牡荊素調控PERK-CHOP內質網應激途徑對帕金森病模型小鼠神經功能的改善作用研究*

朱寶平,于丹丹,曾聰慧,趙 波,劉 俊

喀什地區第一人民醫院藥學部,新疆喀什 844099

帕金森病(PD)是一種神經退行性疾病,其主要病理特征為黑質多巴胺神經元的漸進性喪失以及路易體和路易神經突的形成,對患者的身心健康和生活質量造成了極大的威脅[1-2]。PD發病機制復雜,內質網應激被認為是其中的一個重要因素,因此,針對內質網應激的干預對PD治療有著重要意義[3]。蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)-C/EBP同源蛋白(CHOP)途徑與內質網應激聯系密切[4],有研究指出[5],姜黃素可通過抑制PERK/CHOP內質網應激通路降低2型糖尿病大鼠的血糖,提高脂聯素水平。牡荊素是從牡荊葉和牡荊子中提取出的天然黃酮類化合物,除了抗癌、抗氧化、抗病毒作用,還具有包括抗記憶損傷、抗老年癡呆、抗抑郁、抗癲癇、鎮痛等神經系統保護作用[6-7],已有研究證實,牡荊素可以保護多巴胺能神經元[8],但牡荊素能否通過調節PERK-CHOP內質網應激途徑來改善PD小鼠神經功能尚不清楚,故本實驗旨在探討牡荊素調節PERK-CHOP內質網應激途徑對PD小鼠神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年雄性C57BL/6J小鼠(購自新疆醫科大學動物實驗中心),SPF級,體重28～30 g,8～10周齡,生產許可證號為SCXK(新)2021-008。于維持屏障環境的動物房中飼養小鼠:光照明暗各12 h、濕度55%～65%、溫度20～23 ℃,適應飼養7 d。

1.2儀器與試劑 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP,純度為99%,貨號:M0896)購自美國Sigma公司;左旋多巴(國藥準字:H33021919)購自福安藥物集團寧波天衡制藥有限公司;CCT020312(規格:5 mg)購自深圳海思安生物技術有限公司;牡荊素(純度:HPLC≥98%)、通用SP免疫組織化學試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、小鼠白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、小鼠IL-1β 試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;兔源抗小鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗、兔源抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、兔源抗小鼠半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗購于上海碧云天生物技術有限公司;兔源抗小鼠CHOP一抗、兔源抗小鼠PERK一抗、兔源抗小鼠酪氨酸羥化酶(TH)一抗購于美國Abcam公司;XR-YLS-4C型轉棒式疲勞儀購自上海欣軟信息科技有限公司;FlexA-200型全波長酶標儀購自山東萊索科技有限公司;ML41型雙目倒置生物顯微鏡購自廣州市明美光電技術有限公司等。

1.3PD小鼠模型的構建及分組給藥 參照文獻[9]采用腹腔注射MPTP的方法構建PD小鼠模型:腹腔注射MPTP 30 mg/kg/d,連續注射5 d,當注射完成后,觀察小鼠的行為學變化,以小鼠出現呼吸急促、震顫、豎毛、步態不穩等反應表示建模成功。將造模成功的60只PD小鼠分為高劑量牡荊素組、低劑量牡荊素組、模型組、激活劑組、陽性對照組,每組12只,另選12只正常的C57BL/6J小鼠作為對照組。用生理鹽水溶解牡荊素、陽性藥左旋多巴和PERK激活劑CCT020312,高劑量牡荊素組、低劑量牡荊素組、陽性對照組小鼠分別按照50 mg/kg、25 mg/kg的牡荊素和20 mg/kg的左旋多巴進行灌胃,激活劑組小鼠按照50 mg/kg的牡荊素灌胃后還需灌胃2 mg/kg的CCT020312,對照組及模型組小鼠每天灌胃等體積的生理鹽水1次,時間持續4周。

1.4檢測小鼠運動功能 轉棒實驗:將各組小鼠放在轉棒儀上,給予30 s的時間適應,啟動轉棒儀,轉速在30 s內達到26 r/min,記錄小鼠第1次從棒上跌落的時間;爬桿實驗:取長50 cm,粗1 cm鐵桿作為爬桿,纏上醫用膠帶防止打滑,各組小鼠在實驗前1周每天依次訓練,于最后依次治療后將小鼠放在爬桿上端,以小鼠雙前上肢接觸桿底平臺為爬完全程,記錄所需時間。

1.5HE染色檢測腦部黑質區多巴胺能神經元形態變化 每組選取6只小鼠,麻醉處死小鼠后迅速斷頭,冰上取腦,分離出黑質區和海馬區,采用4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋后分別切成6 μm厚的切片,將腦部黑質區切片用伊紅或蘇木精染色后進行組織病理學觀察。

1.6免疫組化法檢測小鼠腦組織黑質區TH表達 取腦部黑質區切片,脫蠟,水化后進行抗原修復,內源性過氧化物酶反應,滴加一抗TH孵育過夜,滴加二抗,DAB顯色,蘇木素復染,在顯微鏡下觀察并利用Image J軟件分析統計陽性細胞數。

1.7TUNEL染色檢測小鼠海馬區神經元凋亡 取1.5中腦部海馬區切片進行染色(TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒)。其中,總細胞核用DAPI染色,凋亡細胞核為綠色熒光染色。在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況,海馬區神經元凋亡率等于TUNEL陽性細胞/DAPI染色細胞核×100%。

1.8ELISA檢測試劑盒檢測小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平 每組另外選取6只小鼠,按照1.5的方法處死小鼠并收集腦組織,勻漿、裂解、收集上清液,按照TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒說明書檢測小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.9Western blot檢測蛋白表達 取1.8中的腦組織勻漿,提取總蛋白(采用RIPA裂解緩沖液),將蛋白質進行定量、電泳、轉膜、封閉,然后將膜與一抗PERK、CHOP、Bax、caspase-3、GAPDH按照對應比例孵育過夜(4 ℃下),然后將膜暴露于HRP標記的二抗中1 h。ECL試劑檢測蛋白質印跡,Image LabTM軟件分析目標蛋白的灰度值。

2 結 果

2.1各組小鼠運動功能比較 與對照組比較,模型組小鼠的下落潛伏期明顯減少,爬桿時間明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠的下落潛伏期明顯增加,爬桿時間明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠的下落潛伏期顯著減少,爬桿時間顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠運動功能比較

2.2各組小鼠腦部黑質區病理形態比較 與對照組比較,模型組小鼠腦內黑質區神經元數量明顯減少,核仁染色明顯,胞漿染色變深,且可見較多空泡化變性神經元;與模型組比較,低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠的神經元數目增多,空泡化變性減少;與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠的核仁和胞漿染色加深,見圖1。

圖1 HE染色檢測各組小鼠腦部黑質區病理形態變化(×400)

2.3各組小鼠腦組織黑質區TH陽性細胞數目比較 與對照組比較,低劑量牡荊素組、激活劑組、模型組小鼠TH陽性細胞數目顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠TH陽性細胞數目明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠TH陽性細胞數目減少,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2和表2。

圖2 免疫組化法檢測各組小鼠神經細胞中TH表達(×100)

表2 各組小鼠神經細胞TH陽性細胞數目比較

2.4各組小鼠海馬區神經元凋亡比較 小鼠海馬區神經元凋亡率其他各組比對照組顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠海馬區神經元凋亡率比模型組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠海馬區神經元凋亡率升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表3和圖3。

圖3 TUNEL染色檢測小鼠海馬區神經元凋亡(×200)

表3 各組小鼠海馬區神經元凋亡率比較

2.5各組小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 模型組、低劑量牡荊素組、激活劑組小鼠腦組織中IL-6、TNF-α、IL-1β水平比對照組顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比模型組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平上升,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.6各組小鼠腦組織中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平比較 與對照組相比較,模型組小鼠腦組織中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量牡荊素組和陽性對照組小鼠腦組織中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量牡荊素組比較,激活劑組小鼠腦組織中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4、表5。

注:A為對照組;B為模型組;C為低劑量牡荊素組;D為高劑量牡荊素組;E為陽性對照組;F為激活劑組。

表5 各組小鼠腦組織中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平比較

3 討 論

PD是由多種因素介導的慢性神經退行性疾病,隨著我國人口老齡化的加劇,其發病率升高,給我國的醫療系統帶來沉重的壓力[10-12]。目前主要依賴左旋多巴、多巴胺受體激動劑等藥物緩解PD患者癥狀,但中晚期患者存在療效差,有不良反應等問題[13-15]。因此,開發新的治療藥物對PD患者有重大意義。本文通過向C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP的方法構建PD模型,結果發現,造模小鼠腦組織炎癥細胞因子水平升高,引發炎癥,造成黑質區多巴胺能神經元缺失和海馬區神經元凋亡,并導致小鼠轉棒實驗下落潛伏期降低,爬桿實驗時間增加,表明造模小鼠出現運動障礙,揭示PD模型構建成功。

有研究顯示,內質網應激和神經炎癥是造成PD動物模型多巴胺能神經元丟失和神經細胞凋亡的主要病理因素,抑制內質網應激和神經炎癥發生發展可有效改善PD癥狀[16-17]。牡荊素又稱牡荊苷,是一種具有顯著抗炎、抑制應激作用和保護神經的天然化合物,可顯著緩解丙烯酰胺神經毒素誘導的斑馬魚幼蟲的組織學和行為學變化[18-19],還可以改善異氟醚誘導的神經元凋亡和記憶障礙[20],因此推測牡荊素可能具有抗PD作用。本文以不同劑量牡荊素處理PD小鼠,可降低小鼠爬桿時間、海馬區神經元凋亡率、TNF-α、IL-6及IL-1β水平,提高下落潛伏期、黑質區多巴胺能神經元數量,表明牡荊素可抑制炎癥細胞因子表達,減少黑質區多巴胺能神經元損傷和海馬區神經元凋亡,修復PD小鼠運動功能,明顯改善其神經功能。

PERK-CHOP作為內質網應激主要的調控信號,在神經保護方面具有重要作用[21-22]。白藜蘆醇可通過調控PERK-ATF4-CHOP信號通路抑制內質網應激,發揮腦神經細胞保護作用[23]。有研究表明,GSK2606414可抑制PERK/p-eIF2α/ATF4/CHOP軸并增強線粒體功能,減輕高糖誘導的神經母細胞瘤神經毒性[24]。還有研究表示,黃芪甲苷-Ⅳ可通過減少CHOP蛋白水平從而抑制神經元凋亡[25]。因此推測抑制PERK-CHOP內質網應激途徑可能是牡荊素改善神經功能的作用機制,本文結果顯示,牡荊素可降低PD小鼠腦組織PERK及CHOP蛋白水平,表明牡荊素可通過調控PERK/CHOP信號改善PD小鼠神經功能,以牡荊素和PERK激活劑CCT020312同時處理PD小鼠,相比牡荊素單獨處理,可促使小鼠爬桿時間、海馬區神經元凋亡率、TNF-α、IL-6及IL-1β水平、腦組織PERK、CHOP、Bax、caspase-3蛋白水平升高,下落潛伏期、黑質區多巴胺能神經元數量降低,表明CCT020312可減弱牡荊素對PERK-CHOP內質網應激途徑及炎癥的抑制,且對于牡荊素對海馬區神經元凋亡的緩解和黑質區多巴胺能神經元損傷起著拮抗作用,最終逆轉牡荊素對PD小鼠神經、運動功能的改善作用,揭示牡荊素是通過抑制PERK-CHOP內質網應激途徑從而改善PD模型小鼠神經功能。

綜上所述,牡荊素可改善PD小鼠運動功能障礙,減輕炎癥反應,發揮神經保護作用,這可能是通過抑制PERK-CHOP內質網應激途徑實現。