高效液相色譜法檢測白酒中痕量環(huán)己基氨基磺酸鈉

魏 功，王 樂，李春芳，張智洋，任國軍，嚴 偉，王 慧*

（內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015400）

環(huán)己基氨基磺酸鈉，俗稱甜蜜素，是一種使用較廣泛的甜味劑，常被用于糕點、蜜餞、飲料等食品中[1]。在GB/T 15109—2021《國標白酒工業(yè)術語》[2]中的固態(tài)法、液態(tài)法和固液法白酒規(guī)定：“不直接或間接添加食用酒精及非自身發(fā)酵產(chǎn)生的呈色呈香呈味物質”，甜蜜素并非自身發(fā)酵產(chǎn)生，所以它不允許出現(xiàn)在濃香型白酒[3]、清香型白酒[4]以及其他香型白酒[5-6]中。近年來市售白酒中經(jīng)常被爆出甜蜜素不合格[7-9]，中小型釀酒企業(yè)尤為嚴重[10]，基本上都是一些不法分子甚至技術人員為了改善白酒的口感，非法添加來彌補酒體自身多元醇含量的不足而欠缺的回甜感[11]。

目前甜蜜素常用的檢測方法有氣相色譜法[12-14]，適合檢測飲料酒和配制酒，較高的檢出限不適合檢測白酒，而液相色譜法[15-17]和離子色譜法同樣因檢出限太高不能滿足白酒檢測要求[18-19]，以上儀器方法適合白酒中甜蜜素檢測的文獻非常鮮見。國家標準可用于檢測白酒中甜蜜素的只有GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第三法[20]。閆吉昌等[21]對國標三種方法進行了改進研究，結論是第一法氣相色譜法和第二法液相色譜法僅可用于配制酒檢測。目前適用于白酒中甜蜜素檢測的主要有液相色譜-串聯(lián)質譜法[22-24]，還有白酒中多種甜味劑檢測的串聯(lián)質譜法[25-26]，這些方法均快速、準確、靈敏度高，但是儀器價格昂貴，運行和維護費用也非常高，一般的小型甚至中型釀酒企業(yè)的實驗室都無法承受。因此有必要建立一種成本和運行維護費用低廉的方法，并且檢出限能達到甚至超過國標液相色譜-質譜/質譜法，適合中小酒企實驗室檢測白酒中甜蜜素。該實驗建立了一種利用高效液相色譜檢測白酒中痕量環(huán)己基氨基磺酸鈉（甜蜜素）的方法。根據(jù)甜蜜素的熱穩(wěn)定性對白酒樣品進行第一次濃縮，衍生后不同萃取溶劑萃取、堿洗后進行二次濃縮，選擇不同的溶劑復溶后過膜上機測試，通過流動相試驗優(yōu)化色譜條件，單因素試驗、正交試驗優(yōu)化前處理條件，再通過方法學考察進行評價。旨在為其做好白酒生產(chǎn)過程中的甜蜜素風險控制提供技術支持，促進企業(yè)健康良性發(fā)展，保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

66.5%vol清香型原漿酒（2021年產(chǎn)）、67.8%vol濃香型原漿酒（2020年產(chǎn)）：內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司；各類香型白酒：市售；環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計）標準溶液（1 000 μg/mL）：壇墨質檢標準物質中心；甲醇、正庚烷、正己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、正戊烷、乙酸銨、乙腈（均為色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；硫酸、次氯酸鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；0.22 μm尼龍針濾膜：日本島津公司。

1.2 儀器與設備

TD20002A電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：德國賽多利斯公司；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗機：昆山超聲儀器有限公司；HX-6024電熱恒溫水浴鍋：山東菏澤華興儀器儀表有限公司；VORTEX-2渦旋混勻器：上海滬析實業(yè)有限公司；SD-12氮吹儀：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀（配備SPD-20A紫外檢測器）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 基質標準溶液的配制

以酒精度、香型、成分與被測酒樣接近的不含環(huán)己基氨基磺酸鈉及其衍生物的白酒樣品為基質，配制成環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計）系列標準溶液，質量濃度分別為1.00 mg/kg、0.50 mg/kg、0.10 mg/kg、0.05 mg/kg、0.03 mg/kg、0.01 mg/kg。

1.3.2 樣品處理

初步濃縮：稱取白酒樣品于蒸發(fā)皿中，沸水浴加熱蒸去揮發(fā)性物質，將蒸發(fā)皿底部固形物殘渣用5 mL水超聲2 min洗入25 mL比色管中，再用5 mL水潤洗一遍，合并洗液。

衍生化：將上述試樣溶液中加入1.0 mL硫酸溶液（1+1）、1.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯50 g/L以上）、5.0 mL萃取溶劑，渦旋混勻器上渦旋2 min，靜置分層后轉移全部有機相至50 mL比色管中，加入25 mL碳酸氫鈉溶液（50 g/L），振蕩1 min。靜置分層后轉移全部有機相于10 mL比色管中。

二次濃縮：將上述比色管中的有機相在氮吹儀上50 ℃吹干，用1 mL溶劑復溶，經(jīng)0.22 μm尼龍針濾膜過濾，濾液備進樣用。

1.3.3 液相色譜條件

將0.03mg/kg的基質標準溶液通過樣品處理的全部步驟處理上機，設置進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長：314 nm，Pribolab MycoChrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離，考察3種流動相體系A：甲醇∶水（75∶25，V/V），B：乙腈∶水（70∶30，V/V），C：甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V）對目標物質的色譜峰形態(tài)、基線噪聲、分離效果等的影響。

1.3.4 定性定量方法

環(huán)己基氨基磺酸鈉在硫酸提供的酸性環(huán)境下與次氯酸反應生成N,N-二氯環(huán)己胺和一些副產(chǎn)物，衍生物N,N-二氯環(huán)己胺經(jīng)過液相色譜分析柱分離后，在波長314 nm處的紫外吸收峰面積與樣品中的環(huán)己基氨基磺酸鈉含量成正比，根據(jù)保留時間定性，外標法定量[12]。

1.3.5 樣品前處理條件優(yōu)化

（1）單因素試驗設計

設置白酒樣品環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計）添加水平為0.03 mg/kg，按照前述樣品處理步驟和色譜條件，分別考察稱樣量、蒸干程度、萃取溶劑、復溶溶劑對結果的影響，以信噪比（signal to noise ratio，S/N）確定較優(yōu)水平區(qū)間，單因素試驗因素與水平見表1。

（2）正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗的結果，選擇稱樣量100 g，以蒸干程度（A）、萃取溶劑（B）、復溶溶劑（C）為考察因素，設計3因素3水平的正交試驗，正交試驗因素與水平見表2。

表2 前處理條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for pretreatment condition optimization

1.3.6 線性關系、檢出限、定量限

以基質白酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉質量濃度（X）為橫坐標，經(jīng)過前處理的目標物質N,N-二氯環(huán)己胺的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。在基質白酒中添加環(huán)己基氨基磺酸鈉，以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，10倍信噪比（S/N=10）計算定量限。

2 結果與分析

2.1 流動相優(yōu)化

3種流動相體系對目標物質的色譜峰形態(tài)、基線噪聲、分離效果等的影響見圖1。

圖1 3種流動相體系的高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatograms of three mobile phase systems

由圖1可知，C流動相色譜峰形態(tài)較好，基線噪聲低，分離效果佳，原因是流動相中的乙酸銨溶液提高了N,N-二氯環(huán)己胺的離子化效率，同時作為離子對試劑改善了目標物質在液相色譜上的保留行為[27]，因此選擇甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V）為最優(yōu)流動相。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 稱樣量對信噪比的影響

考察不同稱樣量對信噪比（S/N）的影響，結果見圖2。

圖2 稱樣量對信噪比的影響Fig. 2 Effect of sample weight on signal to noise ratio

由圖2可知，隨著稱樣量的增大，信噪比隨之升高，稱樣量在30～50 g時，信噪比還不能滿足檢測要求，稱樣量在100 g時，信噪比已經(jīng)超過3，采用3倍信噪比（S/N）計算檢出限是0.03 mg/kg，已經(jīng)可以達到國標GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第三法液相色譜-質譜/質譜法測定白酒中甜蜜素的水平。進一步考察加大稱樣量對檢測圖譜的影響，稱樣量達到120～150 g時，檢測圖譜基線噪聲變大，因為基質干擾變得嚴重，結合試驗過程中的蒸干濃縮耗時變長，部分樣品衍生時泡沫增多、分層困難甚至乳化、有機相損失嚴重等，從而選擇最佳稱樣量為100 g。

2.2.2 蒸干程度對信噪比的影響

考察不同蒸干程度對信噪比（S/N）的影響，結果見圖3。

圖3 蒸干程度對信噪比的影響Fig. 3 Effect of evaporation degree on signal to noise ratio

由圖3結合試驗過程可知，在沸水浴蒸至剩余約5 mL和1 mL時，信噪比較低，因為這里包含了較多的干擾物質，導致檢測圖譜噪聲強度偏大。蒸干樣品會使噪聲強度減小，信噪比顯著提升，續(xù)蒸0.5 h和1.0 h會使檢測圖譜噪聲強度變得更小，同時衍生物N,N-二氯環(huán)己胺信號強度窄幅也減小，但是信噪比會穩(wěn)定在較高水平，這是因為甜蜜素的熱穩(wěn)定性，蒸干到續(xù)蒸過程使白酒中造成紫外吸收信號干擾的部分物質和衍生前體物質揮發(fā)，甜蜜素保留，樣品得到了很大程度的凈化，因此選擇蒸干以及干后續(xù)蒸0.5 h和1.0 h 3種蒸干程度進行正交試驗。

2.2.3 萃取溶劑對信噪比的影響考察不同萃取溶劑對信噪比（S/N）的影響，結果見圖4。

圖4 萃取溶劑對信噪比的影響Fig. 4 Effect of extraction solvent on signal to noise ratio

由圖4結合試驗過程可知，正庚烷、正己烷、環(huán)己烷作為萃取溶劑時信噪比較高，說明它們對衍生物N,N-二氯環(huán)己胺有更好的提取效果，其次是正戊烷、二氯甲烷，相同濃度下信噪比越高代表著方法更低的檢出限和定量限，更高的檢測精度，因此選擇提取效果較好的正庚烷、正己烷、環(huán)己烷進行正交試驗。

2.2.4 復溶溶劑對信噪比的影響

考察不同復溶溶劑對信噪比（S/N）的影響，結果見圖5。

圖5 復溶溶劑對信噪比的影響Fig. 5 Effect of redissolved solvent on signal to noise ratio

由圖5結合試驗過程可知，流動相甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V）和正庚烷、正己烷作為復溶溶劑時的圖譜較好，信噪比較高，流動相復溶溶劑效應低，峰形態(tài)好，正庚烷和正己烷對目標物質溶解性優(yōu)于流動相。甲醇和乙腈對目標物質溶解性相對較差，圖譜信號強度低，信噪比低，綜合考慮優(yōu)選正庚烷、正己烷、流動相（甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V））作為復溶溶劑進行正交試驗。

2.3 正交試驗結果與分析

根據(jù)單因素試驗結果，以蒸干程度（A）、萃取溶劑（B）、復溶溶劑（C）為評價因素，以信噪比為評價指標，選取9份白酒加標樣品（添加水平為0.03 mg/kg）進行3因素3水平正交試驗，結果見表3。

表3 前處理條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for pretreatment conditions optimization

由表3可知，3種因素對高效液相色譜檢測白酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉圖譜信噪比的影響的大小順序為B＞A＞C，即萃取溶劑＞蒸干程度＞復溶溶劑；最優(yōu)的前處理條件為A2B3C3，即沸水浴蒸干續(xù)蒸0.5 h、正庚烷萃取、流動相甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V）復溶，以此條件對上述白酒加標樣品進行試驗，平均信噪比可以達到10.21，高于試驗組6的S/N，且圖譜噪聲強度較低、干擾較少。

2.4 基質標準曲線線性關系、檢出限、定量限

在正交試驗得到的最佳條件下，對環(huán)己基氨基磺酸鈉按照1.3.1的質量濃度為基質標準溶液處理后上機測試，以環(huán)己基氨基磺酸鈉質量濃度（x）為橫坐標、衍生物（N,N-二氯環(huán)己胺）峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=93 287x-476.76，R2=0.999 8，說明該方法在0.01～1 mg/kg質量濃度范圍內(nèi)標準曲線線性關系良好。采用向空白樣品中逐級降低添加濃度的方法確定方法的檢出限和定量限，以3倍信噪比、10倍信噪比分別計算，最終得到方法檢出限0.01 mg/kg，定量限0.03 mg/kg，優(yōu)于白酒檢測國標GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第三法液相色譜-質譜/質譜法的檢出限0.03 mg/kg，定量限0.10 mg/kg。

2.5 精密度試驗

采用最佳處理條件，對5種香型白酒中的甜蜜素添加樣品分別進行6次平行測定，精密度考察結果見表4。

表4 不同香型白酒中甜蜜素含量測定的精密度試驗結果Table 4 Precision test results of sodium cyclamate content in different flavor Baijiu

由表4可知，不同香型白酒樣品中甜蜜素測定結果的6次平行試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.70%～3.73%（n=6），RSD均＜5%，結果表明本方法精密度良好，滿足分析要求。

2.6 加標回收率試驗

為了驗證本方法檢測結果的準確性，選擇不同香型原酒和成品白酒進行加標測定，環(huán)己基氨基磺酸鈉添加高、中、低3個水平分別為0.10 mg/kg、0.50 mg/kg、1.00 mg/kg，每個添加水平按照正交試驗得到的最佳條件平行測定3次，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表5。

表5 不同香型白酒中甜蜜素的加標回收率試驗結果Table 5 Test results of recovery rates of cyclamate in different flavor Baijiu

由表5可知，本方法在不同香型原酒和成品白酒樣品的加標回收率在94.4%～103.7%，加標回收率試驗結果的RSD為0.44%～1.96%，準確度較高。

2.7 白酒樣品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定

使用該方法對市售的15個批次大、中、小白酒廠家樣品進行甜蜜素檢測，其中12個批次未檢出，2個批次含量在0.01～0.03 mg/kg之間，1個批次含量為0.041 mg/kg，超過了國標GB 5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第三法檢出限0.03 mg/kg，可以視為檢出，說明目前白酒行業(yè)仍然可能存在非法添加或庫存酒殘留甜蜜素的情況。

3 結論

本研究建立了一種高效液相色譜檢測白酒中痕量環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，最終確定了最佳前處理條件為稱樣量100 g、沸水浴蒸干續(xù)蒸0.5 h除去白酒中大部分干擾成分、衍生后正庚烷萃取、堿洗后二次濃縮、采用流動相復溶后上機選用甲醇∶10 mmol/L乙酸銨水溶液（75∶25，V/V）流動相檢測。再通過線性范圍、精密度、加標回收率對方法進行評價，該方法檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.03 mg/kg，在各類原酒和成品白酒中的加標回收率都在94.4%～103.7%，準確度較高，精密度試驗結果的相對標準偏差為2.70%～3.73%（n=6），精密度良好，本實驗與白酒國標檢測方法及已有的相關研究相比，檢出限和定量限有了較大提升，優(yōu)勢明顯，其次用到的儀器設備普及度高，運行和維護成本低，尤其適合不具備條件購買液相色譜-質譜/質譜的眾多中小型釀酒企業(yè)對白酒中甜蜜素的風險控制。