殼寡糖的制備、純化及應用研究進展

郭漢忠，李永莎，李永成,2，夏光華,2，張雪瑩,2,*

（1.南海水產資源高效利用工程研究中心，海洋食品精深加工海口市重點實驗室，國家對蝦加工技術研發分中心（海南），海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570228；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連理工大學，遼寧大連 116034）

幾丁質（Chitin，CI）又名甲殼素，是一種天然多糖，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，是世界上僅次于纖維素的第二豐富的多糖[1-2]，廣泛存在真菌和藻類的細胞壁以及節肢動物（如昆蟲、蝦和蟹）的外殼中[3]。CI 經脫乙酰化作用后得到殼聚糖（Chitosan，CS）（圖1），由于質子化作用，CS 可以溶于酸性介質，如稀乙酸和甲酸[4-5]。但是，CI 和CS 的分子量和聚合度（Degree of Polymerization，DP）較高，結構致密，水溶性差，因而限制了其在工業上的應用。殼寡糖（Chitooligosaccharide，COS）是CI 或CS 通過酶法或化學法降解后獲得的GlcNAc 和D-葡萄糖胺（D-glucosamine，GlcN）的同源或異源低聚物，DP 為2～20。COS 是目前已知的少數堿性寡糖之一，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、免疫調節等生物活性[6-8]，在食品、醫療保健和農業等領域有巨大的應用價值。基于此，將CI 轉化為溶解度高、生物活性廣泛的COS 更有利于推動其在商業中的應用[4,9-10]。

圖1 幾丁質和殼聚糖的結構式Fig.1 Structures of chitin and chitosan

COS 的制備方法包括物理法、傳統化學法、電化學法、酶法以及化學-酶法。傳統化學法利用酸或堿脫去CI 的乙酰基提高底物的溶解度，隨后發生解聚作用生成水溶性的COS。該法操作簡單，更容易實現工業化生產。COS 的生物功能與其DP 和乙酰化程度（Degree of Acetylation，DA）密切相關。然而，化學反應條件劇烈，很難獲得具有特定DP 和DA 的COS 產物。因此，研究者將目光轉向了反應過程溫和、可控、對環境更加友好的酶法。近些年來，酶法水解CI 制備COS 一直是研究的熱點。為了解決CI 結晶度高、酶法水解效率低的問題，更多的反應工程策略被提出，如多酶聯合法以及化學-酶法。同時，為了進一步獲得高純度、高品質的COS以滿足生物醫學和食品加工業的需求，研究者們探索了不同的分離純化方法，如超濾法、色譜法和活性炭吸附法等。因此，本文對近些年COS 的制備和純化方法進行了總結，同時對COS 的應用研究進展進行了綜述，以期為高品質COS 的制備以及應用領域的拓展提供理論基礎。

1 殼寡糖的制備

1.1 酶解法

酶法是一種反應條件較為溫和的方法，通常在常溫、常壓和中性pH 環境下催化反應的進行，很少使用對環境有害的試劑，生成的產物供人們使用安全，因而產物可被用于農業、生物技術和生物醫學等多個領域[11]。與此同時，隨著遺傳學、蛋白質工程和生物信息學等生物技術的發展，酶在許多工業過程中的應用開啟了新時代。在過去的幾十年里，酶法降解CI 和CS 已被認為是一種十分具有發展前景的方法。目前，用于水解CI 和CS 的酶分為專一性酶和非專一性酶。專一性酶包括幾丁質酶和殼聚糖酶等，而非專一性酶包括纖維素酶、溶菌酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶和胃蛋白酶等。

1.1.1 幾丁質酶 幾丁質酶是專一性降解CI 生成N-乙酰殼寡糖或單糖的一類酶的總稱，由多種微生物（包括病毒、細菌和真菌）、昆蟲或高等動植物合成[11-12]。根據水解作用模式，可以將幾丁質酶分為內切幾丁質酶（EC 3.2.1.14）、外切幾丁質酶（EC 3.2.1.29）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52）。內切幾丁質酶在多糖鏈內部隨機水解CI 的糖苷鍵，生成GlcNAc 或其可溶性低聚物。外切幾丁質酶在CI 的還原端或非還原端水解多糖鏈生成（GlcNAc）2，而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可以將（GlcNAc）2水解為GlcNAc 或從N-乙酰殼寡糖的非還原端釋放GlcNAc[13]（圖2）。

圖2 幾丁質降解酶降解幾丁質的示意圖[14]Fig.2 Schematic diagram of chitin degraded by chitinolytic enzymes[14]

在自然界中，CI 資源十分豐富，在CI 降解微生物的作用下將其轉化為可被利用的碳源和氮源以維持生態系統的穩定。因而，研究者們一直致力于從富含幾丁質的環境中分離、純化幾丁質降解微生物，進而獲得幾丁質酶、殼聚糖酶或溶解性多糖單加氧酶等參與幾丁質降解的酶系。Le 等[15]從鹽蝦樣品中篩選到了能夠降解幾丁質的微生物Salinivibriosp.BAO-1801，并從其發酵液中純化到了幾丁質酶BAO-1801。該幾丁質酶水解膠體幾丁質后生成的主要產物為（GlcNAc）2，反應8 h 后產率為71.5%。Wang 等[16]從蝦殼廢棄物中篩選到了能夠產低溫幾丁質酶的菌株Trichoderma gamsiiR1，當以純化的幾丁質酶水解膠體幾丁質時，生成的產物為GlcNAc、（GlcNAc）2和（GlcNAc）3，產率分別為1.73、11.62和1.92 mg/mL。Fu 等[17]從海洋沉積物中分離到了一株海洋細菌Exiguobacterium antarcticumDW2，該菌株產生的幾丁質酶EaChi39 能夠將膠體幾丁質水解為GlcNAc、（GlcNAc）2和（GlcNAc）3，產率分別為9.9、14.8 和5.0 mg/mL。

為了解決野生酶產量低、分離純化過程復雜等問題，可以借助基因工程技術對幾丁質酶基因進行異源表達。Thomas 等[18]在Escherichia coliM15 中克隆表達了Vibrio campbellii幾丁質酶基因，得到的重組幾丁質酶VhChiA 能夠以魷魚軟骨、蝦殼和蟹殼來源的膠體幾丁質作為底物，主要產物均是（GlcNAc）2，產率分別為0.60、0.85 和0.34 mmol/L。Gao 等[19]在E.coliBL21 克隆、表達了來自Streptomyces albolongusATCC 27414 的幾丁質酶基因，獲得的重組幾丁質酶SaChiA4 能夠將膠體幾丁質水解為GlcNAc 和（GlcNAc）2，產率分別為0.87 和2.17 mg/mL。大多數能夠分解CI 的微生物細胞內含有多個幾丁質降解酶，而幾丁質的高效降解可能是由這些酶聯合作用完成[20]。Suzuki 等[21]報道了來自Serratia marcescens2170 的三個重組幾丁質酶Chi A、Chi B 和Chi C1，當Chi A 與Chi B 或Chi A與Chi C1 共同作用降解CI 粉末時，（GlcNAc）1-3的總產量分別提高了80%和45%，而當三種幾丁質酶同時作用于幾丁質粉末時，（GlcNAc）1-3的總產量約提高了100%。因此，多種幾丁質酶聯合使用是實現幾丁質高效降解的有效手段，并且已在多篇報道中被證實[22-24]。

1.1.2 殼聚糖酶 CI 降解的另一種途徑是將其去乙酰化為CS，之后在殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）的作用下轉化為COS。殼聚糖酶是一種糖苷水解酶，能夠水解部分乙酰化CS 中的β-1,4-糖苷鍵[25-26]。根據其對CS 鏈中四種結構單元即GlcNAc-GlcN（A-D）、GlcN-GlcNAc（D-A）、GlcN-GlcN（D-D）和GlcNAc-GlcNAc（A-A）的水解特異性，可分為四種類型（CLASS Ⅰ-Ⅳ）（表1）[27]。而根據對底物的水解作用位點，殼聚糖酶又可分為內切殼聚糖酶和外切殼聚糖酶兩種類型。內切殼聚糖酶的酶解產物主要為二聚體到六聚體，而外切殼聚糖酶的酶解產物只有單糖[28]。Doan 等[29]從Paenibacillussp.TKU047 的發酵液中純化到了內切殼聚糖酶TKU047，隨后該課題組以粗酶液酶解脫乙酰度為98%的殼聚糖，產物為DP 2～9 的COS，產率為68.44%。趙華等[30]通過硫酸銨沉淀分離純化Bacillus cereus發酵上清液中的殼聚糖酶，利用響應面法獲得了最佳酶解條件，最終COS 的產物濃度可達到35.73 μmol/mL。羅灑等[31]克隆、表達了來自Bacillus amyloliquefaciensECU08的內切殼聚糖酶，該酶酶解脫乙酰度為87.53%的CS 后主要產生DP 為2～3 的COS，并且在30 L 規模的擴大試驗研究中總產物的生產收率和原料收率分別為75.8%和85.1%。物料衡算和經濟核算表明，該工藝收益較高，適用于工業化生產。

表1 四種不同裂解結構單元的殼聚糖酶Table 1 Chitosanase with four different cleavage structural units

1.1.3 溶解性多糖單加氧酶 在自然界中，除了幾丁質酶和殼聚糖酶等糖苷水解酶外，溶解性多糖單加氧酶（EC 1.14.99.54，Lytic Polysaccharide Monooxygenase，LPMO）也是參與幾丁質降解的關鍵酶之一。LPMO 是一種銅依賴性酶[32]，銅離子結合在特殊的組氨酸支架中，使LPMO 具有顯著的氧化能力，在電子供體（如抗壞血酸）存在的情況下，可以催化多糖結晶區域的糖苷鍵氧化裂解，使氧化位點附近區域的結晶度降低，并且產生新的鏈端供糖苷水解酶識別，進而提高水解效率（圖2）[14,33-34]。LPMO 與水解酶協同作用，在結晶性多糖如纖維素和CI 的生物轉化方面發揮了重要作用。Zhang 等[35]將來源于Bacillus amyloliquefaciens的BtLPMO10A 和BtLPMO10B 分別與S.marcescens來源的幾丁質酶SmChiB 協同作用降解α-幾丁質，與SmChiB 單獨酶解組相比，（GlcNAc）2的產量由0.21 mg/mL 分別提高至1.35和1.17 mg/mL。Vaaje-Kolstad 等[36]克隆、表達了來源于Lactococcus lactisssp.lactisIL1403 的幾丁質酶LlChi18A 和LPMO（LlCBP33A），并用于降解α-幾丁質和β-幾丁質。以α-幾丁質作為底物，相同反應時間下，僅以LlChi18A 作為催化劑時（GlcNAc）2的產率約為130 μmol/L，在LlCBP33A的協同作用下（GlcNAc）2的產率提高至大約165 μmol/L。以β-幾丁質作為底物，僅以LlChi18A作為催化劑反應350 h 后（GlcNAc）2的產率約為160 μmol/L，但是在LlCBP33A 的協同作用下僅需50 h 即可達到相當的產率。之后，該課題組克隆、表達了來源于Enterococcus faecalisV583 的幾丁質酶EfChi18A 和LPMO（EfCBM33A）降解α-幾丁質和β-幾丁質。僅以EfChi18A 作為催化劑時（GlcNAc）2的產率分別約為60 和300 μmol/L，在EfCBM33A的協同作用下（GlcNAc）2的產率分別提高至大約85 和1050 μmol/L[37]。LPMO 在與幾丁質酶協同作用降解CI 方面展現了優越的催化性能，從其被發現能夠氧化裂解結晶多糖后一直是研究的熱點，并且從工業和科學的角度來說都具有重要的研究意義。然而，LPMO 在催化反應過程中需要加入電子供體，在工業大規模應用中額外添加電子供體生產成本較高。因此，尋找價格低廉的電子供體，構建高效降解幾丁質的生物催化體系，并揭示其協同作用機制是未來研究的重要方向。

1.1.4 非專一性酶 除了上述特異性酶類外，還有一些非特異性酶類對CI 和CS 也展現了較高的水解活性。黃曉月等[38]以被廣泛用于食品工業的木瓜蛋白酶作為催化劑水解CS，通過單因素及響應面設計優化工藝條件最終獲得DP 為6～10 的COS，產率為45.07%。Dong 等[39]對比研究了纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、溶菌酶、木聚糖酶和β-糖苷酶對CS 的水解活性，其中纖維素酶和木瓜蛋白酶展現了較高的水解活力。隨后，該課題組構建了包括纖維素酶、木瓜蛋白酶和殼聚糖酶的聯合酶系統水解CS，制備的COS DP 為6～8，目標產物的產率為79.84%。另有報道采用α-淀粉酶水解經H2O2預處理后的CS 制備出DP 為2～8 的COS，在最適反應條件下，COS 的產量約為1.05 mmol/g[40]。

1.2 物理法

用于制備COS 的物理法包括紫外輻射、超聲破碎和微波處理等。Xing 等[41]采用微波輻射法（80 ℃，800 W，輻射時間25 min）制備的COS 聚合度為2～6，并且具有免疫調節活性。Wu 等[42]利用渦輪空化裝置進行旋流空化降解CS，反應條件經優化后CS 的結晶度降低了83.65%，溶解性得到極大的增強。Margoutidis 等[43]利用球磨機使CI 的結晶度降低50%，并且添加天然粘土高嶺石可以使CI 的溶解度增加1 倍，獲得的產物為GlcNAc 和（GlcNAc）2。物理法操作相對簡單，但是獲得的產物產量較低，且降解程度有限，進而限制了其大規模生產，無法產生較大的社會經濟效益[44-46]。

1.3 化學法

目前，用于水解CS 制備COS 的化學試劑有酸（如鹽酸、亞硝酸和磷酸）和氧化還原劑（如過氧化氫、臭氧和次氯酸）[47-49]。酸性溶液中的氫離子能夠與CS 分子中的游離氨基結合，使得CS 的分子間氫鍵斷裂，從而獲得DP 不等的COS[50]。如季者等[51]研究了鹽酸對CS 的降解作用，在60 ℃下、以9 mol/L 的鹽酸降解CS 后獲得的主要產物為殼五糖和殼六糖，其總產量為16.2%。氧化劑在水溶液中形成的游離自由基可以斷裂CS 的糖苷鍵，進而形成DP 不等的COS[50]。如焦富穎[52]利用H2O2降解CS 制備COS，在最優反應條件下，即0.5wt%殼聚糖，8vol% H2O2，反應時間5 h，反應溫度50 ℃，產物的分子量在2000 Da 左右，收率為85%。化學法制備COS 操作簡單，但是降解產物的DP 范圍分布廣泛，產量低。使用酸性溶液制備COS 時，生成的產物安全性低，生成的二級產物難以分離，殘留酸和由此產生的有毒廢棄物后續處理復雜，易造成環境污染[53]。使用氧化劑降解CS 時，若氧化劑濃度或反應溫度過高，會導致CS 水解過度，產物的氨基損失較多，顏色也會由于褐變而加深，使得品質下降。因此，CS 經氧化劑部分降解后，需結合后續的分離純化過程以得到高品質的COS。

此外，電化學法也被報道用于制備COS。通常來講，電極材料基本分為兩種類型，一種為活性電極（如Ti/TiO2-RuO2電極），另一種為非活性電極（如Ti/Sb-SnO2電極）[54]。Cai 等[55]利用Ti/TiO2-RuO2電極降解CS，CS 的分子量隨著電流密度的增加而降低。當電流密度增大至160 mA/cm2時，處理1 h后CS 的黏均分子量由491 kDa 降低至33 kDa。之后，該課題組分別利用Ti/Sb-SnO2和Ti/TiO2-RuO2電極降解CS，在60 mA/cm2的電流密度條件下處理1 h 后，CS 的黏均分子量由479 kDa 分別降低至46 kDa 和158 kDa[54]。電化學法操作簡單，無污染，具有潛在的應用價值。但是，該方法存在電極壽命短、易失效等問題。因此，開發出具有更高電流效率和更低成本的制備裝置是該領域未來研究的重點。

1.4 化學-酶法

單一法制備COS 會存在一定的不足，如酶解法無法高效水解CI 致密的結晶結構，多數情況下需要將CI 制備成膠體CI。通過化學法預處理CI 能夠提高酶解效率，起到“1+1＞2”的效果。鄭必勝等[56]在60 ℃下用過氧化氫（4%，w/v）、乙酸（4%，w/v）預處理脫乙酰度為96.7%的CS，使得CS 的表面結構被破壞，孔隙增多，獲得DP＜10 的COS，產率約為62%。Sivaramakrishna 等[57-58]利用氫氧化鉀（11.2%～20%）水溶液或氫氧化鉀（11.2%～20%）-尿素（4%）水溶液預處理CI，結果表明CI 經預處理后酶解效率顯著提高，COS 產率約為70%。

上述用于預處理CI 的化學試劑為強酸或強堿試劑，反應條件苛刻，對環境不友好。為了滿足綠色化工的生產理念，亟需綠色、溫和的溶劑來替代上述化學試劑。離子液體（Ionic liquids，ILs）是一種在室溫下以液體形式存在的離子化合物，具有熔點低、穩定性高、無揮發性、可回收等特點，因而對環境的化學污染較小。ILs 能夠溶解天然聚合物，如CI[59]或纖維素[60]。幾丁質經ILs 預處理并再生后，氫鍵網絡發生重排，表面結構被破壞，結晶度降低[23,61]。因此，研究者們構建了基于ILs 和幾丁質酶的化學-酶法降解幾丁質制備單糖和寡糖（表2）。盡管ILs 被稱為“綠色溶劑”，但是其對水生和陸地生態系統的影響還有待評估[62]。

表2 ILs-酶法制備COSTable 2 Preparation of COS by ILs-enzymatic process

2 殼寡糖的純化

通過酶法、化學法或協同法降解CI 或CS 后獲得的產物通常為單體、低聚物或同分異構體的混合物，產物的分子量和DP 分布較寬。為了更好地揭示COS 的構效關系以及滿足生物醫學和食品加工業對其純度和質量的要求，選擇合適的方法從混合物中分離和鑒定所需要的COS 至關重要。由于COS分子中含有較多的氨基和羥基，并且存在較強的分子間或分子內作用力，因而增加了分離純化的難度。

2.1 超濾法

利用膜生物反應器超濾提純COS 是較為常見的方法，具有操作簡便、綠色環保、成本低等優點。影響COS 回收率的因素包括膜的類型、操作溫度、進料溶液的pH 和溶液的濃度[65]。Yu 等[66]采用截留分子量為3 kDa 的超濾膜制備膜生物反應器，當停留時間為50 min 時，高DP 的COS（DP≥5）產物純度約為28%，當停留時間為100 min 時，高DP 的COS（DP≥5）產物純度約為48%。Aider 等[67]利用電滲析和超濾聯合法分離純化DP 為2～4 的COS混合物，研究發現二聚體在不同的pH 下均能達到最佳純化效果，其次是三聚體，最后是四聚體。根據處理時間的不同，在pH6 的條件下可以將二聚體和三聚體分離出來，或者在pH7 條件下僅將二聚體分離出來。仲偉偉等[68]選用截留分子量為10 kDa 的卷式超濾膜對COS 粗品進行超濾，超濾所得樣品純度為78.58%。吳健鋒[69]在35 ℃下采用2.5 kDa 的超濾膜截留DP 為2～6 的COS，最終目標產物的純度高達93.88%。膜生物反應器易于操作，通過截留分子大小的方式可以有效地提高產物純度，更好地達到分離純化的目的。

2.2 色譜法

色譜法純化COS 包括離子交換色譜（Ion Exchange，IEC）法、薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）法和高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法等。IEC 法是利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離的方法，一般選擇離子交換樹脂作為固定相。Wei[70]及Li 等[71]利用CM-葡聚糖凝膠C-25 柱對不同DA 的殼六糖成功進行了分離純化，可得到純度高達93%的殼六糖。TLC 法是利用各組分對同一吸附劑吸附能力不同，在流動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）不斷發生吸附—解吸過程中將各組分分離。該法以相對較低的成本，基于DP 對低聚物混合物進行分析。Chen 等[72]在硅膠板上以甲醛:甲醇:25%氨水:水=5:10:1.5:1（v/v/v/v）混合試劑作為展開劑成功分離出GlcN，Le 等[15]以正丁醇:乙酸:水=2:1:1（v/v/v）混合試劑作為展開劑在硅膠板上成功分離出DP 為1～6 的COS。除此之外，已被報道用于分離COS 的展開劑還有正丁醇:甲醇:25%氨水:水=5:4:2:1（v/v/v）[56]、正丙醇:水:28%氨水=70:15:15（v/v/v）[73]和正丁醇:水:乙酸:氨=10:5:5:1（v/v/v/v）等[74]。相較于TLC 法，HPLC 法可以結合質譜法基于DP 和DA 進行精確分析。由于含有乙酰氨基，GlcNAc 在204 nm 處有最大紫外吸收。因此，配備紫外檢測器的HPLC 只能檢測到部分乙酰化或完全乙酰化的COS。除了紫外檢測器外，也可以配備示差折光檢測器對COS 進行分析。嚴佳佳等[75]利用色譜柱SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離純化到了酶解產物中的GlcN 和GlcNAc，Li 等[63]利用色譜柱Sugar Pak I（6.5×300 mm）對酶解產物中的GlcNAc 和（GlcNAc）2進行分離純化。此外，Aminex HPX-87H（300×7.8 mm）[23]、Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6×250 mm）[68]和Shodex Asahipak NH2P-50E（4.6×250 mm）[7]等色譜柱均被用于COS 的分離純化。

2.3 其他分離純化方法

活性炭因結構疏松多孔、表面積大而具有較強的吸附性，同時由于成本較低而被廣泛應用。Yu等[76]通過間歇模式實驗，探究了活性炭對COS 吸附效率的影響因素。結果表明，活性炭顆粒越小對COS 的吸附能力越強，pH 為8～9 時吸附量最大，在接觸時間小于60 min 時隨著接觸時間的延長吸附量增大，而后達到吸附平衡狀態，溫度對活性炭吸附COS 的能力無顯著影響。毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）法也用于分離純化COS，僅需要少量的溶質和溶劑，分離時間短，分辨率高。然而，復雜的衍生化過程以及昂貴材料的使用使得該法經濟成本較高[77]。此外，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術是分析生物分子，如脂類、糖類、多肽和其他有機大分子的最合適的技術。但是，該方法不適合檢測分子量低于500 Da 的樣品[78]。

3 殼寡糖的應用

3.1 殼寡糖在食品加工貯藏領域的應用

COS 具有廣泛的抗菌活性，可以抑制多種致病菌和腐敗微生物的生長[79-80]，因而已被用于食品防腐和果蔬保鮮。在釀酒過程中加入500 mg/L 的COS（平均分子量＜2000 Da，DP 2～10）可以抑制腐敗微生物的生長，但是對釀酒酵母的生長無影響[81]。向生牛乳中添加0.24% COS 并置于4 ℃下保存12 d，與未添加COS 的對照組相比，其嗜熱菌和嗜冷菌至少降低3 個數量級[82]。在面包中加入1%的COS，面包中食源性病原菌及根霉菌的生長均受到抑制[83]。COS 還具有良好的成膜特性，以濃度為1.5 g/100 mL的COS（分子量700 Da 左右）溶液對鮮切蘋果進行涂膜處理，菌落總數、霉菌、酵母菌和大腸菌群數明顯低于對照組。COS 涂膜處理還能調控抑制鮮切蘋果呼吸強度的增強，保持可溶性固形物和可滴定酸含量的穩定，防止失重率增加，減緩軟化[84]。

COS 具有抗氧化活性，可以改善食品品質，延長食品的貨架期。向低筋小麥粉中加入1%的COS后，不僅能夠改善餅干制品的組織結構，使酥性餅干斷面結構氣孔細密均勻，同時降低餅干的硬度和咀嚼性，提高餅干的酥松度，改善口感滋味。與此同時，COS 的加入使得餅干樣品的酸價、過氧化值和TBA 值降低，有效延緩了儲藏期餅干的氧化酸敗，延長了酥性餅干的保質期[85]。以4 mg/mL 的COS 溶液（DP 2～4）對湘派休閑豆干進行涂膜處理，能夠有效延緩樣品在常溫貯藏過程中微生物的生長繁殖及品質劣變，使樣品貨架期延長20 d 以上[86]。此外，COS 對食物在預處理過程中引起的多不飽和脂肪酸氧化有抑制作用，進而延長食物的貨架期[87]。

COS 可以改善貯藏過程中果皮活性氧的代謝情況，進而降低果皮褐變發病率。劉麗丹等[88]用0.5%的COS 溶液浸泡枇杷果實，使果實在冷藏期間保持較高的可溶性固形物、還原型抗壞血酸及還原糖含量，同時多酚氧化酶活性受到一定抑制，枇杷果實失重率、褐變指數和腐爛指數均明顯降低。趙韓棟等[89]用0.5%的COS（平均分子量1500～2000 Da，脫乙酰度95%）水溶液對皇冠梨進行貯前浸泡處理，在低溫貯藏過程中，果皮中多酚氧化酶、脂氧合酶活性的上升，過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性維持在較高水平，果皮中總酚、抗壞血酸維持在較高水平，過氧化氫和丙二醛的積累減少，果實褐變發病率和發病指數分別下降了89%和32%。段樹華等[90]用濃度為1%的COS 溶液浸泡處理甜櫻桃，使得低溫貯藏過程中果實的可滴定酸、維生素C、總酚的含量下降，多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性升高，丙二醛含量降低，膜脂質過氧化水平降低，有效防止了甜櫻桃果實在貯藏期的的衰老褐變，保持了果實的風味品質。

COS 具有良好的吸濕性、持水性和熱穩定性，并且能夠防止淀粉老化。制作海綿蛋糕時，向低筋小麥粉中加入1wt%的COS（分子質量＜3000 Da）有助于增加面糊的黏彈性以及降低面糊密度，可使蛋糕成品表面色澤均勻、組織細膩、有彈性、氣孔均勻、滋味與口感良好[91]。制作擠壓面粉制品時，向小麥粉中加入3.2wt%的COS（純度＞80%）可顯著增強面團的面筋蛋白網絡，減緩淀粉的降解過程，面制品的含水率、膨脹率及吸油率增加，硬度降低，品質得到提升[92]。

3.2 殼寡糖在醫療保健領域的應用

COS 具有多種生物活性，被腸上皮細胞吸收后可以到達身體的各個部位，進而發揮其生理功能[93]。王勝田等[94]研制了一種含COS、銀杏葉提取物、丹參提取物及淀粉的COS 膠囊，具有輔助降血脂作用，并且對化學性肝損傷有輔助保護功能。郝桂娟等[95]研究發現，COS-Zn2+配合物對氧化衰老模型小鼠的機體臟器恢復有一定的幫助作用，能夠顯著提高機體血清、腎臟和肝臟中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性和總抗氧化能力，展現了較好的抗衰老及增強機體免疫功能作用。蘇政權等[96]研制了一種COS 腸溶膠囊，內容物包括腸溶輔料、殼寡糖和釋放調節劑，三者的質量比為（3～5）:1:1。在COS 的干預下，小鼠腸道菌群能減少高脂高糖飲食中膳食脂肪的攝入，從而實現抗肥胖的效果；血糖水平也顯著降低，即該COS 腸溶膠囊表現出良好的輔助調節血糖作用。COS（分子量約為2000 Da）可以打開小腸微絨毛上皮細胞間的緊密連接，從而提高腸道的通透性。基于此，COS 可作為BCSⅢ類藥物的口服吸收促進劑[97]。

COS 已被批準為“新食品原料”[98]，因此，諸多含有COS 成分的功能性食品已被開發，以期使得飲食干預成為治療某些疾病的有效手段。莊林等[99]研究發現以COS、海洋魚低聚肽、櫻桃粉、茯苓粉為主要成分的復合固體飲料能夠通過調節小鼠腸道菌群組成和短鏈脂肪酸水平改善高尿酸血癥。姜雅杰等[100]研究了含有COS、白蕓豆提取物、水蘇糖、葡聚糖及亞麻籽油的復合固體飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群結構的影響，結果表明該復合固體飲料可以促進腸道內有益菌的生長與定植，降低條件致病菌的相對豐度，在提高腸道免疫力同時具有輔助治療Ⅱ型糖尿病的功效。喻凱[101]研發了一種能夠增強腸胃功能及免疫力的幾丁寡糖食品，其配方主要包含幾丁寡糖、膳食纖維及益生菌類。王孝文等[102]開發了一種以COS、滸苔多糖、藥用淀粉、硬脂酸鎂為主要原料的保健食品，該產品有益于提高機體免疫力，增強免疫功能。總之，COS 呈現出的多元化功能使其在保健品的開發中具有很高的應用價值。

3.3 殼寡糖在農業領域的應用

在農田中施加一定量的COS 不僅可以起到抗病毒、抑菌的功效，還能在一定程度上調節植物的生長發育。在抗煙草花葉病毒的研究中發現，COS 可以提高葉片中多種防御酶的活性，不僅可以有效減少煙葉感染煙草花葉病毒的枯斑數，也可以降低已染病毒煙草中葉綠素的下降幅度[103]。高雨萌[104]等探究了COS（平均分子量3000 Da，脫乙酰度為90%）對花椒干腐病的防治效果，發現濃度為0.5 mg/mL 的COS 溶液對花椒盆栽苗干腐病的防治效果可達到65.02%。COS 在低溫下可以使水稻的相對電導率顯著降低，降低丙二醛對水稻的危害，進而減少低溫對水稻幼苗的傷害。COS 也可以提高幼苗的抗旱能力，對提高作物的耐鹽能力有一定的效果[105]。金國強等[106]分別用分子量為1500 和2500 Da 的COS溶液對宮川溫州蜜柑進行1000 倍樹冠葉面噴霧處理后，果實中可溶性固形物含量升高，可滴定酸濃度降低，果實的品質得到了改善。黃雪燕等[107]分別用分子量為1000 和2000 Da 的COS 溶液對溫嶺高橙進行200、500 和1000 倍的葉片噴霧和根部澆灌處理，收獲的單果質量均高于對照組。此外，COS 在防治果蔬的采后病害[108]、誘導植物先天免疫[109]、增強植物生理反應[110]等方面的應用也被廣泛報道。

4 結論

CI 在自然界中含量豐富，生物相容性好，無毒性作用，降解后獲得的COS 分子量低，溶解度高，具有多種生物活性。迄今為止，盡管關于COS 的制備、純化和應用研究已取得了巨大進展，但是仍存在一定的不足。對于如何綠色、大規模地獲取高純度的COS 仍是當下面臨的主要挑戰。傳統化學法較易于實現工業化生產，但是由于反應過程不可控制而無法保持產物品質的穩定性，進而限制了其在下游特定領域的應用。此外，反應過程中使用的化學試劑對環境有害。酶法反應過程溫和，反應過程可控，尤其是采用基因工程技術對酶進行改造以及采用協同催化體系（如多酶聯合法或化學-酶法等）后，CI 的降解效率顯著提高。因此，優質酶種的挖掘、制備工藝的優化仍是未來努力的方向。物理法和電化學法的出現也為COS 的制備提供了新的技術路徑，值得進一步探索。在COS 的高效制備過程中，可能存在目標產物純度低、雜質過多等問題，因此如何選擇合適的分離純化方法、并以較低的經濟成本建立大規模的純化體系仍需繼續深入研究。此外，COS 在食品加工貯藏領域、醫療保健領域和農業領域的應用已被廣泛報道，但是對于COS 生物活性背后的作用機制仍不明確。因此，對于COS 的構效關系仍需不斷探索，這對于實現其在食品及其他領域的應用具有重要意義。

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