細粒棘球絳蟲胞外囊復合物2蛋白的生物信息學分析*

張婷婷，錢炳碩，王明霞，朱明星

1.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏醫科大學科技中心，寧夏 銀川 750004；5.寧夏常見傳染病防治重點實驗室，寧夏 銀川 750004

細粒棘球蚴病又稱囊型包蟲病，中間宿主由于誤食了細粒棘球絳蟲（Eg）的蟲卵而感染該?。?-2］。胞外囊復合物2（EXOC2）是一種多蛋白復合物，是胞外囊泡極化靶向細胞膜上特定對接位點所必需的，相關研究［3-4］顯示外囊功能喪失在酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅、小鼠及多個細胞系中都是致命的，但是EXOC2 在Eg 感染中的作用目前尚未有系統性研究。本研究利用生物信息學的方法對Eg EXOC2 蛋白進行分析，旨在了解EXOC2 在Eg 生物功能及免疫診斷方面的價值，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列獲取

登錄NCBI 數據庫檢索并下載EgEXOC2 蛋白的氨基酸序列，該蛋白的序列號為XP_024353820.1。

1.2 蛋白質理化性質的預測

利用蛋白質在線分析網站Protparam 工具預測EXOC2的理化性質，包括氨基酸組成、等電點、半衰期、不穩定系數及GRAVY 值等。使用ProtScale 數據庫分析蛋白質的疏水性并進行驗證，其中＞0 表示疏水性，＜0 表示親水性。

1.3 進化樹的構建

利用MEGA 11.0 軟件構建秀麗隱桿線蟲、Eg、圓頭蟲、人、小鼠、線蟲、威得利纖毛蟲、單色微絲蟲、裂尾蚴、血吸蟲、紫圓線蟲、鼠類圓線蟲等12種生物的系統進化樹。

1.4 信號肽、蛋白跨膜區及結構域的預測

利用SignalIP-5.0 在線數據庫預測該蛋白的信號肽，使用TMHMM-2.0 數據庫預測蛋白質的跨膜區。使用SMART在線數據庫分析該蛋白的結構域。

1.5 蛋白質抗原表位預測

使用ABCPred 數據庫和IEDB 數據庫預測該蛋白的優勢B 細胞表位，使用IEDB 數據庫和SYFPEITHI 數據庫預測蛋白的優勢T細胞表位。

1.6 蛋白相互作用關系預測

使用STRING 在線數據庫預測與該蛋白相互作用的其他蛋白。

1.7 相互作用基因的篩選及GO和KEGG富集分析

利用R 軟件“clusterProfiler”包和“ggplot2”包對差異基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以可視化條形圖和氣泡圖的方式呈現。

1.8 磷酸化及修飾位點預測

利用NetPhos-3.1 在線數據庫預測該蛋白的磷酸化位點，使用motif_scan數據庫預測蛋白修飾位點。

2 結果

2.1 EXOC2的理化性質分析

使用ProtParam對蛋白質的理化性質進行分析，EXOC2的分子量為123 874.86；由1 117個氨基酸組成，包含66個酸性氨基酸，96 個堿性氨基酸；理論等電點為7.86；分子式為C5446H8686N1552O1662S43；原子總數為11 524；半衰期為30 h；不穩定系數為60.21，表明該蛋白結構穩定；GRAVY值為-0.625，說明該蛋白為親水性蛋白，見表1。

表1 EXOC2的理化性質

2.2 親/疏水性分析

使用ProtScale數據庫預測該蛋白的親/疏水性，該蛋白在第812 個氨基酸處疏水性最強，最大值為2.444，在第109 個氨基酸處親水性最強，其最小值為-3.098，由結果可知，該蛋白大部分氨基酸具有親水性質，其中親水性強的部分可能存在抗原表位，見圖1。

圖1 EXOC2親水性預測分析

2.3 EXOC2進化樹的構建

進化樹結果顯示，EXOC2 在生物進化上與紫圓線蟲、裂尾蚴、血吸蟲和鼠圓線蟲的親緣關系較近，與威得利纖毛蟲和人的親緣關系較遠，見圖2。

圖2 EXOC2進化樹

2.4 蛋白質的信號肽、跨膜結構區及蛋白質結構域的預測

信息學預測顯示該蛋白不含信號肽序列，也不存在跨膜區。

2.5 蛋白優勢表位分析

利用在線數據庫預測該蛋白的B 細胞表位，得到的B細胞表位肽有11 條。使用IEDB 預測軟件預測長度＞10 個氨基酸的區域位于100-115、539-540、851-866、896-911、988-992、704-749。利用SYFPEITHI 在線分析軟件的表位預測功能分析蛋白的HLA-A0201 限制性（9aa）細胞毒性T 細胞（CTL）表位，篩選出預測分值＞25 的表位肽，共13 條；分析蛋白的HLA-DRB1*0401 和HLADRB1*0701 限制性（15aa）輔助性T 細胞（Th）表位，篩選出預測分值＞26 的肽段，并通過IEDB 在線網站預測HLA-DRB1*0401 限制性Th 表位，篩選出評分較高的細胞表位，分別取交集，得到HLA-A0201 優勢表位氨基酸區域為697-698、821-824，HLA-DRB1*0401限制性Th表位氨基酸區域為821-823、920-930，HLA-DRB1*0701 限制性Th 表位氨基酸區域為270-275、920-922，見圖3、表2、表3、表4、表5。

表2 HLA-A0201限制性CTL表位

表3 HLA-DRB1*0401限制性Th表位

表4 HLA-DRB1*0401限制性Th表位

表5 HLA-DRB1*0701限制性Th表位

圖3 EXOC2優勢B細胞表位結構域預測

2.6 蛋白二級結構分析

SOMPA 在線軟件分析顯示，在蛋白的二級結構中a-螺旋占45.84%，β-轉角占13.56%，延伸連占13.7%。無規則卷曲占36.62%，以a-螺旋為主，見圖4。

圖4 EXOC2蛋白二級結構預測

2.7 蛋白相互作用關系預測

通過在線數據庫對EXOC2 進行蛋白相互作用網絡分析，發現其與EXOC5、EXOC6、EXOC3等EXOC蛋白家族及Ras相關蛋白密切相關。

2.8 相互作用基因的篩選及GO和KEGG富集分析

利用R 軟件“clusterProfiler”包和“ggplot2”包對差異基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。生物學過程中與EXOC2 相關程度最高的是蛋白單泛素化，RNA 3'末端加工，染色體正向調控，大分子甲基化等；細胞定位中與EXOC2 相關程度最高的是轉錄延伸復合物因子，雙鏈斷裂位點等；分子功能中與EXOC2相關程度最高的是GTP酶激活劑活性，3' - 5'外切酶活性，基礎轉錄機制結合，基礎RNA 聚合酶II 轉錄機制結合，外切酶活性等。KEGG富集到的通路主要有內吞作用、同源重組、內分泌等因子調節鈣重吸收、Hedgehog信號通路等。

2.9 磷酸化及修飾位點分析

結果顯示，EXOC2 蛋白共有81 個絲氨酸磷酸化位點，33個酪氨酸磷酸化位點，10個蘇氨酸磷酸化位點。MotifScan 分析EXOC2 蛋白共有70 個翻譯后修飾位點，包括1 個酰胺化位點、5 個N-糖基化位點、4 個cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點、25 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點、14個N-豆蔻?；稽c、20個蛋白激酶C磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點，見圖5。

圖5 EXOC2的磷酸化及修飾位點分析

3 討論

胞外囊復合物是一種多蛋白復合物，是胞外囊泡極化靶向細胞膜上特定對接位點所必需的。在高等真核生物中，外囊復合體的組成蛋白和功能已被證明是高度保守的［4-5］。至少有8種胞外復合物成分被發現與肌動蛋白細胞骨架重塑和囊泡轉運機制相互作用，這種相互作用已被證明介導成纖維細胞中絲狀體的形成［6-7］。研究［8］發現，EXOC2 及其他外囊復合亞單位對神經元功能至關重要，EXOC2發生變異時會導致患者神經功能的障礙。該蛋白已被證明與GTPases 的Ral亞家族相互作用，從而通過將囊泡系在質膜上介導胞吐選擇性剪接導致多個轉錄變體［9］。但EXOC2在Eg等寄生蟲中的研究尚未見報道。

本研究利用生物信息學技術對EXOC2 蛋白進行分析，通過NCBI 獲得其氨基酸序列，利用一系列在線數據庫對其理化性質、同源性及抗原表位等進行了預測。這些有效信息的預測，也為EXOC2 蛋白成為包蟲病抗原肽疫苗的候選分子提供了可能性。研究［10］表明，與傳統疫苗相比，多肽疫苗的效果可能更安全更高效。

本研究利用生物信息學方法對EgEXOC2 蛋白的相關性質及功能進行了預測分析，發現EXOC2 蛋白具有較豐富的T、B 優勢抗原表位，有可能成為抗原肽疫苗新的潛在靶點，研究結果期望能為包蟲病抗原肽疫苗的研制提供一定的理論基礎。