基于蛋白質組學探討丹參飲對高脂血癥模型大鼠血脂異常的調節機制Δ

張玉昆，馮月男，卞敬琦，劉欣欣，肖洪彬，牛雯穎 （黑龍江中醫藥大學實驗實訓中心/黑龍江中醫藥大學教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，哈爾濱 150040）

高脂血癥是一種體內脂質代謝紊亂性疾病，臨床表現為血漿甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）降低[1]。我國成年血脂異常者超過2億人，是心腦血管病易發人群[1—2]。因此，對高脂血癥的發病機制和治療機制進行研究具有重要的社會意義。

丹參飲是治療氣滯血瘀證的經典方劑，具有活血化瘀、行氣止痛之功。臨床和基礎實驗研究發現，丹參飲加減服用月余可明顯降低臨床患者血清TG、TC水平，亦可顯著降低高脂飼料和高脂乳劑誘導的高脂血癥模型大鼠血漿TC、TG、LDL-C水平[3—4]。本課題組前期基礎研究及以往多項研究均證實，丹參飲可以有效改善血脂水平[5—8]。高脂血癥的發生、發展機制極為復雜，但是脂質代謝的相關酶、脂質轉運的相關蛋白具有表達相對穩定、可被檢測等特征，且肝臟是脂質代謝的重要器官。本研究擬通過對高脂血癥模型大鼠肝臟進行蛋白質組學研究，從蛋白質表達譜角度解讀丹參飲治療高脂血癥的靶點蛋白，以期明確丹參飲對高脂血癥模型大鼠血脂異常的調節機制。

1 材料

1.1 主要儀器與軟件

本研究使用的主要儀器與軟件有：C18反相色譜柱、S-3500RS型色譜儀、Q-Exactive Plus型質譜儀、Vanquish Flex型二元超高效液相色譜（UPLC）儀、Xcalibur 4.0數據采集軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司），ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（美國Waters公司），TGL-16G型臺式高速離心機（蘇州捷美電子有限公司），7600-020型全自動生化分析儀（日本株式會社日立高新技術公司），BX43型光學顯微鏡（日本Olympus公司），LE204E型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），iMARK型酶標儀（美國Bio-Rad公司），DYY-7C型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像分析系統、DYCZ-40D型轉移槽（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

丹參飲水煎液由實驗室自制。處方組成為《時方歌括》中原方用量：丹參30 g，檀香3 g，砂仁3 g。以上3味中藥飲片均購自哈爾濱市道外區新安康藥材站，產地分別為山東、云南、廣東，批號分別為210301、210502、210101，經黑龍江中醫藥大學田明教授鑒定，所有飲片均符合2020年版《中國藥典》標準。煎煮工藝：以上處方組成按比例擴大5倍，藥材用8倍量（mL/g）水浸泡0.5 h后，冷凝回流提取2次，合并煎煮液，濃縮煎煮液，最終煎液含生藥質量濃度為0.36 g/mL。

TC、TG、LDL-C、HDL-C試劑盒（批號分別為212027、218061、221651、221751）均購自中生北控生物科技股份有限公司；氨水、四乙基溴化銨（tetraethylammonium bromide，TEAB）緩沖液、碘乙酰胺（批號或貨號分別為P1210525、BCBR4372V、P1806457）均購自德國Sigma公司；改良胰蛋白酶（貨號409668）購自美國Promega公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙酮（批號分別為21190409、21201202）均購自國藥集團上海有限公司；TMT 10PlexTM標記試劑、蛋白酶抑制劑混合物、預染蛋白、乙腈、甲醇、甲酸、去離子水、BCA蛋白檢測試劑盒、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽|[tri（2-carboxyethyl）phosphine hydrochloride，TCEP]溶液、預制聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠（批號或貨號分別為VL320580、410069、983063、211448、213511、215715、210416、UI289351、VG305342、21121170）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔源環氧化物水解酶2（epoxide hydrolase 2，EPHX2）多克隆抗體、兔源圍脂滴蛋白2（perilipin 2，PLIN2）重組抗體、兔源過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）多克隆抗體、兔源糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）多克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（貨號分別為bs-3880R、bsm-54764R、bs-0530R、bs-0028R、bs-0061R、bs-0295G）均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗動物與飼料

42只健康清潔級雄性Wistar大鼠（220～240 g）購自哈爾濱醫科大學，實驗動物生產許可證號為SCXK（黑）2018-003。大鼠飼養于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心。本實驗方案通過黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批件號為2021012802），并嚴格按照倫理委員會批準方案實施。高脂飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，由基礎飼料、蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鈉組成，含量分別為67%、20%、10%、2.5%、0.5%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

42只大鼠在經過7 d適應性喂養后，分為空白組（n＝14）和高脂組（n＝28）。空白組大鼠給予基礎飼料喂食，高脂組大鼠給予高脂飼料喂食。于第8周末檢測造模大鼠的血脂水平，參考第4版《藥理實驗方法學》中標準，當血脂四項中有一項水平異常，則認為造模成功。高脂組造模成功的大鼠根據體重和血脂水平，隨機分為模型組、丹參飲組，繼續喂養高脂飼料。根據前期研究結果，丹參飲臨床等效劑量（3.6 g/kg）為最優劑量（藥效學最顯著）[9]，鑒于本研究目的在于探討丹參飲的對血脂異常的調節機制，因此采用單一劑量（3.6 g/kg）進行蛋白質組學研究。分組后，于第9周開始，丹參飲組大鼠灌胃相應藥液（以蒸餾水為溶劑，按生藥量計，根據臨床等效劑量換算而得），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續4周。

2.2 樣本采集

大鼠給藥第4周后禁食、不禁水，在最后一次給藥30 min后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，在髂主動脈取血，置于含有枸櫞酸鈉的抗凝管中，用于血脂水平檢測。取大鼠部分肝臟組織于－80 ℃凍存用于蛋白質組學研究，剩余肝臟固定位置切成數塊，置于10%中性福爾馬林中用于病理形態觀察。

2.3 大鼠血脂水平檢測

采用全自動生化分析儀檢測。取“2.2”項下抗凝血以3 000 r/min離心12 min后獲取上層血漿，按相應試劑盒說明書要求檢測血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.4 大鼠肝臟組織病理形態學檢測

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察。取“2.2”項下固定位置切塊的肝臟組織適量，經常規包埋，切片，透明，脫蠟，脫水，蘇木精染色8 min；水洗后，伊紅染色2 min；再次水洗，脫水，透明2次；經中性樹膠封片后，置于光鏡下觀察大鼠肝臟組織的病理形態變化情況。

2.5 TMT定量蛋白質組學分析

分別從空白組、模型組和丹參飲組中隨機選取3只大鼠的肝臟樣本進行TMT定量蛋白質組學分析。

2.5.1 樣本質控分析

（1）肝臟樣本蛋白的提取。在冷凍狀態下取出樣本，轉移至振蕩管中；加入適量含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液（8 mol/L尿素+1%SDS）；組織研磨儀上振蕩研磨3次，每次40 s；冰上裂解30 min，每5 min漩渦混勻1次，時長為10 s；以16 000 r/min離心30 min，溫度設置為4 ℃，取上清液備用。（2）BCA法定量蛋白質濃度。應用BCA蛋白檢測試劑盒，并按照要求操作，用酶標儀測得562 nm波長處的吸光度，繪制標準曲線并計算樣本濃度。（3）SDS-PAGE。對9個樣本進行SDS-PAGE（上樣量為15 μg）。（4）樣本處理和液相串聯質譜檢測。①取100 μg蛋白樣本，用裂解液補充體積至90 μL，分別加入終濃度100 mmol/L的TEAB和終濃度10 mmol/L的TCEP，置于37 ℃下反應1 h，再加入終濃度40 mmol/L的碘乙酰胺，避光條件下室溫反應40 min；各管分別加入6倍體積的預冷丙酮，置于－20 ℃條件下沉淀4 h，然后以16 000 r/min離心20 min；棄上清液，沉淀用100 μL 50 mmol/L的TEAB充分溶解，按照樣品質量加入2%胰蛋白酶，在37 ℃條件下酶解過夜。②用TMT試劑標記肽段并進行等量混合，每100 μg多肽加入一管TMT試劑，室溫孵育2 h；加入羥胺，室溫反應15 min，按順序分別標記9個樣本。③利用C18反相色譜柱對肽段進行預分離，用UPLC上樣緩沖液復溶多肽樣本后用C18反相色譜柱進行高pH液相分離。④將分離餾分合并成10個餾分真空離心濃縮后，用質譜上樣緩沖液溶解，進行第二維分析。色譜分離時間為120 min；流動相A為2%乙腈、0.1%甲酸；流動相B為80%乙腈、0.1%甲酸；流速為300 nL/min；質譜掃描范圍為m/z350～1 300；采集模式為數據依賴型采集，Top 20，輸出raw文件，進行數據庫搜索。

2.5.2 差異蛋白分析

經搜庫鑒定和波峰分析，獲得不同樣本中同一蛋白的表達豐度；再進行樣本間蛋白的差異表達分析，篩選出樣本間的差異蛋白。通過設置顯著性差異檢驗方法及蛋白表達量差異倍數，運用統計學方法，獲得顯著差異表達蛋白的信息及差異數據表。

2.6 大鼠肝臟組織中EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ蛋白表達的檢測

采用Western blot法檢測。每組隨機選取3個冷凍肝臟組織樣本，精密稱取100 mg，剪碎，加入組織蛋白裂解液，用研磨儀研磨裂解后，以4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。加蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸變性，SDS-PAGE分離，將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，用封閉液在室溫下搖床封閉1 h；添加一抗（EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ的稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次；特異性蛋白與二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶5 000）室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次；成像系統曝光顯影、拍照。采用PhotoShop整理去色，采用Alpha軟件計算各條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值與內參β-actin蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料滿足正態分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。蛋白質組學通過差異倍數和P值篩選組間差異蛋白。差異分析采用Student’st檢驗，雙尾檢驗，上調差異倍數1.20，下調差異倍數0.83。蛋白質組學中的P＜0.05表示蛋白表達有差異。

3 結果

3.1 丹參飲對大鼠血脂水平的影響

實驗過程中因操作不當每組大鼠有脫落，但例數仍滿足統計學要求。與空白組比較，模型組大鼠血漿TC、TG、LDL-C水平均顯著升高（P＜0.05），血漿HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，丹參飲組大鼠血漿TC、TG、LDL-C水平均顯著降低（P＜0.05），血漿HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較（±s）

表1 各組大鼠血脂水平比較（±s）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組丹參飲組LDL-C/（μmmol/L）0.66±0.14 0.84±0.21a 0.67±0.13b例數9 8 9 TC/（mmol/L）1.62±0.36 2.43±0.72a 1.67±0.54b TG/（mmol/L）0.34±0.12 0.47±0.16a 0.30±0.10b HDL-C/（μmmol/L）1.08±0.15 0.89±0.17a 1.05±0.14b

3.2 丹參飲對大鼠肝臟組織病理形態的影響

HE染色結果顯示，空白組大鼠肝臟組織染色均勻，細胞質、細胞核清晰，肝板呈放射狀排列，肝血竇間隙排列清晰，未見變性和炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肝臟組織染色不均，肝板排列紊亂，肝血竇消失，部分細胞的細胞核固縮或消失，細胞質腫脹、融合，結締組織增生，呈現彌散性空泡樣脂肪滴改變。與模型組比較，丹參飲組大鼠肝臟組織上述病理形態均有不同程度的改善。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理形態顯微圖（HE染色，×400）

3.3 TMT定量蛋白質組學分析結果

3.3.1 樣本質控分析結果

電泳結果顯示，9個樣本電泳圖相對清晰，無拖尾現象，組內條帶相對穩定，可用于后續實驗研究。根據峰形和時間每組共收取20個餾分，合并成10個餾分。結果見圖2。

圖2 9個樣本的SDS-PAGE電泳圖

3.3.2 差異蛋白分析結果

搜庫鑒定結果共鑒定蛋白5 866個。波峰分析結果顯示，模型組和空白組樣本間共篩選出顯著差異表達蛋白298個，相對表達水平顯著升高的蛋白數目為151個，相對表達水平顯著降低的蛋白數目為147個。其中，EPHX2差異倍數為2.5倍，是最顯著的差異蛋白；差異蛋白環加氧酶1（cyclooxygenase 1，COX1）、COX2均處于低表達水平，并與EPHX2在蛋白功能上存在一定聯系。丹參飲組和模型組樣本共篩選出顯著差異表達蛋白139個，相對表達水平顯著升高的蛋白數目為47個，相對表達水平顯著降低的蛋白數目為92個。其中PLIN2差異倍數為0.41倍，是較為顯著的差異蛋白，參與PPAR信號通路，是脂質類代謝的關鍵信號調節通路；GSK-3β差異倍數為1.9倍，也是較為顯著的差異蛋白，其參與調節糖脂代謝。結果見圖3。上述差異蛋白均為表達差異倍數較為顯著的差異蛋白，因此，選擇EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ進行后續試驗驗證。

圖3 差異蛋白火山圖

3.4 大鼠肝臟組織中EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ蛋白表達結果

與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織中EPHX2、PLIN2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），GSK-3β、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，丹參飲組大鼠肝臟組織中EPHX2、PLIN2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），GSK-3β、PPARγ蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠肝臟組織中關鍵差異蛋白表達的電泳圖

圖5 各組大鼠肝臟組織中關鍵差異蛋白表達水平柱狀圖（n＝3）

4 討論

本研究發現模型大鼠血漿中TC、TG、HDL-C、LDLC水平均發生顯著改變，大鼠肝臟病理形態學發生顯著改變，有大量脂肪滴改變，說明高脂飼料喂養引起了模型大鼠血脂水平異常和肝細胞脂肪性改變，通過高脂飼料喂養復制的模型比較成功。通過丹參飲治療后模型大鼠的血脂水平和肝臟組織細胞發生顯著改善，說明丹參飲對高脂血癥有顯著的治療作用。

為了進一步探究丹參飲對高脂血癥的作用機制，筆者對各組大鼠的肝臟組織進行了蛋白質組學研究，結果顯示，模型組和空白組相比較，鑒定到的差異蛋白數量最多，其中EPHX2差異倍數為2.5倍，是最顯著的差異蛋白；丹參飲組與模型組比較，PLIN2和GSK-3β亦是較為顯著的差異蛋白；丹參飲組和模型組差異蛋白的富集信號通路中，PPAR信號通路是與脂質代謝密切相關的信號通路。因此，本研究對以上較為顯著差異蛋白EPHX2、PLIN2、GSK-3β和PPAR信號通路中關鍵蛋白PPARγ進行了蛋白驗證。

EPHX2參與PPARγ信號通路和花生四烯酸代謝信號通路[10]。有研究發現，EPHX2在肥胖人群中高表達，其抑制劑能夠顯著預防高脂飲食引起的脂質代謝紊亂；EPHX2低表達可以緩解肥胖引起的肝脂肪變性、代謝綜合征等疾病；EPHX2能夠降解花生四烯酸，減少體內花生四烯酸濃度，加重冠狀動脈粥樣硬化患者的臨床癥狀[11]。本研究蛋白質組學研究發現，模型組中差異蛋白COX1、COX2屬于環氧化物，均處于低表達，這可能與EPHX2高表達、水解作用增強有關。通過對各組大鼠肝臟組織中關鍵差異蛋白表達水平驗證發現，模型組大鼠肝臟組織中EPHX2相對高表達，說明高脂飲食復制的高脂血癥模型大鼠的血脂水平異常可能與EPHX2高表達有關，而丹參飲的治療作用可能與下調EPHX2表達有關。

GSK-3β在組織中分布廣泛，在調節脂質方面發揮著一定作用。GSK-3β的激活受磷脂酰肌醇3激酶的調節，是蛋白激酶B的下游底物，激活后能夠影響糖原合成和糖異生，影響胰島素分泌，進一步改變脂肪代謝[12]。本研究發現，GSK-3β在空白組和模型組大鼠肝臟組織中表達水平發生顯著改變，說明模型大鼠也發生了糖代謝異常，在后續研究中將進一步探究。

PLIN2參與PPAR信號通路，是脂肪細胞分化的關鍵蛋白。PPARγ在脂肪細胞分化過程中起重要作用，同時影響脂肪氧化和脂肪代謝。PLIN2可以通過上調凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1的表達促進細胞內脂質積聚，參與動脈粥樣硬化；PPARγ抑制劑可以上調PLIN2蛋白表達，并上調涉及脂質攝取、運輸和儲存及脂肪酸合成的多個基因，提高脂肪生成并增加TG水平[13]。本研究中蛋白質組學和Western blot研究均發現，與模型組比較，丹參飲組大鼠肝臟組織中PPARγ表達上調，PLIN2表達下調，說明丹參飲的降脂作用可能與激活PPARγ信號通路并抑制PLIN2表達有關。

綜上所述，丹參飲對高脂血癥模型大鼠血脂水平和肝臟病理形態學均有顯著的改善作用，其調節機制可能與上調PPARγ、GSK-3β表達和下調EPHX2、PLIN2表達有關，涉及的信號通路可能包括PPARγ信號通路。本研究仍存在一定不足：僅對肝臟蛋白質組學表達情況和顯著差異蛋白進行了驗證研究，未對重點的信號通路進行激活或抑制驗證。在后續的研究中，本課題組將開展體外和體內實驗驗證，進一步研究相關信號通路的激活和抑制機制。