基于網絡藥理學和分子對接探討益氣定眩飲治療腦梗死的作用機制

伍昌總 王思雨 張 藝 張 啟 劉春華

1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙 410005

腦梗死（cerebral infarction，CI）又稱缺血性腦卒中，主要病理改變是多種原因致使腦動脈血管狹窄進而腦組織出現局部缺氧、壞死[1]，具有高致病率、致殘率的特點，我國患者5年內CI復發率較高，大部分會失去自理和工作能力，給家庭和社會經濟帶來很大負擔[2-3]。中醫將其歸于“缺血性腦中風”范疇，多以“肝腎不足，陰陽失調，氣血逆亂，上犯于腦”為基本病機。益氣定眩飲是國醫大師劉祖貽在多年臨床研究基礎上以經典名方補陽還五湯為本，加“填精、化痰”之品優化組方而成[4-5]，方中含黃芪30 g、葛根45 g、川芎6 g、紅花10 g、赤芍10 g、地龍10 g、桃仁10 g等（因知識產權保護，暫不公布所有藥物），該方雖在臨床頗有成效，但作用機制尚未明確，故本研究運用網絡藥理學及分子對接技術，從生物信息學角度探討其治療CI的潛在作用機制，為臨床運用提供新的思路和實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 益氣定眩飲的主要活性成分及潛在靶點獲取

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺篩選益氣定眩飲的全部成分，在TCMSP、TCM-ID、SymMap數據庫中收集益氣定眩飲中各個活性成分對應的靶點蛋白及靶基因名，最后獲取活性成分的預測靶點。

1.2 CI和益氣定眩飲的相關靶點挖掘

以“cerebral infarction”為關鍵詞在GeneCards數據庫、DrugBank數據庫檢索與CI有關的基因，將益氣定眩飲與CI的靶點取交集，并用R軟件進行韋恩圖繪制。

1.3 構建益氣定眩飲和CI關鍵靶點網絡

通過STRING數據庫將益氣定眩飲有效成分靶點與CI的交集基因相關聯，利用Cytoscape 3.8.2內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，構建益氣定眩飲-CI靶點-信號通路網絡圖。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將益氣定眩飲-疾病核心基因進行GO及KEGG通路富集分析，從分子功能（microfilaments，MF）、細胞組分（cumulus cell，CC）和生物過程（base pair，BP）3個角度得出有關信號通路及生物進程并進行可視化分析。同時，將獲得的關鍵通路和核心靶點進行聯合分析，構建中藥活性成分-靶點-疾病網絡圖。

1.5 “成分-靶點”分子對接驗證

將上述獲取的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖通過Cytoscape 3.8.2軟件中的cytoNCA插件計算，再通過R軟件篩選均超過三者中位值的靶點為核心靶點。通過核心靶點匹配益氣定眩飲主要潛在活性成分，從RCSB PDB數據庫中選擇物種為Homo sapiens，搜索下載3D結構PDB格式文件，利用AUTODUCK軟件對蛋白進行去水、加氫、計算電荷和能量最小化優化，與篩選的活性成分進行對接，選取結合能＜-5.0 kJ/mol作為篩選活性成分的依據，對化合物和靶標蛋白進行分子對接分析。

2 結果

2.1 益氣定眩飲有效活性成分篩選和靶點預測結果

TCMSP數據庫收集到益氣定眩飲的93個成分，以“OB≥30%”“DL≥0.18”為標準進行篩選，共得到益氣定眩飲有效活性成分30個，其中葛根4種、紅花4種、黃芪20種、熟地黃2種，見表1。

2.2 中藥復方-疾病相關靶點獲取

CI的致病基因共2872個，將CI相關靶點與益氣定眩飲取交集，獲得14個靶點，見圖1。

圖1 CI疾病靶點整合及中藥復方與CI疾病靶點交集圖

2.3 益氣定眩飲-CI交集靶點PPI網絡構建及拓撲分析

中藥-成分-靶點網絡，共有113個節點和1039條邊，見圖2。木犀草素、β-豆甾醇度值最大，可以推測其是治療CI的核心成分。利用Cytoscape 3.8.2軟件構建PPI網絡圖，圖中越接近紫色表明網絡中節點越大，即degree值越大，得到ESR1、AKT1、MAPK1、TP53、CASP3、BCL2、TNF、IL-6這8個核心靶點（圖3、表2），與其他靶點關聯緊密，在整個PPI網絡中起關鍵作用，說明本方活性成分作用于這些靶點治療CI的可能性大。

圖2 “中藥-成分-靶點”網絡關系圖

圖3 PPI網絡圖

表2 核心靶點與其他靶點關聯度

2.4 GO功能、KEGG通路富集分析注釋結果

益氣定眩飲-CI核心基因在R4.0.2上GO功能注釋結果顯示：BP分析得1097條通路、CC分析得16條通路、MF分析得110條通路，其中BP主要涉及對外來生物刺激的反應、對營養素水平的反應等；CC主要涉及薄膜筏、膜微區、囊泡內腔等；MF主要涉及DNA結合轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄等。益氣定眩飲-CI核心基因在R4.0.2上KEGG前20條通路富集分析結果顯示核心基因主要富集在PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、晚期糖基化（AGE-RAGE）信號通路、Toll受體信號通路等，見圖4。

圖4 GO功能分析氣泡圖、KEGG富集分析通路柱狀圖

2.5 分子對接驗證

將度值較高的關鍵靶點CASP3、IL-6作為受體，與核心活性成分槲皮素、木犀草素等配體進行分子對接驗證。一般認為，結合能＜-5.0 kJ/mol表示有較好的結合活性。木犀草素與TP53結合力為-7.8 kJ/mol，豆甾醇與CASP3的結合力為-7.0 kJ/mol。見圖5。

圖5 木犀草素與TP53（a）分子對接圖、豆甾醇與CASP3（b）分子對接圖

3 討論

中醫學將CI歸于“缺血性中風”范疇，本質屬于本虛標實。有研究表明[6]，“滋腎養肝、化痰消瘀”之法可改善CI神經功能評分，促進血管新生，益氣活血法則可改善缺氧細胞、脂質代謝[7]。彭冬等[8]研究發現益氣活血組方可促進腦缺血后血管新生，有充分實驗研究表明補中益氣湯方有促進腦缺血區周圍血管新生的作用。經過數十年臨床及實驗研究驗證，益氣定眩飲對大鼠腦缺血損傷后的神經功能、局部神經元細胞形態均具有明顯改善作用，隨時間延長而效果更顯著，這與上調VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達及調節Akt/mTOR信號通路促進血管新生有關，從而達到改善腦組織供血供氧的目的，在臨床上取到較好療效[9]。

本研究通過網絡藥理學構建活性成分-靶點拓撲圖，分析結果顯示益氣定眩飲治療CI的核心成分是槲皮素、木犀草素，關鍵成分是β-豆甾醇、黃芩苷等。木犀草素為食源性黃酮類化合物，具有保護心腦血管、抗腫瘤、抗氧化及調節免疫等多種藥理作用，木犀草素可以通過增強神經元細胞膜上的泵活性減輕缺血再灌注所致的神經元損傷[10-11]。β-豆甾醇可抑制細胞凋亡以及調節Caspase-3、Bcl-X1表達，從而降低氧化應激和炎癥，脊柱甾醇保護大腦免受腦I/R損傷。黃芩苷可達到抑制腦NF-κB/CCL2/CCR2通路，激活多個目標的效果[12-13]。

富集分析及分子對接結果顯示，益氣定眩飲治療CI的靶點主要集中在IL-6、TP53、CASP3等。IL-6炎癥誘導導致星形膠質細胞凋亡，影響腦梗死區域的體積[14]。TP53通過影響一氧化氮生物合成及信號轉導、內皮細胞凋亡負調控等生物過程來發揮治療CI的作用[15]。CASP3減少Bcl-2水平增加損傷及腦神經細胞損傷，會加重腦缺血[16-17]。

KEGG富集分析結果顯示核心靶點主要有AGE-RAGE、PI3K-Akt、Toll樣受體等信號通路，說明本方活性成分可能通過以上途徑對疾病進程進行干預。AGE-RAGE通路抑制衰老信號來延緩動脈粥樣硬化的發展，從而改善動脈粥樣硬化，減少斑塊面積[18]。PI3K-Akt通路抑制神經元凋亡以挽救或延遲尚存缺血性半影中的梗死并調節抗氧化蛋白水平，從而保護神經元免受氧化應激損傷[19-20]。Toll樣受體是一種天然免疫受體，作為免疫反應的一個重要中介在動脈粥樣硬化的發生和進展中扮演著重要的角色[21-22]。

本研究通過生物信息學技術，表明益氣定眩飲的有效活性成分可以通過多個靶點及通路作用于CI，其核心成分槲皮素能夠作用于關鍵成分β-豆甾醇及關鍵靶點IL-6，通過靶點CASP3治療CI，拓展了益氣定眩飲治療CI的新思路，為臨床應用本方提供了理論依據，但本研究還存在一定局限性，需要進一步實驗驗證相關核心靶點，探討具體機制。