1雌性生育率低下原因是MRE11突變可能會造成胚胎在細胞分裂中出現阻滯或延遲，從而導致胚胎囊胚期發育障礙，因此也可以認為MRE11在早期胚胎發育過程尤其是囊胚期孵化和囊胚腔形成的過程中發揮重要作用。

3.2 NBS1蛋白相關疾病的小鼠模型研究

2002年Kang等^［45］設計了Nbs1^m/m的小鼠，通過刪除NBS1的第2號和3號外顯子來破壞NBS1蛋白N段的表達，并且驗證了該基因型小鼠的成纖維細胞內存在一段低水平表達的NBS1截短蛋白p75，僅保留了NBS1蛋白C端的結構域（表2）。該研究發現Nbs1^m/m的小鼠可以存活，但表現為發育遲緩、多種淋巴細胞發育缺陷和免疫缺陷并伴有胸腺淋巴瘤易感的表型。除此之外，Nbs1^m/m雌鼠與對照組相比，其卵巢高度退化并伴隨著原發性卵母細胞和卵泡的完全缺失，即Nbs1^m/m雌鼠不育，這一生殖表型也與NBS女性患者所報道的卵母細胞發育缺陷一致。在Nbs1^m/m的細胞表型上的研究發現，該基因型的胚胎干細胞表現出強烈的輻射敏感性，并在輻照后長時間積累在G2期，而其成纖維細胞則表現出耐輻射的DNA合成和G1/S期過渡的缺陷。Williams等^［46］在研究構建Nbs1^ΔB/ΔB小鼠模型時發現Nbs1^ΔB/ΔB的小鼠是可以存活的，其諸多疾病表型也遠遠弱于NBS患者，例如Nbs1^ΔB/ΔB小鼠的免疫球蛋白數量與健康小鼠相比僅略有降低以及Nbs1^ΔB/ΔB小鼠不存在惡性腫瘤的易感傾向（表2）。

2005年Difilippantonio等^［47］直接將人源NBS1 657Δ5基因導入到內源性Nbs1基因完全敲除的小鼠當中，構建了hNbs1^657Δ5mNbs1^-/-小鼠模型（表2）。因為考慮到Nbs1基因完全敲除會導致小鼠早期胚胎死亡，該研究首先獲得了hNbs1^657Δ5 mNbs1^+/+之后再與mNbs1^+/-進行交配，最終獲得基因型hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-的小鼠，用同樣的方法獲得hNbs1^WT mNbs1^-/-小鼠，并且證明了人源的全長NBS1可以挽回NBS1敲除致死的表型。hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-小鼠的表型幾乎完全與NBS患者的表型一致：在免疫方面hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-小鼠T細胞發育異常、免疫球蛋白水平降低，同時在晚期多出現淋巴惡性腫瘤，hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-雌鼠在出生后出現卵巢退化，且沒有原始卵泡和卵母細胞，在減數分裂進程中雌鼠減數分裂正常啟動，但停滯在粗線期，即hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-雌鼠不育。這些現象提示，帶有657Δ5的NBS1變異蛋白可能具有減數分裂同源重組的缺陷。同時還發現hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-基因型的小鼠細胞中MRE11的入核受到了影響以及存在細胞周期檢查點的缺陷。

hNbs1^657Δ5 mNbs1^-/-基因型的小鼠存在極低水平的NBS1 p70表達，這一截短蛋白僅保留了NBS1 C端MRE11結合結構域和ATM結合結構域，而缺失了NBS1 N端結構域。在以往研究中發現，對NBS1 N端結構域FHA和BRCT進行定點誘變實驗，會破壞MRN復合物的IRIF形成，并且影響NBS1蛋白的磷酸化；因為FHA和BRCT兩個結構域非常接近，無法將兩者對NBS1的功能明確分開，所以可認為FHA和BRCT結構域對NBS1的功能影響是相似的^［48］。為了進一步確定NBS1 N端結構域在體內的作用，Difilippantonio等^［47］構建了一個hNbs1^H45A mNbs1^-/-基因型的小鼠（表2）。hNbs1^H45A的突變會使得NBS1 FHA結構域失活，但不影響整體NBS1蛋白的表達。首先hNbs1^H45A mNbs1^-/-小鼠是可以存活的，在免疫系統方面hNbs1^H45A mNbs1^-/-小鼠表現出T細胞發育缺陷。在生殖方面hNbs1^H45A mNbs1^-/-小鼠出現卵巢退化和卵母細胞缺陷，即雌鼠不育。此現象提示，FHA結構域對于NBS1在生殖細胞發育中的功能非常重要。在細胞表型上，hNbs1^H45A mNbs1^-/-成纖維細胞中MRE11不能被招募到DSB位點，這表明FHA結構域負責MRN復合物在DSB位點的正確駐留。目前針對NBS研究的小鼠模型總結見表2。

為了開展NBS1突變導致腦發育缺陷的機制研究，研究人員構建了在中樞神經系統特異性敲除Nbs1的小鼠模型Nbn^CNS-del，該小鼠模型再現了NBS患者在腦發育方面存在的缺陷，出現了頭小畸形這一典型特征。該模型闡述了在小鼠腦組織中NBS1的突變會導致DNA損傷的積聚和大腦皮質明顯的神經元退行性變，進而導致下游p53的激活并特異性地調控下游基因表達造成神經元前體細胞增殖障礙。同時該研究還發現Nbn^CNS-del小鼠腦組織的不同部位神經元對DNA損傷應答具有組織空間調節的特異性^［49-50］。

3.3 RAD50相關疾病的小鼠模型研究

2002年研究人員構建了Rad50純合突變的小鼠模型Rad50^S/S，該突變是Rad50 ATP結合結構域上的錯義突變，導致RAD50蛋白第22位的賴氨酸突變為甲硫氨酸^［51］。該模型攜帶的RAD50突變在釀酒酵母中表現出孢子形成失敗、減數分裂障礙的表型，意味著RAD50蛋白在減數分裂過程中的重要作用^［52］。研究人員還進一步利用Rad50^S/S小鼠模型探索在哺乳動物中RAD50蛋白的作用。Rad50^S/S小鼠模型在胚胎第14～16天出現部分胚胎致死的現象，同時Rad50^S/S小鼠也會發生早衰、嚴重貧血、造血功能障礙和胸腺結構異常，Rad50^S/S細胞還表現出低水平的RAD50表達和染色體不穩定性的特征。Rad50^S/S雌性小鼠可育，雄性小鼠睪丸發育正常，但是生精小管內減數分裂細胞會發生凋亡，從而造成耗竭，盡管如此Rad50^S/S雄鼠依然可育。Rad50^S/S小鼠模型在造血和生殖系統上均表現出明顯的衰竭狀態，表明了RAD50對于維持增殖組織穩態的重要性。大部分MRN復合物相關人類疾病都構建了相關小鼠模型，而有關于人類NBSLD的小鼠模型目前尚未開發。

4 總結和展望

DSB是基因組面臨的最嚴重的損傷之一，而同源重組則是能夠精確修復DSB、維持基因組穩定性的重要修復機制。同源重組的關鍵步驟之一是對DSB產生的DNA末端進行一定程度地切割，而MRN復合物是此步驟中的關鍵蛋白。與其重要性相一致的是，MRN復合物中任一蛋白的編碼基因發生有害突變均會造成染色體不穩定綜合征，如ATLD、NBS和NBSLD。本文總結了這三類疾病患者的表型以及構建的模擬疾病表型的小鼠模型的研究。對這些疾病患者及相應小鼠模型的研究發現不同疾病在神經系統功能、生長發育以及腫瘤易感性上有明顯差異。以上現象提示，MRN復合物的各個蛋白不僅作為復合物共同作用，還可能在參與DSB損傷應答、維持基因組穩定性的方面具有獨立于MRN復合物之外的其他功能。

此外，本文還關注了MRN相關疾病在生殖方面的表型，以及相關小鼠模型的研究。生殖細胞減數分裂的同源重組與體細胞過程類似，許多同源重組的關鍵蛋白也參與生殖細胞的減數分裂。從本文中關于MRN缺陷的疾病表述中我們可以發現，不同疾病患者在生育力方面有所不同：ATLD女性患者多存在生育力低下的表征；而NBS女性患者與原發性卵巢功能不全存在高度的相關性。此外，本文中提到的對應小鼠模型的研究也提示，MRN復合物很有可能參與減數分裂同源重組的調控，但MRE11、NBS1和RAD50可能存在不同的作用效果。由于當前關于MRN復合物在哺乳動物減數分裂同源重組中的機制研究還比較少，因此需要構建新的、有針對性的小鼠模型進行更深入的研究。

綜上，本文總結了MRN復合物的功能與人類疾病的關聯研究，揭示了MRE11、RAD50和NBS1在DNA損傷修復中的重要功能。基于本綜述我們可以提出如下值得深入探索的研究方向：進一步開展組成MRN復合物的三種蛋白在神經系統的發育、胚胎或生殖系統發育以及抑制腫瘤發生等方面的研究，獲取更多、更詳實實驗數據，從而解析MRE11、RAD50和NBS1的功能和疾病發生之間的關聯，幫助我們更加全面地理解這三種蛋白的作用，為相關人類疾病的緩解甚至是治愈提出新的可行方案。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 許曉慧：研究思路的提出，文獻檢索和文章撰寫；許曉慧、劉一丹：論文的修訂、質量控制及審查，并同意對研究工作誠信負責

參 考 文 獻

［1］Jackson SP，Bartek J.The DNA-damage response in human biology and disease［J］.Nature，2009，461（7267）：1071-1078.DOI：10.1038/nature08467.

［2］Rahman S，Canny MD，Buschmann TA，et al.A survey of reported disease-related mutations in the MRE11-RAD50-NBS1 complex［J］.Cells，2020，9（7）：1678.DOI：10.3390/cells9071678.

［3］West AG，van Attikum H.Chromatin at the crossroads：meeting on signalling to chromatin epigenetics［J］.EMBO Rep，2006，7（12）：1206-1210.DOI：10.1038/sj.embor.7400834.

［4］Matsuoka S，Ballif BA，Smogorzewska A，et al.ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage［J］.Science，2007，316（5828）：1160-1166.DOI：10.1126/science.1140321.

［5］Pannunzio NR，Watanabe G，Lieber MR.Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks［J］.J Biol Chem，2018，293（27）：10512-10523.DOI：10.1074/jbc.TM117.000374.

［6］Callen E，Zong D，Wu W，et al.53BP1 enforces distinct pre-and post-resection blocks on homologous recombination［J］.Mol Cell，2020，77（1）：26-38.e7.DOI：10.1016/j.molcel.2019.09.024.

［7］Buis J，Wu Y，Deng Y，et al.Mre11 nuclease activity has essential roles in DNA repair and genomic stability distinct from ATM activation［J］.Cell，2008，135（1）：85-96.DOI：10.1016/j.cell.2008.08.015.

［8］Sigurdsson S，Van Komen S，Petukhova G，et al.Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54［J］.J Biol Chem，2002，277（45）：42790-42794.DOI：10.1074/jbc.M208004200.

［9］Yuan J，Chen J.FIGNL1-containing protein complex is required for efficient homologous recombination repair［J］.PNAS，2013，110（26）：10640-10645.DOI：10.1073/pnas.1220662110.

［10］Ciccia A，McDonald N，West SC.Structural and functional relationships of the XPF/MUS81 family of proteins［J］.Annu Rev Biochem，2008，77：259-287.DOI：10.1146/annurev.biochem.77.070306.102408.

［11］Bolcun-Filas E，Handel MA.Meiosis：the chromosomal foundation of reproduction［J］.Biol Reprod，2018，99（1）：112-126.DOI：10.1093/biolre/ioy021.

［12］Mirman Z，Lottersberger F，Takai H，et al.53BP1-RIF1-shieldin counteracts DSB resection through CST-and Polα-dependent fill-in［J］.Nature，2018，560（7716）：112-116.DOI：10.1038/s41586-018-0324-7.

［13］Garcia V，Phelps SE，Gray S，et al.Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1［J］.Nature，2011，479（7372）：241-244.DOI：10.1038/nature10515.

［14］Schiller CB，Seifert FU，Linke-Winnebeck C，et al.Structural studies of DNA end detection and resection in homologous recombination［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2014，6（10）：a017962.DOI：10.1101/cshperspect.a017962.

［15］Reginato G，Cejka P.The MRE11 complex：a versatile toolkit for the repair of broken DNA［J］.DNA Repair（Amst），2020，91-92：102869.DOI：10.1016/j.dnarep.2020.102869.

［16］Chapman JR，Jackson SP.Phospho-dependent interactions between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage［J］.EMBO Rep，2008，9（8）：795-801.DOI：10.1038/embor.2008.103.

［17］Lamarche BJ，Orazio NI，Weitzman MD.The MRN complex in double-strand break repair and telomere maintenance［J］.FEBS Lett，2010，584（17）：3682-3695.DOI：10.1016/j.febslet.2010.07.029.

［18］Dupre A，Boyer-Chatenet L，Gautier J.Two-step activation of ATM by DNA and the Mre11-Rad50-Nbs1 complex［J］.Nat Struct Mol Biol，2006，13（5）：451-457.DOI：10.1038/nsmb1090.

［19］Finn K，Lowndes NF，Grenon M.Eukaryotic DNA damage checkpoint activation in response to double-strand breaks［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（9）：1447-1473.DOI：10.1007/s00018-011-0875-3.

［20］Lavin MF，Kozlov S，Gatei M，et al.ATM-dependent phosphorylation of all three members of the MRN complex：from sensor to adaptor［J］.Biomolecules，2015，5（4）：2877-2902.DOI：10.3390/biom5042877.

［21］Uziel T，Lerenthal Y，Moyal L，et al.Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage［J］.EMBO J，2003，22（20）：5612-5621.DOI：10.1093/emboj/cdg541.

［22］Zhao S，Weng YC，Yuan SS，et al.Functional link between ataxia-telangiectasia and Nijmegen breakage syndrome gene products［J］.Nature，2000，405（6785）：473-477.DOI：10.1038/35013083.

［23］Bensimon A，Aebersold R，Shiloh Y.Beyond ATM：the protein kinase landscape of the DNA damage response［J］.FEBS Lett，2011，585（11）：1625-1639.DOI：10.1016/j.febslet.2011.05.013.

［24］Mary Kironmai K，Muniyappa K.Alteration of telomeric sequences and senescence caused by mutations in RAD50 of Saccharomyces cerevisiae［J］.Genes Cells，1997，2（7）：443-455.DOI：10.1046/j.1365-2443.1997.1330331.x.

［25］Nugent CI，Bosco G，Ross LO，et al.Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks［J］.Curr Biol，1998，8（11）：657-662.DOI：10.1016/S0960-9822（98）70253-2.

［26］de Lange T.Protection of mammalian telomeres［J］.Oncogene，2002，21（4）：532-540.DOI：10.1038/sj.onc.1205080.

［27］de Lange T.T-loops and the origin of telomeres［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5（4）：323-329.DOI：10.1038/nrm1359.

［28］Zhang Y，Zhou J，Lim CU.The role of NBS1 in DNA double strand break repair，telomere stability，and cell cycle checkpoint control［J］.Cell Res，2006，16（1）：45-54.DOI：10.1038/sj.cr.7310007.

［29］Casari E，Rinaldi C，Marsella A，et al.Processing of DNA double-strand breaks by the MRX complex in a chromatin context［J］.Front Mol Biosci，2019，6：43.DOI：10.3389/fmolb.2019.00043.

［30］Teive HAG，Camargo CHF，Munhoz RP.More than ataxia-movement disorders in ataxia-telangiectasia［J］.Parkinsonism Relat Disord，2018，46：3-8.DOI：10.1016/j.parkreldis.2017.12.009.

［31］Lee JH，Ghirlando R，Bhaskara V，et al.Regulation of Mre11/Rad50 by Nbs1：effects on nucleotide-dependent DNA binding and association with ataxia-telangiectasia-like disorder mutant complexes［J］.J Biol Chem，2003，278（46）：45171-45181.DOI：10.1074/jbc.M308705200.

［32］Baple EL，Chambers H，Cross HE，et al.Hypomorphic PCNA mutation underlies a human DNA repair disorder［J］.J Clin Invest，2014，124（7）：3137-3146.DOI：10.1172/JCI74593.

［33］Hernandez D，McConville CM，Stacey M，et al.A family showing no evidence of linkage between the ataxia telangiectasia gene and chromosome 11q22-23［J］.J Med Genet，1993，30（2）：135-140.DOI：10.1136/jmg.30.2.135.

［34］Stewart GS，Maser RS，Stankovic T，et al.The DNA double-strand break repair gene hMRE11 is mutated in individuals with an ataxia-telangiectasia-like disorder［J］.Cell，1999，99（6）：577-587.DOI：10.1016/S0092-8674（00）81547-0.

［35］Delia D，Piane M，Buscemi G，et al.MRE11 mutations and impaired ATM-dependent responses in an Italian family with ataxia-telangiectasia-like disorder［J］.Hum Mol Genet，2004，13（18）：2155-2163.DOI：10.1093/hmg/ddh221.

［36］Fernet M，Gribaa M，Salih MAM，et al.Identification and functional consequences of a novel MRE11 mutation affecting 10 Saudi Arabian patients with the ataxia telangiectasia-like disorder［J］.Hum Mol Genet，2005，14（2）：307-318.DOI：10.1093/hmg/ddi027.

［37］Uchisaka N，Takahashi N，Sato M，et al.Two brothers with ataxia-telangiectasia-like disorder with lung adenocarcinoma［J］.J Pediatr，2009，155（3）：435-438.DOI：10.1016/j.jpeds.2009.02.037.

［38］Tauchi H，Matsuura S，Kobayashi J，et al.Nijmegen breakage syndrome gene，NBS1，and molecular links to factors for genome stability［J］.Oncogene，2002，21（58）：8967-8980.DOI：10.1038/sj.onc.1206136.

［39］Maser RS，Zinkel R，Petrini JH.An alternative mode of translation permits production of a variant NBS1 protein from the common Nijmegen breakage syndrome allele［J］.Nat Genet，2001，27（4）：417-421.DOI：10.1038/86920.

［40］Szeliga A，Zysnarska A，Szklarska Z，et al.A case of premature ovarian insufficiency in Nijmegen breakage syndrome patient and review of literature.From gene mutation to clinical management［J］.Gynecol Endocrinol，2019，35（11）：999-1002.DOI：10.1080/09513590.2019.1626366.

［41］Lins S，Kim R，Krüger L，et al.Clinical variability and expression of the NBN c.657del5 allele in Nijmegen breakage syndrome［J］.Gene，2009，447（1）：12-17.DOI：10.1016/j.gene.2009.07.013.

［42］Seemanová E，Sperling K，Neitzel H，et al.Nijmegen breakage syndrome（NBS）with neurological abnormalities and without chromosomal instability［J］.J Med Genet，2006，43（3）：218-224.DOI：10.1136/jmg.2005.035287.

［43］Waltes R，Kalb R，Gatei M，et al.Human RAD50 deficiency in a Nijmegen breakage syndrome-like disorder［J］.Am J Hum Genet，2009，84（5）：605-616.DOI：10.1016/j.ajhg.2009.04.010.

［44］Theunissen JW，Kaplan MI，Hunt PA，et al.Checkpoint failure and chromosomal instability without lymphomagenesis in Mre11（ATLD1/ATLD1）mice［J］.Mol Cell，2003，12（6）：1511-1523.DOI：10.1016/s1097-2765（03）00455-6.

［45］Kang J，Bronson RT，Xu Y.Targeted disruption of NBS1 reveals its roles in mouse development and DNA repair［J］.EMBO J，2002，21（6）：1447-1455.DOI：10.1093/emboj/21.6.1447.

［46］Williams BR，Mirzoeva OK，Morgan WF，et al.A murine model of Nijmegen breakage syndrome［J］.Curr Biol，2002，12（8）：648-653.DOI：10.1016/s0960-9822（02）00763-7.

［47］Difilippantonio S，Celeste A，Fernandez-Capetillo O，et al.Role of Nbs1 in the activation of the Atm kinase revealed in humanized mouse models［J］.Nat Cell Biol，2005，7（7）：675-685.DOI：10.1038/ncb1270.

［48］Cerosaletti KM，Concannon P.Nibrin forkhead-associated domain and breast cancer C-terminal domain are both required for nuclear focus formation and phosphorylation［J］.J Biol Chem，2003，278（24）：21944-21951.DOI：10.1074/jbc.M211689200.

［49］Li R，Yang YG，Gao Y，et al.A distinct response to endogenous DNA damage in the development of Nbs1-deficient cortical neurons［J］.Cell Res，2012，22（5）：859-872.DOI：10.1038/cr.2012.3.

［50］Liu B，Chen X，Wang ZQ，et al.Nbn gene inactivation in the CNS of mouse inhibits the myelinating ability of the mature cortical oligodendrocytes［J］.Glia，2014，62（1）：133-144.DOI：10.1002/glia.22593.

［51］Bender CF，Sikes ML，Sullivan R，et al.Cancer predisposition and hematopoietic failure in Rad50（S/S）mice［J］.Genes Dev，2002，16（17）：2237-2251.DOI：10.1101/gad.1007902.

［52］Alani E，Padmore R，Kleckner N.Analysis of wild-type and rad50 mutants of yeast suggests an intimate relationship between meiotic chromosome synapsis and recombination［J］.Cell，1990，61（3）：419-436.DOI：10.1016/0092-8674（90）90524-i.

（收稿日期：2023-03-01）