痰證的血清生物標記物研究*

黃凱悅,齊景馨,羅文謙,陳梅妹,甘慧娟

(福建中醫藥大學,福建 福州 350122)

中醫學認為痰是機體氣化功能失司致津液輸布、排泄失常,積聚于體內形成的病理產物[1]。“百病皆由痰作祟”,痰致病范圍廣泛,癥狀變化多端,是重要的致病因素[2]。諸多醫家從痰論治疑難雜癥取得顯著療效,但目前有關痰證的客觀化指標尚未完全闡明。代謝組學是一項高通量、高分辨率的分析技術,采用全面、系統、動態的方法預測內源性代謝物的變化水平[3],從整體上揭示機體的生理病理狀態,其研究思路與中醫的整體觀相契合,為中醫證候的客觀化提供重要平臺[4]。代謝組學技術普遍應用于中醫藥領域的研究,在探尋中醫證候的生物標志物中起重要作用[5]。但受人體復雜性及代謝組學檢測手段的限制,目前關于痰證的代謝物尚無統一定論。本研究收集痰證血清代謝組學研究的相關文獻,整理、歸納痰證患者的血清差異代謝產物、組學方法等信息,并進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代謝通路富集分析,探索痰證潛在生物標志物,揭示痰的部分客觀化指標,為臨床治療痰證提供新思路。

1 資料與方法

1.1 文獻來源

以“痰”“痰證”“代謝組學”“代謝物”“血清”“患者”為主題詞,檢索中國知網、萬方數據知識服務平臺、中文科技期刊全文數據庫中痰證患者血清代謝組學研究的相關文獻,檢索時間為建庫至2023年4月30日。

1.2 文獻納入標準

①臨床研究類文獻;②有健康對照病例的文獻。

1.3 文獻排除標準

①綜述類、理論探討類文獻;②動物、細胞實驗類文獻;③重復發表的文獻;④數據不全的文獻。

1.4 文獻篩選

將檢索獲得的相關文獻導入NoteExpress整合、去重。由參與研究的3名成員嚴格按照制定的納入、排除標準對文獻中摘要、關鍵詞及全文內容進行篩選,并交叉核對,刪除不符合要求的文獻。

1.5 文獻數據處理

提取的數據需完全遵循臨床研究文獻中的表達形式,保證原始數據的規范性和真實性[6]。將收集的疾病名、中醫證型、組學方法、血清差異代謝產物、富集通路等信息錄入Excel 2021中,建立痰證潛在生物標記物數據庫,并進行分析。

2 結 果

2.1 文獻篩選結果

共檢索出179篇文獻,其中中國知網41篇、萬方數據知識服務平臺108篇、中文科技期刊全文數據庫30篇,經篩選后最終納入32篇文獻。見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 病種分布及特征

納入的32篇文獻均為原始臨床研究類文獻,經統計分析,發現1篇未涉及具體病種,其余31篇共涉及8個病種。見表1。

表1 病種分布特征

2.3 痰證的臨床證型分布及特征

痰證患者共1 194例,健康人群906例,涉及11種痰證的臨床證型。見表2。

表2 痰證臨床證型的分布特征

2.4 痰證血清差異代謝產物分析

梳理1 194例痰證患者和906例健康人的血清樣本,獲得301個血清差異代謝物。以5篇文獻同時出現為閾值,進行代謝物頻次均值統計分析,獲得24個痰證血清差異代謝物,見表3。

表3 痰證的主要血清代謝物

2.5 痰證差異性代謝通路分析

采用超幾何檢驗對24個痰證血清代謝物進行KEGG代謝通路富集分析[39]得到12條差異性代謝通路與中醫痰證的發生有關。具體包括:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,組氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝,丁酸代謝,谷胱甘肽代謝,糖酵解/糖異生,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成,氨酰tRNA生物合成。富集到的12條差異代謝通路中有8條差異代謝通路受到顯著擾動(影響值>0.1),分別為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(影響值=1.0),苯丙氨酸代謝(影響值=0.36),甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(影響值=0.25),組氨酸代謝(影響值=0.22),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(影響值=0.20),乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝(影響值=0.14),丁酸代謝(影響值=0.11),谷胱甘肽代謝(影響值=0.11)。見圖2。

注：橫坐標表示代謝通路擾動值,縱坐標表示差異性代謝通路名稱;氣泡顏色表示P值,P值越小,顏色越深;富集個數越多,氣泡越大。

3 討 論

《丹溪心法》云:“痰之一物,隨氣升降,無處不到。”即痰可隨氣機升降出入停留于身體不同部位,臨床表現復雜[40]。中醫學認為飲食水谷轉化為水谷精微的過程依賴氣機的正常運行,與現代新型代謝模型相契合,水谷精微即能量物質,飲食水谷轉換為能量物質,再通過脾氣轉輸精微布散全身,濡養五臟六腑。能量物質在體內發生氧化的過程是氣機運行的生理學基礎[41],若飲食攝入過度,機體能量失衡,痰、濕、濁、脂堆積于體內,阻礙氣機運行。近年來,痰證與糖、脂代謝紊亂的關聯性研究是中醫藥研究領域的熱點。研究[42]表明,體重指數(body mass index,BMI)與胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)是痰證的危險因素,HOMA-IR、血脂、BMI等客觀指標也可作為痰證診斷的參考指標[1],表明中醫痰證與糖、脂代謝紊亂密切相關。

本研究發現痰證患者血清氨基酸代謝差異物中谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、組氨酸屬生糖氨基酸,主要通過機體代謝轉化為葡萄糖和糖原;苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、酪氨酸屬生酮氨基酸,主要通過代謝轉化成乙酰輔酶A和乙酰醋酸[43],并在肝臟內產生酮體,若體內酮體過量,則會導致酮血癥和酮癥酸中毒[44]。研究[45-46]顯示,胰島素抵抗與亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸類代謝物密切相關。苯丙氨酸屬芳香族氨基酸,經苯丙氨酸羥化酶的催化轉換為酪氨酸,共同參與機體的糖、脂代謝[36]。體內苯丙氨酸羥化酶缺乏導致機體對飲食攝入的苯丙氨酸不耐受,影響苯丙氨酸代謝,形成高苯丙氨酸血癥,出現不可逆轉的智力障礙[47]。苯丙氨酸、酪氨酸在體內的含量已被證實與胰島素抵抗、肥胖等糖、脂代謝異常的疾病有關。張雯艷等[48]采用低、中、高劑量苯丙氨酸干預C57BL/6J小鼠,發現低、中、高劑量的苯丙氨酸組血糖、血脂均升高,其中低劑量組酪氨酸濃度高于中、高劑量組,表明苯丙氨酸濃度升高可能使機體出現胰島素抵抗、血糖異常、血脂異常等,與痰證的病理機制相一致,進一步說明痰貫穿機體糖、脂代謝全過程[49-50]。亮氨酸是一種支鏈氨基酸,又屬生酮氨基酸,能夠快速分解轉化為葡萄糖,促進肌肉修復。研究[51]發現,支鏈氨基酸濃度升高與胰島素抵抗、2型糖尿病患病風險密切相關,體內循環支鏈氨基酸水平升高,影響糖酵解和脂肪酸氧化,導致線粒體功能障礙,促使胰島素抵抗的形成。王志永[38]利用代謝組學技術探究痰濕體質血清差異代謝物,發現亮氨酸的濃度顯著升高,主要與痰濕質人群體內脂肪代謝異常有關。組氨酸作為肌肽的前體物質,可調節攝食行為和能量代謝,增強機體抗氧化功能。組氨酸代謝途徑的主要調節酶為組氨酸解氨酶,過量的組氨酸可能通過肝臟和皮膚中的組氨酸解氨酶轉化為反式尿苷酸[52]。研究[24]表明,組氨酸在組氨酸脫羧酶的作用下生成組胺,并存在于肥大細胞中,誘導胃黏膜細胞分泌胃蛋白酶原和胃酸,進而表現出多食、易饑等相關癥狀。丙氨酸是葡萄糖和氨基酸代謝產物之一,參與葡萄糖-丙氨酸循環,將肌肉中的氨以無毒的丙氨酸形式經血液循環輸送至肝臟,在肝臟中丙氨酸轉化成丙酮酸,再經糖異生途徑轉化為葡萄糖,為肌肉組織提供能量。丙氨酸的濃度與消耗的葡萄糖成正比,濃度越高消耗的葡萄糖越多,痰證患者血清中丙氨酸的濃度降低,葡萄糖的消耗隨之減少,葡萄糖含量升高,肝內糖異生作用增強,肌肉組織中參與糖無氧酵解的丙酮酸增多。谷氨酸是大腦皮質及神經中樞的重要的神經遞質,影響大腦認知功能。谷氨酸與血氨形成谷氨酰胺,能解除代謝過程中氨的毒副作用,起到護肝的效果。本研究發現,痰證患者血清中谷氨酸代謝紊亂,機體血液中氨的濃度異常,伴疲乏、精神不振等虛性癥狀的出現,這與中醫痰證的病理因素相一致,痰、濁、脂等長期堆積于內,阻滯氣機,血行不暢,久則實轉虛[29]。乳酸是糖異生過程的主要原料及糖酵解過程的最終產物。機體細胞在缺氧或無氧的狀態下加快糖酵解,血清中乳酸水平隨之升高,導致高乳酸血癥的形成。已有研究證實BMI、尿素氮、血酮體是高乳酸血癥的獨立危險因素,并與血糖、血脂異常等代謝紊亂性疾病相關[53]。李修陽等[54]發現多囊卵巢綜合征痰濕證患者血清中的乳酸水平顯著增加,體內糖異生過程受到抑制,出現胸悶、倦怠、四肢乏力等痰濕證的臨床表現。

KEGG代謝通路富集分析顯示有8條差異代謝通路受到顯著擾動,表明這8條差異代謝通路與中醫痰證的發生影響最顯著。痰證對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝通路的影響值達到1.0,說明該代謝通路異常與痰證形成最相關。同時,組氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝,苯丙氨酸代謝通路在本次納入的11篇臨床研究文獻中被重復富集,說明這4條氨基酸相關代謝通路與痰證形成密切相關。

綜上所述,苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、乳酸等代謝物可能是中醫痰證潛在生物標記物。組氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝,苯丙氨酸代謝等代謝通路異常是痰證形成的潛在關鍵機制。本研究整合現有的臨床痰證患者血清代謝組學研究結果,進行數據挖掘和通路富集分析,尋找痰證的潛在生物標記物和關鍵機制,有效解決臨床樣本量不夠多、疾病譜不夠廣、結論不一致、可信度等問題,為中醫證候生物標記物的研究提供了新的思路和方法。