氣相色譜-質譜法測定飼料中的二氫吡啶

劉文秋 董寧 孫瑩瑩

摘 要：本文建立一種氣相色譜-質譜法（GC-MS）測定飼料產品中二氫砒啶含量的方法。采用避光的環境，在飼料樣品中添加保護劑降低二氫砒啶的光化學反應，采用乙腈提取待測物，經濃縮和固相微萃取凈化，采用BSTFA進行衍生，衍生物通過GCMS氣化分離以及選擇離子監測（SIM）模式進行檢測。對二氫吡啶衍生物的電子轟擊（EI）質譜碎片進行解析，特征碎片離子（m/z）206、178、251、151、150、195為定性離子，206為定量離子。該分析方法中二氫吡啶在3～150 mg/kg范圍內呈良好線性關系，樣品分析精密度RSD＜3%，樣品中二氫吡啶的檢出限0.3 mg/kg。結果表明，這項方法靈敏、穩定、可靠，有效避免了飼料中二氫吡啶在處理過程中的降解，并有效排除了主要雜質的干擾，適用于飼料產品中二氫吡啶的定量分析與確證。

關鍵詞：二氫吡啶，氣相色譜質譜，避光，衍生，飼料

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.04.035

0 前 言

二氫吡啶（diludine），化學名稱2，6-二甲基-3，5-二乙酯基-1，4-二氫吡啶，添加于飼料中作為抗氧化劑及畜禽促生長劑，能顯著促進家畜、家禽、魚、蝦、牛羊等動物的生長，改善產肉、產蛋與繁殖性能[1]。《獸藥質量標準》（2003）規定每1000 kg牛飼料中可添加100～150 g二氫吡啶，每1000 kg種肉雞飼料中可添加150 g二氫吡啶[2]。畜禽類飼料主要以玉米、大豆餅、肉骨粉等為主，輔氨基酸等營養成分以及促生長劑、維生素等添加劑，配方設計多樣、組成成分復雜，給二氫吡啶的檢測帶來了非常嚴重的雜質干擾。在現有研究中，二氫吡啶含量測定多采用紫外分光光度法、氣相色譜電子俘獲檢測器法、高效液相色譜法等檢測技術[3-4]，不能區分目標物與雜質，已不能滿足對二氫吡啶檢測的需求。

另外，二氫吡啶中-N H-的給電子共軛效應與-COOR的吸電子共軛效應，導致其結構不穩定，光穩定性較差。有研究表明，在自然光、漫射光、鎢燈光等光源下，二氫吡啶均會發生不同程度的光化學反應[5]，《中華人民共和國藥典》和《獸藥質量標準》（2003）都提出了“避光、密閉保存”“現混現喂”的規定。這一點，筆者也通過試驗證實了二氫吡啶含量持續下降的現象。如何在分離純化過程中保持二氫吡啶的穩定性并有效降低基質的干擾，是飼料產品中二氫吡啶含量測定的巨大難題和挑戰。

本文對飼料中二氫吡啶檢測方法進行研究，探討了基于氣相色譜質譜聯用的方法，通過避光操作和添加紫外線吸收劑、BSTFA衍生化等措施，著重提高方法的穩定性；通過固相萃取凈化、質譜分析等方式，解決飼料產品復雜的基質干擾、準確定性定量；方法的檢出限、準確性能滿足飼料產品中二氫吡啶的含量測定，為飼料產品更科學準確地管控質量安全提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

二氫吡啶（98.00%），TRC公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，99%），Supelco公司；乙腈，色譜純。

C 1 8 、P S A 吸附劑（c l e a n e r t ? P S A ，cleanert?C18）：博納艾杰爾科技公司。

紫外線吸收劑：4-甲基芐亞基樟腦、丁基甲氧基二苯甲?；淄椤⒈交讲⑦溥蚧撬帷Π被郊姿?、甲氧基肉桂酸乙基己酯、對甲氧基肉桂酸異戊酯等，均為分析純。

1.1.2 儀器和設備

氣相色譜質譜聯用儀（Agilent 5975C，配EI源）：美國安捷倫公司。

旋轉蒸發儀（EYELA N-1100）：上海愛朗儀器公司。

離心機（冷凍離心機L535R）：湖南湘儀實驗室儀器開發公司。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法

稱取2 g（精確至0.001 g ）飼料，加入2～3種紫外線吸收劑混合物0.2 g，混勻。加入40 mL乙腈，振蕩搖勻，超聲萃取5 min，加入1 g氯化鈉并劇烈振蕩，5000 r/min離心5 min，移取上清液。40 ℃減壓旋蒸至約1 mL，乙腈定容至2 mL。添加1 gPSA、無水硫酸鎂與C18的混合吸附劑粉末對定容液進行凈化處理，高速振蕩1～3 min，渦旋后5000 r/min離心3 min。上清液過0.45 μm濾膜，取濾液50 uL，加入100 uL BSTFA，80 ℃加熱20 min，冷卻后供上機分析。

前處理全程均采用棕色器皿并避光操作。采用遮光窗簾阻擋室外陽光，操作時關閉實驗臺近處燈光，盡可能減少實驗環境的光照強度和光照時長。

1.2.2 色譜與質譜條件

色譜柱：DB-5 ms，30 m×0.25 um×0.25 mm；進樣口溫度：260 ℃；載氣流速：1 mL/min；分流比：50∶1；色譜柱升溫程序見表1；離子源溫度：150℃；SCAN模式、SIM模式、定性離子、定量離子等參數見表2；二氫吡啶衍生化物結構圖見圖1。

2 結果與討論

2.1 光線對穩定性的影響

比較了10 ug/mL未衍生標準溶液在正常光線條件下，每1 h測定一次的響應值（見圖2），結果表明響應值隨著時間的推移整體呈下降趨勢，5 h內連續下降了近30%。

2.2 添加紫外線吸收劑與衍生化對穩定性的影響

在2 g樣品中添加200 μg二氫砒啶，加入4-甲基芐亞基樟腦、甲氧基肉桂酸乙基己酯各0.1 g，混勻后進行前處理并采用BSTFA衍生化，待測溶液每1 h測定一次（圖3）。結果表明在本試驗的光照和GCMS加熱條件下，待測物響應值基本一致，波動較小，穩定性良好。

2.3 衍生化條件的優化

2.3.1 待測溶液是否氮吹至干的比較

在衍生溫度、時間、BSTFA用量一致的情況下，比較了待測溶液經氮吹至干后加BSTFA（A）與待測溶液不經氮吹直接加BSTFA（B）兩種方式下，50 μg/mL二氫吡啶標準溶液的響應值變化（圖4）。結果表明，兩種情況下響應值沒有明顯變化，氮吹對衍生化效率影響較小，為了減少目標物損失的機會以及提高操作效率，因此采用待測溶液不經氮吹的方式。

2.3.2 衍生化時間的優化

在衍生化溫度、BSTFA用量一致的情況下，比較了50 μg/mL待測溶液分別加熱10 min、20 min、30 min、60min后的響應值變化（見圖5）。結果表明衍生化產物隨著時間的增加而上升，20 min的響應值最高，時間增加響應值下降，因此選擇衍生化時間為20 min。

2.4 方法標準溶液校正曲線、檢出限

本文方法中二氫吡啶的檢出限為0.3 mg/kg（SN＞3），線性范圍為3～150 mg/kg，定量限為3 mg/kg（SN＞10），詳見表3。方法中目標物的峰形及分離度均良好，有效排除了樣品中復雜基質的干擾，滿足實際樣品的檢測需求。二氫吡啶衍生物的色譜圖見圖6，特征離子質譜圖見圖7。

2.5 方法準確度

以配合飼料、預混合飼料、濃縮飼料為例，稱取2 g樣品，分別添加100 mg/L的二氫吡啶標液溶液0.2 mL、0.4 mL、2 mL，制備3個不同濃度水平的加標樣品，每個水平制備3個平行樣，按前處理方法處理后上機測定，測定結果見表4。結果表明，二氫吡啶的回收率在84.7%～92.4%之間，相對標準偏差為1.32%～2.66%，滿足配合飼料、預混合飼料、濃縮飼料產品中二氫吡啶含量的分析測定要求。

3 結 論

本研究開發了飼料中二氫砒啶的GCMS外標定量檢測方法，結果顯示在避光環境下，飼料樣品中加入紫外線吸收劑，用乙腈溶液提取，在40℃進行旋轉蒸發濃縮定容，經C18、PSA固相微萃取吸附劑凈化后，凈化液與BSTFA于80 ℃衍生20 min，即可得到80%以上的回收率，排除了飼料產品中主要雜質的干擾。方法的檢出限、穩定性、準確性均能滿足飼料產品中二氫吡啶含量的分析測試要求，同時有效解決了二氫吡啶在處理過程中的降解問題。

參考文獻

[1]王彥波.多功能飼料添加劑二氫吡啶的研究進展[J].飼料博覽，2005，12（6）：35-37.

[2]獸藥質量標準（2003年版）.中華人民共和國農業部第307號公告附件[Z].2003.

[3]金甌，鄭之詹，郭慧. HPLC法測定二氫吡啶的含量[J].飼料研究，2007，12（12）：24-25.

[4]ODYNETS A G， PARINOVV V Y ， KIMENIS A A ， e tal. Metabolism of diludine in experimental animals[J].Pharmaceutical Chemistry Journal， 1986， 20（4）： 243-246.

[5]梅其炳，商澎，趙德化.五種二氫吡啶光穩定性比較[J].中國藥學雜志，1998，33（5）：291-294.

作者簡介

劉文秋，本科，工程師，標準中心主任，研究方向為檢驗檢測分析方法及標準化。

董寧，博士研究生，高級工程師，研發經理，研究方向為檢驗檢測分析方法及專利。

孫瑩瑩，博士研究生，高級工程師，技術研發中心主任，研究方向為檢驗檢測分析技術及自動化設備應用。

（責任編輯：張佩玉）