花黃色素調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對冠心病大鼠心肌損傷的影響

包立民 姜焜 王菊 黃方 陳霞

摘要?目的：探討花黃色素（SY）調控腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調節因子1（SIRT1）/核轉錄因子-κB（NF-κB）對冠心病（CHD）大鼠心肌損傷的影響。方法：將60只SD大鼠隨機分為NC組（生理鹽水）、Model組（生理鹽水）、SY組（100 mg/kg）、EX-527組（47 mg/kg SIRT1抑制劑）、SY＋EX-527組（100 mg/kg SY＋47 mg/kg EX-527），每組12只，持續4周給予相應藥物。試劑盒檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平和心肌白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平；蘇木素-伊紅（HE）染色法進行心肌組織病理學觀察；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法檢測心肌細胞凋亡情況；蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌組織AMPK/SIRT1/NF-κB通路相關蛋白表達。結果：與NC組相比，Model組大鼠心肌細胞數量少且排列雜亂，細胞核皺縮，TC、TG、LDL-C、氧化修飾低密度脂蛋白（ox-LDL）、IL-6、TNF-α水平、心肌細胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明顯上升（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及磷酸化-AMPK（p-AMPK）/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。與Model組比較，SY組大鼠心肌細胞數量增多且排列整齊有序，TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌細胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明顯下降（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯上升（P＜0.05）；而EX-527組以上指標呈現相反趨勢。與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠心肌損傷加重，TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌細胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明顯上升（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。結論：SY可能通過調控AMPK/SIRT1/NF-κB通路降低氧化應激，減輕炎癥反應，對冠心病大鼠心肌損傷起到一定改善作用。

關鍵詞?冠心病；花黃色素；腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息調節因子1/核轉錄因子-κB通路；氧化應激；心肌

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.0

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種心血管疾病，其患病率和死亡率極高，因冠心病死亡的人數占全球死亡人數的近三分之一［1］。因此，制定冠心病的預防和治療策略具有重要意義。冠心病通常由動脈粥樣硬化病變造成血管管腔狹窄或阻塞所致，可引起心肌缺血、缺氧或壞死等損傷［2］。花黃色素（safflower yellow，SY）是紅花水溶性提取物的有效成分，主要成分為羥基紅花黃，具有抗氧化［3］、抗凝血［4］、抗肥胖［5］和神經保護［6］等作用。研究發現，羥基紅花黃能夠改善冠心病［7］；香青蘭總黃酮可能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）信號通路，調節能量代謝，發揮其對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用［8］。而關于SY是否可以通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對冠心病大鼠心肌損傷產生影響還不清楚。因此，本研究主要探究SY對冠心病大鼠的影響及其作用機制。

1?材料與方法

1.1?動物

60只無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠購自凌云博際（北京）科技有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0018。本研究已獲得本院動物倫理委員會的批準。

1.2?主要試劑

SY（貨號：YT06466）購自北京伊塔生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（貨號：EK-R36954）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號：EK-R36902）ELISA試劑盒（貨號：EK-R36877）購自上海酶研生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA試劑盒（貨號：CSB-E12146r）購自武漢華美生物工程有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：E03596）購自上海瓦蘭生物科技有限公司，SIRT1（貨號：ab110304）、AMPK（貨號：ab32047）、磷酸化-AMPK（p-AMPK）（貨號：ab133448）、NF-κB（貨號：ab32360）、磷酸化-NF-κB（p-NF-κB）（貨號：ab239882）、GAPDH兔多克隆抗體（貨號：ab9485）均購自英國Abcam公司。

1.3?冠心病大鼠模型構建及實驗分組

參照文獻［1］構建冠心病大鼠模型，即通過喂食高脂食物30 d［（蛋黃粉（10%）、膽固醇（2%）、拉多爾（10%）、丙基硫氧嘧啶（0.2%）、膽酸鈉（0.5%）、正常飲食（77.3%）］，第31、32 d腹腔注射腦后垂體素（30 U/kg），構建冠心病模型。NC組飼喂正常飲食，且同步腹腔注射生理鹽水（30 U/kg），根據心電圖判斷建模是否成功［9］。將造模成功的48只SD大鼠隨機分為Model組、SY組、EX-527組、SY＋EX-527組，每組12只。SY組灌胃100 mg/kg SY［10］并腹腔注射生理鹽水；EX-527組灌胃生理鹽水并腹腔注射47 mg/kg EX-527［11］；SY＋EX-527組灌胃100 mg/kg SY并腹腔注射47 mg/kg EX-527，CN組和Model組（各12只）灌胃（10 mL/kg）并腹腔注射生理鹽水（2 mL/kg），每日1次，持續4周。

1.4?標本采集

最后1次灌胃SY后，采用尾靜脈采血法抽取血液，室溫靜置1 h后經離心機分離血清，置于－20 ℃保存。每組取6只大鼠的心肌組織固定于4%多聚甲醛中，剩余6只大鼠心肌組織儲存于－80 ℃。

1.5?血清脂代謝水平檢測

取出1.4保存的血清按照ELISA試劑盒說明書檢測TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平。

1.6?心肌組織炎性因子及氧化應激指標的檢測

取1.4冷凍保存的心肌組織，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠心肌組織中SOD、GSH-PX水平以及炎性因子IL-6、TNF-α水平。

1.7?心肌細胞形態觀察

取固定后的心肌組織，經常規脫水、浸蠟、包埋、切片、制片等過程，用蘇木精和伊紅染色后在光學顯微鏡下進行心肌組織病理變化的觀察。

1.8?心肌細胞凋亡情況

取1.7的心肌組織切片，按照TUNEL試劑盒操作過程，TUNEL陽性細胞核用綠色熒光染色，總心肌細胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡率為TUNEL陽性細胞/DAPI染色細胞×100%。

1.9?蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測AMPK/SIRT1/NF-κB通路相關蛋白表達

取大鼠心肌組織勻漿，用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將蛋白質進行變性、定量、電泳、轉膜，將膜室溫封閉3h后分別加入一抗AMPK（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、SIRT1（1∶2000）、NF-κB（1∶2000）和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶4 000），室溫孵育3h，加入ECL試劑顯影后。使用Image LabTM軟件分析目標蛋白的灰度值。

1.10?統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行數據統計分析，數據以平均值±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示統計學差異顯著。

2?結?果

2.1?SY對大鼠脂代謝水平的影響

與NC組相比，Model組大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明顯上升（P＜0.05）；與Model組相比，SY組大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明顯降低（P＜0.05），EX-527組大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明顯升高（P＜0.05）；與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明顯上升（P＜0.05）。詳見表2。

2.2?SY對大鼠心肌炎性因子的影響

與NC組相比，Model組大鼠IL-6和TNF-α水平明顯上升（P＜0.05）；與Model組相比，SY組大鼠IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），EX-527組大鼠IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠IL-6和TNF-α水平明顯上升（P＜0.05）。詳見表3。

2.3?SY對大鼠心肌氧化應激指標的影響

與NC組相比，Model組大鼠SOD和GSH-PX水平明顯降低（P＜0.05）；與Model組相比，SY組大鼠SOD和GSH-PX水平明顯升高（P＜0.05），EX-527組大鼠SOD和GSH-PX水平明顯降低（P＜0.05）；與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠SOD和GSH-PX水平明顯降低（P＜0.05）。

2.4?SY對大鼠心肌組織形態的影響

NC組大鼠心肌細胞結構正常、排列井然有序，細胞核膜染色清晰；與NC組相比，Model組大鼠心肌組織結構異常，細胞數量減少且排列雜亂，細胞核皺縮；與Model組比較，SY組大鼠心肌細胞結構正常，染色清晰，EX-527組大鼠心肌細胞出現明顯的壞死現象；與SY組相比，SY＋EX-527組心肌損傷加重。詳見圖1。

2.5?SY對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與NC組相比，Model組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與Model組相比，SY組大鼠心肌細胞凋亡率明顯下降（P＜0.05），EX-527組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表5。

2.6?HDN對大鼠心肌組織p-AMPK、AMPK、SIRT1、NF-κB蛋白表達的影響

與NC組相比，Model組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與Model組相比，SY組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯升高（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明顯下降（P＜0.05），EX-527組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表6、圖3。

3?討?論

動脈粥樣硬化是外周血管疾病發生的主要原因，斑塊使冠狀動脈管腔狹窄，引發偶發性或持續性心絞痛；一旦破裂，血栓阻塞血流，導致心肌梗死甚至死亡［12］。因此，防治冠心病是臨床目前急需解決的問題之一。動脈粥樣硬化主要特征是高脂血癥和炎癥，且動脈斑塊主要由脂質細胞、鈣細胞和炎癥細胞組成［12］。LDL-C是血清脂質中最重要的標準［13］，LDL-C在冠心病的發生和進展中起重要作用［14］。氧化應激和活性氧在動脈粥樣硬化的發展中起重要作用，可促進LDL轉變為ox-LDL。ox-LDL被巨噬細胞清除受體吸收，導致動脈粥樣硬化［15］。本研究通過高脂飲食構建冠心病大鼠模型，結果顯示，與NC組相比，Model組大鼠SOD、GSH-PX水平明顯下降，TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平明顯升高，心肌細胞數量減少，且細胞核皺縮，細胞排列雜亂，表明冠心病模型構建成功，Model組大鼠存在高脂血癥且抗氧化水平有限。而SY干預可有效降低冠心病大鼠脂質水平，并提高其抗氧化水平，這可能是其改善冠心病大鼠心肌損傷的機制。炎性因子可促進冠狀動脈病變的形成，還可促進內膜的增殖并誘導平滑肌細胞向內膜增殖、遷移，加重病變［16］。細胞凋亡對冠狀動脈疾病的病理狀況也起著至關重要的作用；抑制心肌細胞凋亡可以對冠心病大鼠起到一定的保護作用［17］。本實驗結果顯示，與NC組相比，Model組大鼠IL-6、TNF-α水平及心肌細胞凋亡率明顯升高，與以往研究一致。研究發現SY可以通過減輕炎癥反應大鼠改善心肌缺血再灌注損傷［18］。本研究發現，與Model組比較，SY組大鼠心肌細胞數量增多且排列整齊有序，結構完整，IL-6、TNF-α水平以及心肌細胞凋亡率明顯下降，提示SY還可通過減輕炎癥反應，抑制細胞凋亡來緩解冠心病大鼠心肌損傷。

能量代謝是心肌細胞參與各種活動的基礎，AMPK和SIRTI在調節細胞代謝和氧化應激損傷中起著至關重要的作用［19］；通過激活AMPK/SIRTl通路可減輕氧化應激及線粒體凋亡，從而改善腦血管內皮細胞損傷［20］。郭偉偉等［21］研究發現激活AMPK通路能改善冠心病大鼠心肌損傷。本研究發現，與NC組相比，Model組大鼠NF-κB水平明顯上升，p-AMPK/AMPK和SIRT1水平明顯下降，而SY干預后NF-κB水平明顯下降，p-AMPK/AMPK和SIRT1水平明顯上升，推測SY可能通過調控AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路，抑制冠心病大鼠心肌細胞損傷。為了驗證該推測，本研究利用AMPK/SIRT1/NF-κB通路抑制劑EX-527干預發現，與SY組相比，SY＋EX-527組大鼠心肌損傷加重，TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平、心肌細胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明顯上升，SOD、GSH-PX水平、p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明顯下降，表明EX-527可減弱SY對冠心病大鼠心肌損傷的保護作用。證實了EX-527可能通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB通路對冠心病大鼠起到一定保護作用。另有研究發現，紅花黃色素還可以通過抑制MALAT1/NLRP3信號通路減輕肺栓塞大鼠相關心臟損傷［10］，提示SY還可能通過抑制其他通路改善冠心病大鼠心臟損傷，有待進一步研究。

綜上所述，SY可能通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB通路，提高冠心病大鼠心肌的抗氧化水平，減輕其炎癥反應，從而改善心肌損傷。然而，SY調控冠心病大鼠可能涉及其他通路，有待后續進一步探究。

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基金項目?湖北省自然科學基金（No.WJ2018Z0118）

作者單位?1.黃石市第二醫院（湖北黃石 435002）；2.湖北文理學院附屬醫院，襄陽市中心醫院（湖北襄陽 441021）

通訊作者?陳霞，E-mail：xyzxcx003851@163.com

引用信息?［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：-.

（收稿日期：2022-07-14）

（本文編輯王麗）