孔雀石綠對稀有鮈鯽的胚胎發育毒性研究

接收日期：2023-04-18

基金項目：

貴州省科技計劃項目（黔科合支撐[2023]一般107；黔科合支撐[2020]1Y099）

*通訊作者：

黃福江（1987—），男，博士，助理研究員，主要從事魚類資源與環境研究，E-mail：hfjnyjy@163.com.

摘" 要：

本研究以稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）為實驗對象，探究不同濃度孔雀石綠對稀有鮈鯽胚胎的致畸性和毒性效應。在稀有鮈鯽通過干法人工授精發育4.5 hpf，通過設置1個空白對照組及5個濃度組（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/L），采用水體浸泡暴露的實驗方式研究孔雀石綠對胚胎的影響。結果表明孔雀石綠會導致稀有鮈鯽自主運動頻次降低、心跳次數降低、孵化率也大大降低。高濃度（2.5、3.0 mg/L）的孔雀石綠對于稀有鮈鯽胚胎孵化有較高致死效應，低濃度（1.0～2.0 mg/L）的孔雀石綠對于稀有鮈鯽胚胎孵化有顯著影響，影響稀有鮈鯽的自主運動、心跳和孵化能力，并且稀有鮈鯽在孔雀石綠的暴露下導致畸形癥狀，如尾部彎曲、心包囊水腫等。

關鍵詞：

孔雀石綠；稀有鮈鯽；胚胎毒性效應

中圖分類號：S9

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）02－0067－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.02.011

稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）屬鯉形目（Cyprinidformes）、鯉科（Cyprinidae）、鮈鯽屬（Gobiocypris），為我國特有種，野生數量不多，稀有鮈鯽在我國主要分布于四川成都平原以西，其在野外生活的壞境好，水體優。在一定程度上能夠反應當地水體的健康狀態。在我國，稀有鮈鯽作為特有的科研實驗用魚已有二十多年的發展歷史，作為我國特有的實驗用魚，稀有鮈鯽有眾多優點：如方便飼養、繁殖力強、性成熟快、產卵頻次多、溫度適應能力強、實驗重復性好、對實驗藥劑敏感、受精卵發育明顯、分化迅速。在胚胎發育期間形成黑色素量少且較晚。身體呈現透明狀態，可以在普通顯微鏡下明顯的觀察到其各個胚胎器官的發生發育情況。除此之外，稀有鮈鯽對環境污染極其敏感，是我國監測廢水的物種之一。已有試驗證實，稀有鮈鯽對重金屬、農藥等化學品非常敏感，是進行化學品毒性測試和環境水樣毒性實驗的理想材料［1-4］。

孔雀石綠又名為堿性綠，是一種合成的N-甲基二氨基三苯基甲烷類染料，易溶于水和乙醇溶液，為深綠色結晶狀固體。自20世紀30年代以來， 由于孔雀石綠低廉的成本、較顯著的治療效果等優點，廣泛用于控制水產動物真菌病、孵化過程中魚卵的消毒、魚苗魚種下塘前的消毒以及各階段活魚運輸中的消毒［5］，是藥用染料中抗菌效力較強的一類［6］。研究發現，孔雀石綠分子中與苯基相連的亞甲基和次甲基受苯環影響有較高的反應活性，可生成自由基——三苯甲基。孔雀石綠的化學官能團三苯甲烷是一種致癌物質，并能在魚體內長時間殘留，可通過食物鏈對哺乳動物和人類產生致畸［7-8］、致癌、致突變等作用［9-11］。孔雀石綠的代謝產物衍生物及初級和次級的代謝產物具有與致癌芳香胺類似的結構，這類分子進入人體后，會穿透細胞膜，到達細胞核中的 DNA，很容易產生活潑的親電子“陽氮離子”，攻擊DNA 上的親核位置，相互以共價鍵結合，從而破壞 DNA 引起癌變［12］。 除此之外，芳香胺分子的扁平部分，還會“插入”正常細胞中 DNA的螺旋線結構的相鄰基本對之間，破壞 DNA 引起癌變。孔雀石綠易溶于水，與工業廢水一起排放的大量孔雀石綠可能會潛在地危害和污染水生系統 ［13］。近年來 ，對水產魚藥殘留的檢測方法日益更新發展［14］，在一定程度上保障水產品的安全。對水產品中的孔雀石綠殘留量使用液相色譜法予以測定，國家規定不可超過0.5 μg/kg；而對于無色孔雀石綠與孔雀石綠使用高效液相色譜法予以測定不可超過2.0 μg/kg［15］。

國內外的眾多研究表明孔雀石綠對水生動物的影響，盡管孔雀石綠在水產品養殖中早已被明確禁止使用，在孔雀石綠無高效替代藥物的情況下，依舊會有冒險使用的情況發生，并且孔雀石綠在觀賞魚養殖中一直在使用。目前有關孔雀石綠的研究更多集中于檢測，對于類似產生不良影響的研究與今相隔時間較長，使用濃度的實驗在模式生物斑馬魚和稀有鮈鯽中也缺乏相關實驗。研究孔雀石綠對水生生物胚胎的毒性反應是很有必要的，用稀有鮈鯽胚胎進行研究能夠在較短時間內得到孔雀石綠的毒理效應，更好地觀察胚胎變化，了解胚胎的發育情況，從而得到孔雀石綠對于稀有鮈鯽胚胎的毒害表現，為孔雀石綠對于動物的毒害效應的研究以及對孔雀石綠替代藥品的研究有一定的促進作用，也對孔雀石綠在觀賞魚上的應用提供參考濃度。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

實驗親魚為貴州大學水產養殖專業學生長期在水產科學研究所人工飼養和繁殖的個體，從養殖群體中挑選出體質健壯、性成熟的健康親魚（雄魚體重為0.71±0.14 g，體長為33.81±0.87 mm；雌魚體重為0.84±0.49 g，體長為34.63±0.26 mm），飼養于水族箱循環養殖系統中，水中溶氧濃度大于5 mg/L。每天定時投喂飼料，水溫25±0.5 ℃，光照周期控制在12 h∶12 h（晝∶夜）。雌雄親魚以1∶2性比配對養殖，控制晝夜節律，通過人工授精獲取受精卵［16］，受精率95%以上。

1.2" 濃度設計與分組

根據預實驗結果，孔雀石綠配置濃度梯度為：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，同時設置1個空白對照組。為減少誤差及避免受精過程的不確定性，在囊胚期（4.5 hpf）選取發育正常的胚胎，開始染毒。選用 24 孔細胞培養板為染毒實驗容器，3 孔為 1 個濃度組，每孔放入 30 枚胚胎，每個濃度組設 3 個平行。將 24 孔板置于水浴鍋中，溫度控制在 25.0±0.5 ℃、光照周期 16 h∶8 h（L∶D）。實驗期間，及時剔除死亡個體，每隔24 h 換液 1 次。

1.3" 數據記錄及處理

胚胎發育至36 hpf時出現胚胎的自主運動，每個濃度隨機挑選6枚胚胎計時30 s記錄數據用以計算1 min自主運動次數；發育至48 hpf時可觀察到心跳，待胚胎發育到60 hpf后每個孔挑選5枚胚胎計時30 s記錄數據用以計算1 min心率。發育至72 hpf后觀察并記錄各個濃度每個孔的孵化條數，發育至96 hpf后在顯微鏡下觀察并拍照，并用明美顯微數碼計算每個孵化仔魚的96 hpf體長，并統計各個時期畸形率。選取稀有鮈鯽在其胚胎發育過程中不同的代表階段，如發育至12 hpf的神經胚期、24 hpf肌肉效應期、48 hpf心臟形成初期、72 hpf剛孵化的仔魚以及孵出后96 hpf的仔魚進行顯微觀測與統計。

存活率=（1-胚胎和仔魚的總死亡數/總胚胎數）×100%；

畸形率=孵出仔魚畸形數/存活仔魚數×100%；

孵化率=孵出仔魚數/總胚胎數×100%［17］。

使用Microsoft Excel 2019進行常規計算后，所有數據用SPSS20.0統計軟件分析，采用t-檢驗進行比較，描述統計值在平均值±標準誤（Mean±S.E.）來表示，顯著性水平為P＜0.05。Dunnett’s t、LSD檢驗進行相關顯著性分析。

2" 結果與分析

2.1" 稀有鮈鯽胚胎36 hpf自主運動頻率

孔雀石綠暴露后，36 hpf自主運動頻率隨孔雀石綠濃度升高呈現降低的趨勢，與空白對照組相比差異較大。對照組胚胎36 hpf自主運動頻率為10.33±7.15 次/min，實驗組與對照組相比，1.0 mg/L 36 hpf的自主運動頻率為6.50±3.02 次/min，與對照組相比自主運動頻率下降38%，差異顯著。1.5 mg/L 36 hpf自主運動頻率為3.33±1.51 次/min，與對照組相比自主運動頻率下降67%，差異顯著。2.0 mg/L 36 hpf自主運動頻率為4.83±1.72 次/min，與對照組相比自主運動頻率下降53%，差異顯著，但在此濃度下自主運動頻率較其余實驗組略高。2.5 mg/L 36 hpf自主運動頻率為2.5±2.17 次/min，與對照組相比自主運動頻率下降75%，差異極顯著；3.0 mg/L 36 hpf自主運動頻率為3.83±6.21 次/min，與對照組相比自主運動頻率下降72%，差異極顯著（表2）。

2.2" 稀有鮈鯽胚胎30 s心跳次數

暴露至60 hpf，心跳次數降低，2.0 mg/L時升高后又降低。對照組胚胎心率為39.00±2.4885 次/30 s，1.0 mg/L濃度組心跳頻率為30.28±0.59 次/30 s，1.5 mg/L濃度組心跳頻率為30.89±1.67 次/30 s，2.0 mg/L濃度組心跳頻率為32.67±4.06 次/30 s，2.5 mg/L濃度組30.00±1.86 次/30 s；3.0 mg/L濃度組29.67±1.53 次/30 s，此濃度下心跳頻率最低。與對照組相比，心率下降了22%～23%，各濃度下與對照組的心率差異極顯著。

2.3" 稀有鮈鯽胚胎72 hpf孵化率

孔雀石綠暴露至72 hpf，對照組孵化率為29.33%±2.52%，1.0 mg/L孔雀石綠濃度組26.67%±3.10%、1.5 mg/L孔雀石綠濃度組21.33%±2.85%，與對照組差異顯著（Plt;0.05），超過1.5 mg/L 后，孵化率出現大幅度降低。而2.0、2.5、3.0 mg/L孔雀石綠濃度組孵化率極低，與對照組差異極顯著（Plt;0.01）。

2.4" 稀有鮈鯽胚胎96 hpf孵化率

孔雀石綠暴露至96 hpf，對照組孵化率為42.01%±15.21%，1.0 mg/L孔雀石綠濃度組31.85%±8.32%，1.5 mg/L孔雀石綠濃度組24.32±4.25， 2.0 mg/L孔雀石綠濃度組21.35%±10.20%，與對照組差異顯著（Plt;0.05）。從2.5 mg/L濃度開始，孵化率呈現出大幅下降趨勢 ，2.5、 3.0 mg/L孔雀石綠濃度組分別為7.02%±3.32%和3.63%±3.12%與對照組差異極顯著（Plt;0.01）。

2.5" 稀有鮈鯽胚胎96 hpf體長

孔雀石綠暴露至96 hpf，對照組體長為3.96±0.16 mm，1.0 mg/L孔雀石綠濃度組3.62±0.24 mm，1.5 mg/L孔雀石綠濃度組3.6±0.15 mm， 2.0 mg/L孔雀石綠濃度組為3.51±0.11 mm，與對照組差異顯著（Plt;0.05）。2.5、3.0 mg/L孔雀石綠濃度組分別為3.42±0.03 mm和3.31±0.08 mm與對照組差異極顯著（Plt;0.01）。

2.6" 稀有鮈鯽胚胎發育過程中的畸形率

在實驗中空白對照組沒有出現畸形魚苗，而孔雀石綠暴露至96 hpf，各實驗組均有出現畸形魚苗。1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L孔雀石綠濃度組中畸形率分別為0.67%±0.58%、1.00%±1.00%、1.33%±1.53%、1.67%±1.15%、0.67%±1.15%。與對照組差異極顯著（Plt;0.05）。畸形率隨孔雀石綠濃度的升高而上升，至3.0 mg/L濃度時又呈下降趨勢。

2.7" 稀有鮈鯽發育過程形態學觀察

各實驗組經過孔雀石綠暴露染毒后，由于孔雀石綠的毒性導致的胚胎發育的畸形效應見圖1。實驗剛開始至12 h時，空白對照組和實驗組發育未見異常。染毒60 h 后，實驗組發育遲緩，未觀察到胚胎孵化雛形。72 h后，實驗組稀有鮈鯽胚胎開始孵出，剛孵出的稚魚較對照組相比，部分出現畸形，表現為心包水腫（圖1-b）、脊柱彎曲（圖1-c）、尾部彎曲（圖1-c）、軀體彎曲（圖1-d）。96 h 時，實驗組的孵出的幼魚行動能力弱，并有一定數量的死亡。

3" 討論與結論

3.1" 孔雀石綠對稀有鮈鯽胚胎發育的影響

有關孔雀石綠對東風螺受精卵發育影響的研究中，低濃度孔雀石綠（0.5 mg/L）會減緩胚胎發育速度，導致胚胎畸形，影響后續的發育過程；高濃度孔雀石綠（1.5 mg/L以上）會導致受精卵滯育，死亡率增加，難以孵出［18］。大量有關孔雀石綠的研究中均有胚胎存活率明顯下降、延遲孵化時間、畸形率和死亡率增加的結論；在長期暴露于高劑量孔雀石綠后，從卵孵化的虹鱒魚苗中觀察到脊椎、頭部、鰭和尾部異常［19］。組織病理學分析顯示，孔雀石綠導致肝竇充血和局灶性壞死，損傷線粒體，并誘發核改變［20］。在亞急性和亞致死濃度下，孔雀石綠可以抑制垂體中促性腺細胞的活性，并誘導鯰魚性腺的退化變化［21］。生化和血液學研究表明，孔雀石綠可導致血清鈣和蛋白質水平的降低；并增加鯰魚血液中的總膽固醇水平。此外，孔雀石綠影響血液學參數［22］。孔雀石綠對鱖魚內臟組織影響，可導致鱖魚肝臟充血，出現輕微腫脹癥狀，肝細胞細胞間隙增大，排列紊亂，部分肝細胞空泡化、細胞質分布不均勻以及細胞核異位、固縮［23］。線粒體為心臟提供能量［8］，心臟促進血液循環，給身體器官供血、泵血等 ［24-25］。在研究手性農藥丁氟螨酯對斑馬魚胚胎的選擇性發育毒性中推測丁氟螨酯抑制了線粒體合成［26］，從而影響血液的正常循環，最終導致斑馬魚胚胎產生心包囊水腫。動物體內的腸道微生物系統有能力將孔雀石綠轉化為無色形式。Henderson等［27］報道腸道真菌可通過代謝將孔雀石綠降解成無色孔雀石綠。而無色孔雀石綠抑制部分影響心肌細胞的發育及血液循環系統發育的相關基因（nkx2.5、Slc3 a2、ace2、tnnt2）的表達[28]。在孔雀石綠溶液中發育的稀有鮈鯽胚胎出現心包囊水腫，可能是因為孔雀石綠抑制了線粒體合成，心臟沒有足夠的能量讓血液正常循環，導致血管出現供血不足，加上無色孔雀石綠影響心肌細胞和血液循環系統發育的基因所以致使稀有鮈鯽胚胎發育出現心包囊水腫。孔雀石綠會吸附在稀有鮈鯽卵膜上，導致細胞膜上的磷脂雙分子層通透性降低，阻礙胚胎的呼吸作用，從而給胚胎發育造成輕度缺氧導致心跳加快（高度缺氧可能會導致心跳衰弱）。胚胎的正常生長發育因為細胞膜的通透性降低，對各種物質吸收能力降低，進而導致胚胎發育至后期時仔魚的孵化率降低、存活率降低、畸形率升高等不利影響，胚胎肌肉或神經系統生長發育受到損害造成稀有鮈鯽胚胎尾部以及脊椎畸形。

3.2" 孔雀石綠對胚胎發育的毒性效應

孔雀石綠在不同物種水產品的影響濃度大不相同，魚類一般可忍受孔雀石綠濃度為0.1～0.2 mg/L；胚胎和幼體比成體對藥物敏感性要高，而部分魚類對孔雀石綠比較敏感，翹嘴紅鲌稚魚的安全濃度為0.04 mg/L，致死濃度為0.1～0.2 mg/L，致死率高達100%［29］。孔雀石綠對虹鱒幼魚的安全濃度為0.01 mg/L［30］。本實驗的孔雀石綠使用濃度較養殖食用水產品安全濃度高，更接近于觀賞魚的孔雀石綠濃度。孔雀石綠在皮膚的沉積比其他組織器官多［31］，觀賞魚使用不同濃度孔雀石綠浸泡可以使體色更加亮麗。本研究實驗結果表明孔雀石綠對于稀有鮈鯽的致畸效應高于致死效應。并且隨著孔雀石綠濃度的增加，在高濃度區間，稀有鮈鯽的致死率顯著高于低濃度區。胚胎的自主運動頻率和已形成心臟的胚胎的心率，實驗組的數據顯然低于空白對照組，同時稀有鮈鯽胚胎孵化率隨孔雀石綠濃度增加而下降。這與前人的研究一致，孔雀石綠及隱色孔雀石綠對實驗動物具有急性毒性，相關研究發現孔雀石綠對水生動物的安全濃度較低，孔雀石綠進入魚體內轉化為隱色孔雀石綠，隱色孔雀石綠的親脂性，使其很容易透過水產品動物組織的間隙，在短時間內聚集形成有效血藥濃度，會損壞魚類腎、腸等器官，阻礙魚體正常排泄和解毒機能，進而魚體內藥物的消除速度減慢，藥物蓄積中毒，影響魚類的正常生長發育［32］。

3.3" 結論

在本研究中，低濃度（1.0～2.0 mg/L）的孔雀石綠對于稀有鮈鯽胚胎孵化率有顯著影響，高濃度（2.5～3.0 mg/L）的孔雀石綠對于稀有鮈鯽胚胎孵化率有極顯著影響。并且孔雀石綠對胚胎孵化率的影響有一定的劑量關系，1.0～2.0 mg/L之間的孵化率差異不顯著，2.5～3.0 mg/L之間的孵化率差異顯著，說明2.0 mg/L為閾值，濃度超過2.0 mg/L，在一定區間內孵化率差異顯著。這可能是早期胚胎有絨毛膜保護胚胎，但是高濃度的孔雀石綠通過絨毛膜，導致孔雀石綠直接污染稀有鮈鯽的胚胎，所以致死率較高。

（責任編輯：嚴秀芳）

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Embryonic Developmental Toxicity of Malachite Green to Gobiocypris rarus

Yang Ting1，Zeng Peng1，Ran Shengju1，Ma Xiuhui1，Huang Fujiang2*

（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China; 2.Institute of Guizhou Fisheries Research，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Abstract：

In this paper，Gobiocypris rarus was used as the experimental object to explore the teratogenic and toxic effects of malachite green at different concentrations on embryos of G.rarus.Whose was developed for 4.5 hpf by dry artificial insemination，and the effects of malachite green on embryos was studied by water immersion exposure by setting a blank control group and five concentration groups （1.0 mg/L，1.5 mg/L，2.0 mg/L，2.5 mg/L and 3.0 mg/L）.The results showed that the frequency of voluntary movements，the number of jumps，and the hatchability of G.rarus would be decreasing after the malachite green entered.The malachite green in high concentration of 2.5 mg/L and 3.0 mg/L has a high lethal effect on the hatching of G.rarus embryos，while that in low concentration of 1.0 mg/L and 2.0 mg/L has a significant effect on the hatching of G.rarus embryos，affecting the voluntary movement，heartbeat，and hatching ability of G.rarus.G.rarus exposed to malachite green" was results in malformation symptoms，such as tail curvature，pericardial cyst edema and so on.

Keywords：

malachite green; Gobiocypris rarus; embryotoxic effects