微生物合成2′-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖的代謝工程策略研究進展

李鄧斌，魏 超，張 媛，張根林,*，王小艷,*

（1.石河子大學化學化工學院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，新疆石河子 832003；2.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；3.營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是一種復合低聚糖，在母乳中以游離形式存在，是母乳中第三大固體成分，具有顯著的生物活性，能夠有效地提升母乳的營養價值[1]。HMOs 被證實具有獨特的健康益處，如減少病原體黏附，調節上皮細胞和免疫反應，降低壞死性小腸結腸炎的風險，促進大腦發育和認知等功能[2]。在整個哺乳期，HMOs 的濃度不同[3]。研究表明，HMOs 在初乳中的濃度最高（平均9～22 g/L），其次是過渡乳（平均8～19 g/L），隨著哺乳的進行，成熟乳中的HMOs 濃度逐漸下降，從出生一個月內采集的母乳中的6～15 g/L 下降到6 個月后的4～6 g/L[4]。HMOs 還可以保護母乳喂養的嬰兒免受微生物感染，喂食配方奶粉（添加特定HMOs）的嬰兒表現出一種與純母乳喂養嬰兒更接近的炎性細胞因子模式[5]。因此，在商業嬰兒配方奶粉中的補充適量的HMOs 對于模仿真正的母乳具有重要意義[6]。

HMOs 是由3～6 個糖基組成的化合物，其中包括N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，Glc-NAc）、唾液酸（sialicacid，Sia）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，Fuc）以及N-乙酰神經氨酸（CMP-N-acetylneuraminicacid，Neu5Ac）。這五種單糖通過多種結合方式相互組合，形成了超過200 種不同的結構[7]。HMOs 按照修飾基團的不同可分為 3 類，包括被巖藻糖基修飾的中性HMOs，如2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose,3-FL）和二巖藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）等，占比35%～50%（圖1）；酸性 HMOs，如3′-唾液酸乳糖（3′-Sialyllactose，3′-SL）和6′-唾液酸基乳糖（6′-Sialyllactose，6′-SL），占比12%～14%；以及非巖藻糖基化的中性HMOs，如乳糖-N-四糖（Lacto-N-tetraose，LNT）和乳糖-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose，LNnT），占比42%～55%[8-10]。

圖1 巖藻糖基乳糖（FL）的結構組成Fig.1 Structural composition of fucosyllactose (FL)

鑒于人們愈發認識到HMOs 在嬰幼兒健康與生長發育中的關鍵作用，全球范圍內對合成人乳寡糖及其活性類似物作為嬰幼兒配方奶粉添加劑的研究與商業關注日益濃厚。2′-FL 和3-FL 是HMOs 中最豐富的巖藻糖基化寡糖，它們對嬰幼兒的生長發育有益。近年來，通過微生物法、酶法和化學合成法生產2′-FL、3-FL 已取得重大技術突破，這給嬰兒營養食品行業帶來了革命性的變化。美國食品藥品管理局、歐盟委員會、澳大利亞和新西蘭食品標準局等已經批準在嬰兒配方食品中添加2′-FL。2021 年12 月，歐盟和美國已經分別批準了3-FL 等六種母乳寡糖作為新食品原料。2022 年4 月15 日，中國國家食品安全風險評估中心對2′-FL 公開征求意見。相信，不久之后在中國2′-FL 在食品中添加的法規會有新的進展。

本文總結2′-FL 和3-FL 的制備方法，系統闡述微生物法合成2′-FL 和3-FL 的工程化策略，為后續2′-FL 和3-FL 的微生物生產提供一定的研究思路。

1 2′-FL 和3-FL 的合成方法

2′-FL 是HMOs 的重要組成部分，具有廣泛的應用價值。而3-FL 與2′-FL 的合成方法相似，因此，它們的合成研究可以相互借鑒。研究者們用化學法、酶法和微生物細胞工廠法廣泛地研究了2′-FL 和3-FL 的合成[11]，這幾種方法的優缺點具體見表1。

表1 2′-FL 和3-FL 的合成方法Table 1 Synthesis methods of 2′-FL and 3-FL

1.1 化學法合成2′-FL 和3-FL

化學合成法使用乳糖和L-巖藻糖作為原料，分別通過2、3 步反應合成乳糖受體和巖藻糖基供體。然后，將這兩種物質混合，通過3 步反應得到2′-FL 混合物。最后，通過脫鹽、脫色和提純等工藝，可以得到純度更高的2′-FL[12]。

雖然化學合成法在生產效率和產品純度上都表現出色，但是它的生產流程繁復，反應條件苛刻，產物收率偏低，L-巖藻糖價格不菲，并且經常需要使用有毒有害的試劑，這些都限制了它的廣泛應用。

1.2 酶法合成2′-FL 和3-FL

酶合成法2′-FL 和3-FL 是利用多種酶催化底物、供體以及輔助因子轉化為目標化合物的特異性反應[13]。雖然酶合成法具有反應條件溫和、反應成分相對簡單以及易于純化等優點，但酶法存在底物成本高以及產物的得率不高等問題，目前尚處于實驗室規模。

1.2.1 巖藻糖基轉移酶合成2′-FL 和3-FL 巖藻糖基轉移酶（EC2.4.1.-）是糖基轉移酶家族，廣泛用于復雜糖鏈表位的糖基化，參與多種生理過程，包括細胞識別、細胞黏附、免疫反應和癌癥轉移等。到目前為止，已經分離、鑒定了不同類型的巖藻糖基轉移酶，并將其應用于制備高附加值的α-巖藻糖基化產物[15]。根據巖藻糖苷的區域特異性和受體類型，巖藻糖基轉移酶可劃分為五大類：α-1,2，α-1,3，α-1,4，α-1,6 和O-巖藻糖基轉移酶[16]。其中，α-1,2-巖藻糖基轉移酶能夠將GDP-L-巖藻糖從供體傳遞到受體乳糖端，從而產生2′-FL[17]。α-1,3-巖藻糖基轉移酶能夠以GDPL-巖藻糖和乳糖為底物，生成3-FL。不同來源的巖藻糖基轉移酶在酶學和理化性質等方面存在差異，常見的巖藻糖基轉移酶如表2 所示。從表2 中可看到，目前巖藻糖基轉移酶的生物來源較為廣泛，其中幽門螺旋桿菌來源的最多。

表2 巖藻糖基轉移酶的各種形式Table 2 Various forms of fucosyltransferase

1.2.2α-L-巖藻糖苷酶合成2′-FL 和3-FLα-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）是一類外切糖苷水解酶，能夠選擇性地水解或轉移相應碳水化合物或糖結合物的非還原α-L-巖藻糖基殘基[26]。采用α-L-巖藻糖苷酶合成2′-FL 的技術[27]，通常以4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷為糖基供體，該酶具有高度的特異性，作用于巖藻糖基化合物的巖藻糖基團，水解得到的巖藻糖分子與乳糖經進一步反應獲得2′-FL。

1.3 微生物法合成2′-FL 和3-FL

微生物合成法FL 有兩種合成途徑。一種是從頭合成途徑（De novo pathway），以甘油、葡萄糖或蔗糖作為合成起始底物，在磷酸甘露糖變位酶（ManB）、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉移酶（ManC）、GDPD-甘露糖-4,6-脫水酶（Gmd）和GDP-L-巖藻糖合成酶（WcaG）的參與下合成GDP-L-巖藻糖，GDP-L-巖藻糖和乳糖在巖藻糖基轉移酶作用下生成2′-FL 和3-FL[28]。另一種是補救途徑（salvage pathway），以L-巖藻糖為起始底物，通過雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶（fucosepyrophosphorylase，FKP）合成GDP-L-巖藻糖，再經過巖藻糖基轉移酶的作用生成2′-FL 和3-FL[29]。

相比于化學法和酶法，微生物具有更快的增殖速度，更容易擴大培養，而且能夠使用低成本碳源。因此，微生物法已經成為2′-FL、3-FL 及其他HMOs綠色合成的首選方式[30]。表3 列出不同的微生物細胞工廠生產2′-FL 和3-FL 的研究進展。從表3 中可看到，近幾年，通過細胞工廠生產2′-FL 和3-FL 的產量得到大幅度提升，其中2′-FL 的產量已經達到了112.56 g/L，具有良好的工業應用前景。

表3 微生物法合成2′-FL 和3-FL 的研究進展Table 3 Research progress for microbial synthesis of 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose

2 大腸桿菌生物合成2′-FL 和3-FL 的代謝工程化策略

隨著代謝工程的不斷發展，人們可以通過構建和調控微生物宿主中的代謝途徑，從而產生更多高附加值的產品，為社會發展帶來更多的價值。因此，可通過多種策略，如底盤宿主選擇、代謝途徑構建、途徑酶的表達與優化、競爭代謝途徑的敲除、輔因子的循環再生、碳源和養分的利用、代謝產物的轉運等方式來提升目標產物產量[36-37]。

通過合成生物學和代謝工程技術，已經有五種底盤細胞被用于2′-FL 和3-FL 的生物合成，它們分別是大腸桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌。其中釀酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌在微生物學中一般被認為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）[38]。雖然GRAS 微生物宿主具備生產安全性的優點，但它們的生產效率往往不及大腸桿菌，這是因為大腸桿菌的生長周期短、菌株構建簡單、成本低廉，使得大腸桿菌生產效率更高。圖2 為大腸桿菌中合成2′-FL 和3-FL 的工程途徑。

圖2 在大腸桿菌中2′-FL 和3-FL 的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathways of 2′-FL and 3-FL in E.coli

2.1 模塊化代謝工程策略

微生物代謝工廠合成目標化合物時，常常需要共同表達多個關鍵酶。由于中間產物的大量積聚，會給上游酶帶來反饋性的抑制，從而加劇細胞的代謝負擔，阻礙微生物的生長，進而影響最終產品的合成[39]。采用模塊化代謝工程策略，將合成途徑劃分為多個模塊，對每個模塊進行精細的調控，可以有效地解決代謝流平衡問題[28]。

Li 等[20]利用組合模塊化策略，將2′-FL 合成途徑分為GDP-L-巖藻糖合成模塊、乳糖巖藻糖基化模塊，通過不同拷貝數的組合優化，在轉錄水平上微調基因表達水平，將代謝流合理引向2′-FL 代謝途徑，獲得了14.1 g/L 的2′-FL。Li 等[40]將2′-FL 分為GDPL-巖藻糖合成模塊、乳糖巖藻糖基化模塊、輔因子再生模塊，通過不同的質粒組合來平衡合成途徑，獲得了22.3 g/L 的2′-FL。Chen 等[24]將3-FL 代謝通路的關鍵酶分為兩個代謝模塊，以質粒拷貝數的變化調節內源酶（ManB、ManC、Gmd 和WcaG）和異源酶（FutM2）的基因表達強度，獲得了20.3 g/L 的3-FL。模塊化代謝工程策略表明將代謝通路按照不同的功能、分支等因素分為不同的代謝模塊，就代謝通路而言，每個模塊又相互作用，從而實現代謝途徑的調控，以此實現細胞內的代謝平衡，2′-FL 和3-FL 產量也會隨之提高。

2.2 巖藻糖基轉移酶篩選與優化策略

巖藻糖基轉移酶能夠以GDP-L-巖藻糖和乳糖為底物合成2′-FL 和3-FL，是2′-FL 和3-FL 合成的關鍵限制因素之一。但是巖藻糖基轉移酶存在異源表達量低、催化活性差等缺陷，阻礙了2′-FL 和3-FL 的合成。

2.2.1 異源表達量的篩選與優化 來源于微生物的α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶的活性僅為一般代謝酶活性的1%，且α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶的溶解性較差。因此，篩選高活性的α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶，提高α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶的溶解度，是合成2′-FL 和3-FL 過程中的重要手段。Huang 等[19]針對酶源進行了挖掘與篩選分析，比較了各種外源α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶候選菌株，發現幽門螺桿菌來源的FutC 和FutA 產生的2′-FL 和3-FL 產量最高。據報道，大多數已鑒定的α-1,2-巖藻糖基轉移酶很難在大腸桿菌中功能表達，導致形成包涵體。與某些標簽融合表達可顯著提高其可溶性表達，如SUMOstar[41]、TrxA[42]、pelB[28]等。此外，Lee 等[43]發現降低啟動子強度可能會提高α-1,2-巖藻糖基轉移酶在大腸桿菌中的溶解度，用Trc 啟動子替換T7 啟動子后，α-1,2-巖藻糖基轉移酶在菌株中的表達顯著提高了2′-FL 產量和產量。Li 等[28]設計了多水平的組合策略（包括RBS、融合肽和多拷貝基因篩選）來改善巖藻糖基轉移酶應用的技術瓶頸，其中中等表達強度的RBS（BBa_B0034）更適合α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶的翻譯水平和蛋白表達，mRNA 水平分別是對照組的3.48 倍和4.54 倍。這表明，可以通過篩選異源表達量高的巖藻糖基轉移酶、探索更多的融合標簽、篩選適當強度的表達元件等方式來提高宿主體內巖藻糖基轉移酶的表達量。

2.2.2 催化活性的篩選與優化 大部分α-1,2-巖藻糖基轉移酶會催化產生副產物DFL 以及3-FL[44]。為獲得其他高活力的α-1,2-巖藻糖基轉移酶，Zhu等[22]從Helicobactersp.11S02629-2 中篩選出一種新的具有活性的α-1,2 巖藻糖基轉移酶（BKHT），不產生副產物DFL 和3-FL。獲得了94.7 g/L 的2′-FL，乳糖產量0.98 mol/mol，產糖量1.14 g/L/h。此外，Chen 等[23]從Azospirillum lipoferum篩選出一種新的具有活性的α-1,2 巖藻糖基轉移酶（SAMT），將其插入到工程菌的染色體中，基于SAMT 的菌株只產生2′-FL，沒有其他副產物，獲得112.56 g/L 的2′-FL，乳糖產量0.98 mol/mol，產糖量1.10 g/L/h，具有較強的工業化生產潛力。這表明，通過篩選新的巖藻糖基轉移酶，催化時減少或不產生副產物的生成，能夠明顯提高目的產物的產量。

2.2.3 其他方面的篩選與優化 在對巖藻糖基轉移酶的分子改造報道中，通過系統的截斷和延伸，α-1,3-巖藻糖基轉移酶的C 端工程導致3-FL 合成增加了10～20 倍[25]。Liu 等[45]為了提高α-1,2-巖藻糖基轉移酶的底物選擇性和底物耐受性，采用了計算機輔助設計和篩選與生化實驗相結合的半理性操作，突變體的催化效率比野生型提高了100 倍。Park 等[46]通過對保守氨基酸序列的家族多序列分析和蛋白質-配體底物對接分析，找到4 個突變位點（F40S/Q150H/C151R/Q239S），這些突變位點可以提高FutC 的溶解性和活性，并且四個組合突變使2′-FL 產量提高了2.4 倍。

2.3 中間體GDP-L-巖藻糖的積累策略

GDP-L-巖藻糖是代謝工程生產2′-FL 和3-FL的巖藻糖基供體。GDP-L-巖藻糖的從頭合成和補救合成已分別或聯合用于2′-FL 和3-FL 的生產。

在從頭合成途徑中，可以調控合成GDP-L-巖藻糖的相關基因表達來增加FL 的產量，如manB、manC、gmd、wcaG、rcsA以及rcsB[19]。另外一種是敲除參與 GDP-L-巖藻糖代謝的相關基因，如參與克拉酸合成的基因wcaJ，抑制 GDP-L-巖藻糖進一步合成克拉酸[20]。RcsA 和RcsB 作為調節因子，對溫度變化非常敏感，它的降解受到ATP 的影響，因此，當ATP 的濃度下降時，RcsA 和RcsB 的活性會受到影響，從而導致GDP-L-巖藻糖的供應量減少[19]。此外，還需要考慮前體GDP-甘露糖代謝競爭途徑的相關酶GDP-甘露糖甘露醇水解酶（NudD）和GDP-甘露糖水解酶（NudK）。在Ni 等[47]的研究中，與對照菌株相比，缺失nudD可以提高工程菌中2′-FL 的產量；然而，nudK的缺失并沒有表現出積極的效果，甚至減少了2′-FL 的產量。而在Li 等[28]的研究中，nudD和nudK的缺失都能夠提高工程菌中2′-FL 的產量。

在補救合成途徑中，Wan 等[48]敲除以L-巖藻糖為直接底物的兩種酶—L-巖藻糖異構酶（FucK）和L-巖藻糖激酶（FucI）的酶基因，以提高2′-FL 生物合成前體的利用率，最終菌株的補料分批發酵產胞外2′-FL 為30.5 g/L，產糖量為0.661 mol/mol 巖藻糖，產率為0.48 g/L/h。此外，L-鼠李糖異構酶（RhaA）和D-阿拉伯糖異構酶（AraA）參與催化L-巖藻糖的異構化，工程菌中araA和rhaA基因的雙敲除使2′-FL 的產糖量由0.36 mol/mol 巖藻糖提高到0.52 mol/mol 巖藻糖，從而使2′-FL 的濃度由23.1 g/L 達到47.0 g/L[49]。因此敲除araA、rhaA也是提高GDPL-巖藻糖產量的有效策略。

2.4 底物乳糖的攝取與利用策略

乳糖作為生產2′-FL 和3-FL 的巖藻糖受體底物，需確保細胞內具備充足數量以滿足2′-FL 和3-FL 的合成需求。相關研究表明，乳糖可以在β-半乳糖苷酶（LacZ）的作用下被水解成葡萄糖和半乳糖。由于乳糖的2′-FL 和3-FL 產量（分別為0.026 mol/mol和0.046 mol/mol）明顯低于理論產量（1 mol/mol），大部分乳糖顯然被用于細胞生長，而不是2′-FL 和3-FL 的生產[19]。

Chin 等[50]通過敲除底盤細胞中編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ，發現細胞生長受到的影響幾乎可以忽略不計，而且這種方法可以有效地提高乳糖在目標產物合成中的利用率，從而將代謝流引向目標代謝產物，進而提升2′-FL 和3-FL 的產量。此外，β-半乳糖苷透性酶（LacY）是一種跨膜蛋白，負責乳糖的跨細胞膜運輸[28]?？梢酝ㄟ^過表達或增加基因拷貝數等方式來增強LacY 的表達，提高乳糖在細胞內的利用率，從而促進2′-FL 和3-FL 的生物合成[20]。乳糖抑制因子（LacI）的缺失能夠解除LacY 的抑制。因此，敲除LacI后，LacY 將更多的乳糖運輸到細胞內，用于2′-FL 的合成[42]。

2.5 輔因子循環體系構建策略

在微生物細胞生產2′-FL 和3-FL 中，存在兩種關鍵輔因子，一種是鳥苷-5′-三磷酸（GTP），作為生物合成GDP-L-巖藻糖的關鍵輔因子，它既是GDP 的供體，也是能源物質；另一種是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），它可以參與多種代謝反應，包括磷酸戊糖途徑（PPP 途徑）、三羧酸循環途徑（TCA 循環）以及脫氫酶系統，為生物體提供氫原子，促進生物體的生長發育。

兩種從頭合成途徑的酶（ManC、WcaG）都需要GTP 和NADPH 的參與，而補救途徑的酶（FKP）也需要GTP 的參與才能正常催化。Huang 等[19]選擇8 個NADPH 再生的相關基因進行優化，構建了22 株單基因或聯合表達這些基因的菌株。結果顯示大多數工程菌對FL 的產量都有促進作用，其中分別導入編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（zwf）和嘧啶核苷酸轉氫酶（pntAB）的效果最好。在另一項研究中，Li等[40]選擇了9 個與GTP 和NADPH 再生相關的基因進行表達，其中共表達zwf 和肌苷鳥苷激酶（gsK）的工程菌對2′-FL 的產量有最大的促進作用。

2.6 自組裝途徑酶的空間組織策略

自組裝途徑酶的空間組織策略作為一種有效的合成生物學和蛋白質工程策略，通過構建具有明確結構的多酶復合體，可以建立底物通道，促進活性殘基之間的中間轉移，控制代謝流量，減少中間擴散，從而提高產物產率[51]。Wan 等[48]將一對來自cAMP 依賴蛋白激酶（PKA）的RIDD 和來自A 激酶錨定蛋白（AKAPs）的RIAD 多肽引入2′-FL 補救合成途徑中的兩個關鍵酶FutC 和FKP，構建了一個控制代謝通量的自組裝復合體，在工程大腸桿菌中實現了體內高效的2′-FL 生物合成。此外，該課題組將短肽相互作用對Riad-RIDD 引入2′-FL 從頭合成途徑自組裝成酶復合體，并引入另一個正交的蛋白質相互作用基序（Spycatcher-SpyTag 或PDZ-PDZlig）進一步聚集成多酶組件。胞內多酶組合顯著增加了通向2′-FL 生物合成的通量，與表達自由漂浮酶和未組裝酶的菌株相比，2′-FL 產量增加了2.1 倍[52]。這表明，通過構建多酶復合體，能夠控制代謝流量，增加了通向2′-FL 和3-FL 生物合成的通量。

2.7 敲除競爭代謝途徑策略

根據代謝通量分析，關鍵中間體果糖-6-磷酸（Fru-6-P）、GDP-D-甘露糖、GDP-L-巖藻糖以及乳糖的分枝代謝可能阻礙2′-FL 和3-FL 的生物合成和積累。為了最大限度地增加流向FL 合成途徑的碳流，Li 等[28]通過CRISPR/Cas9 系統分別敲除由ATP 依賴的磷酸果糖激酶（由pfkA和pfkB編碼）的Fru-6-P 到Fru-1,6-P 分支途徑、由果糖-6-磷酸縮醛酶（由fsaA和fsaB編碼）的Fru-6-P 到甘油醛-3-P 分支途徑以及由甘露醇-1-磷酸脫氫酶（由mtlD編碼）的Fru-6-P 轉化為甘露醇-1-P，與未敲除的菌株相比，2′-FL 和3-FL 的產量得到了明顯提升。

大腸桿菌在發酵過程中會產生乙酸酯以及糖酵解副產物，這不僅對細胞生長有毒性，而且與2′-FL 合成競爭碳源，降低2′-FL 的產量，同時也不利于后續的分離純化。Liao 等[53]通過敲除arcA（厭氧氧化還原控制因子）和iclR（編碼乙醛酸操縱子阻遏蛋白）來調節乙酸代謝，arcA突變體顯著減少了乙酸的積累。然而，iclR的敲除和雙敲除突變體對2′-FL 的生物合成毫無益處。一方面，iclR突變體的最大DCW 增加了6.2%，這可能影響了細胞的生理和代謝；另一方面，iclR的缺失可能會促進細胞的生長，而不是促進2′-FL 的生物合成，但其分子機制尚不完全清楚。另有一項研究表明，糖酵解副產物的積累不僅對細胞生長有害，而且與乳糖和GDP-L 巖藻糖的合成競爭碳源[54]。在這項研究中，通過敲除調節參與副產物途徑的四種基因，包括用于將乙酰輔酶A 轉化為乙酸酯的泛醌依賴的丙酮酸脫氫酶（PoxB）和乙酸激酶-磷酸乙酰轉移酶（ackA-pta）、用于將丙酮酸轉化為甲酸鹽的丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）以及用于將丙酮酸轉化為乳酸的D-乳酸脫氫酶（LdhA），進一步實現了工程大腸桿菌中2′-FL 和3-FL 的高效生產。

2.8 菌種改良的組合策略

迄今為止，多數研究中所述的大腸桿菌中合成FL 的生物合成途徑，主要是通過在質粒上過度表達相關基因來實現的[55]。然而，基于質粒的細胞工廠在發酵過程中存在質粒丟失的問題，并且需要添加抗生素和誘導劑。因此，不含抗生素和誘導劑的生物合成途徑更具有工業應用價值。

Parschat 等[56]在大腸桿菌構建了一條蔗糖利用途徑，篩選出一個能夠將UDP-半乳糖和葡萄糖高效轉化為乳糖的β-1,4-半乳糖基轉移酶（GalTpm 1141）。然后，將途徑酶基因、蔗糖利用基因簇（cscABKR）、GalTpm1141 和UDP-半乳糖強化基因（pgi、pgm和galE）通過染色體整合到大腸桿菌中，實現了從廉價碳源蔗糖合成2′-FL 的新途徑，2′-FL 產量達到64 g/L。另外，Li 等[54]在大腸桿菌BL21（DE3）的染色體上引入了2′-FL 和3-FL 的從頭合成途徑，引入乳糖合成途徑，并對關鍵酶啟動子的替換，在無抗生素的補料分批發酵中產生40.44 g/L的2′-FL 和30.42 g/L 的3-FL。

表達載體質粒與染色體組合的方式也是一種提高FL 產量的可行策略。Liu 等[31]首先通過質粒表達系統構建2′-FL 的從頭合成途徑，隨后將額外的α-1,2-巖藻糖基轉移酶（WbgL）表達盒通過染色體整合到recA基因座上，以加強巖藻糖化反應，并使用一個強的組成型啟動子（PJ23119）來取代manC-manB和gmd-wcaG的原始啟動子，在搖瓶發酵和補料分批發酵培養中，2′-FL 產量分別達到9.06 g/L 和79.23 g/L。這表明不含抗生素和誘導劑的染色體整合策略可作為構建代謝工程菌的外源基因表達的一種綠色、安全和商業可行的生產策略。

2.9 適應性實驗室進化策略

通過非理性適應性實驗室進化，有助于構建高水平的2′-FL 和3-FL 生產工廠。Sun 等[32]對2′-FL工程菌進行了適應性實驗室進化，首先通過紫外誘變獲得3 個突變體文庫，然后轉移到24 深孔板中富集有益突變體，隨機挑取大的菌落對其生長狀況和2′-FL 產量進行測試，并通過基因組測序進行分析，獲得了一個rpoC基因突變，可提高細胞耐受性和2′-FL 的產量，最高可達61.06±1.93 g/L，生產強度為1.7 g/L/h。因此，通過非理性適應性實驗室進化，篩選有益突變體也是很重要的。

3 其他宿主合成2′-FL 和3-FL 的工程化策略

目前，2′-FL 和3-FL 的生物合成主要以大腸桿菌作為底盤宿主，但是由于大腸桿菌細胞含內毒素[57]，且易被噬菌體感染[58]，所以其作為食品的生產菌株存在一定的風險。因此食品級微生物宿主具有更大的發展前景。

3.1 工程酵母菌株生物合成2′-FL 和3-FL

近年來，一些酵母菌已被廣泛認為是生產化學品的成熟和優越的生物生產平臺，其中包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。在釀酒酵母和解脂耶氏酵母的細胞質中存在相對豐富的GDP-甘露糖[59]，這是從頭合成途徑中合成GDP-L-巖藻糖的必要前體，而且釀酒酵母和解脂耶氏酵母無法分解乳糖，這減少了FL 合成途徑中的乳糖損耗。Hollands 等[41]在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中構建了2′-FL 的從頭合成途徑，通過安裝乳糖轉運體Lac12（來源Kluyveromyces lactis）和將GDP-甘露糖轉化為GDP-巖藻糖的酶（Gmd 和WcaG），最后引入FucT2 以及分泌2′-FL 的轉運體CDT2（來源于Neurospora crassa），工程釀酒酵母和解脂酵母分別通過補料分批培養產生15 和24 g/L的2′-FL。

當釀酒酵母以葡萄糖作為碳源時，會表現出葡萄糖效應，其特征是抑制呼吸和促進乙醇的產生。因此，當葡萄糖被用作生產2′-FL 的底物時，葡萄糖的過度代謝而產生的副產物（乙醇）的積累會阻礙2′-FL 的高效生產。Lee 等[60]構建了一個利用木糖生產2′-FL 的工程酵母菌株，將編碼2′-FL 生物合成酶的異源基因整合到工程酵母染色體中，以實現基因的穩定表達，并對工程酵母中整合的外源基因的拷貝數進行了優化，得到2′-FL 產量為25.5 g/L，生產率為0.35 g/L·h。

Xu 等[21]在釀酒酵母中構建了一個生產2′-FL的微生物細胞工廠，通過促進GDP-L-巖藻糖的從頭合成，并篩選多個α-1,2-巖藻糖基轉移酶，發現表達來源于蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的α-1,2-巖藻糖基轉移酶的FutBc 所提升的2′-FL 最顯著，是常用的幽門螺桿菌α-1,2-巖藻糖基轉移酶（FutC）的1.8 倍。此外，在GDP-甘露糖轉移到GDP-L-巖藻糖的生產預計會干擾釀酒酵母正常的細胞功能，包括細胞壁的生物合成，從而影響細胞生長。為了提高釀酒酵母中FL 的產量，細胞生長和高效的GDP-L-巖藻糖生物合成之間的平衡應該得到最好的保證。該課題組通過重新連接釀酒酵母信息素反應途徑開發了一個自動誘導的基因表達系統。在交配型“a”酵母中表達了低親和力的乳酸克魯維酵母的α信息素（Kα）代替天然的釀酒酵母的α信息素（Sα）。在信息素響應型α啟動子（Pfus1）的控制下，轉錄激活子Gal4p 進一步增強了Kα誘導的途徑基因的表達，增加了GDP-L-巖藻糖的積累，進一步分批補料發酵，2′-FL 和3-FL 的產量達到32.05 g/L 和20.91 g/L[33]。同時，這也是3-FL 在食品級微生物宿主的首次報道。

3.2 工程枯草芽孢桿菌生物合成2′-FL

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種具有GRAS 性質的革蘭氏陽性菌，其生長、繁殖速度較快，且具有較高的分泌和生產重組蛋白的能力，在代謝工程和合成生物學中具有重要的工業應用價值。

Ji 等[61]在枯草芽孢桿菌中構建了2′-FL 的從頭合成途徑，通過在枯草桿菌164T7P 的基因組中構建了一條從頭途徑，從而獲得了低產量的2′-FL（120 mg/L），隨后引入外源乳糖透性酶（LacY）和阻斷乳糖降解來提高底物供應大大提高了生產效率，2′-FL 的累積產量達到31.2 g/L。Zhang 等[34]通過在枯草桿菌引入了2′-FL 的從頭合成途徑，使2′-FL 的產量達到1.12 g/L，然后通過減少競爭乳糖消耗、增加GTP 的再生和增加前體甘露糖-6-磷酸（M6P）的供應，獲得了2.57 g/L 的2′-FL 產量。隨后，通過優化碳源比例，添加20 g/L 的乳糖和80 g/L 的蔗糖時搖瓶發酵產量達到了14.29 g/L。最后用啟動子P7 取代內源manA基因的天然啟動子，搖瓶中2′-FL 產量可達18.27 g/L。最終工程菌在3-L 生物反應器中不添加抗生素和化學誘導劑，2′-FL 產量為88.3 g/L。

動態調控是微生物細胞工廠基因表達控制的有效策略。Yu 等[62]開發了一個途徑無關的可編程系統，使枯草桿菌代謝的多模塊有序控制成為可能。首先，制造了一系列溫度傳感器，并對其進行了設計，以擴大它們的閾值。在此基礎上，設計了基于不同過渡點溫度傳感器的單輸入多輸出順序控制電路。同時，結合基于CRISPRi 的非門電路，構建了抑制電路。作為概念驗證，將這些遺傳電路應用2-FL 生物合成，并將其分為3 個模塊：2′-FL 合成模塊、GTP 供給模塊、競爭途徑模塊，以此實現多模塊的有序控制，在搖瓶中的產量為1.84 g/L，是親本菌株的5.16 倍。在5-L 生物反應器中，2-FL 產量達到28.2 g/L。

3.3 工程谷氨酸棒狀桿菌生物合成2′-FL

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是一種革蘭氏陽性菌，有著優良的氨基酸生物合成和分泌能力。Seo 等[35]首次報道了在谷氨酸棒桿菌中通過從頭合成途徑生產2′-FL，隨后在此基礎引入乳糖透過酶基因lacY，并進一步對fucT2進行密碼子優化后，再以葡萄糖為碳源分批補料培養120 h 后，發酵產物2′-FL 產量為8.1 g/L，乳糖得率為0.42 mol/mol。

4 結論與展望

在微生物法合成方面，目前研究主要集中在應用代謝工程策略合成。盡管合成生物學和代謝工程的發展促進了建造細胞工廠和進一步高效地生產2′-FL 和3-FL 的各種策略，但2′-FL 和3-FL 的生物合成還需要更系統的策略。為了構建高效生產2′-FL 和3-FL 的工程菌株，應加強供體的GDP-L-巖藻糖的供應，提高乳糖轉運和可利用性，篩選并提高巖藻糖基轉移酶的功能表達以及促進2′-FL 和3-FL 外排等。

此外，基于代謝工程的微生物法生產2′-FL 和3-FL 可能由于前體底物和輔因子的供應不平衡或細胞生長與2′-FL 和3-FL 合成之間的不平衡而產生不平衡的細胞代謝網絡。動態調控是微生物細胞工廠基因表達控制的一種策略，也是代謝工程優化的最有效策略之一。因此，通過動態調控設計的基因編碼代謝控制系統，能夠促進宿主根據內部和外部代謝狀態自主平衡代謝通量，以最大限度地提高宿主生產力和產量。

未來，更多的生物工程技術，包括蛋白質工程、代謝工程、發酵工程將被應用到2′-FL 和3-FL 合成的研究中，不僅可以進一步提高生產率，降低生產成本，而且可以建立一些通用的策略，指導其他HMOs的大規模生產。

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