產(chǎn)香酵母的篩選及其在液態(tài)食醋釀造中的應(yīng)用

杜琳琳,于鑫,劉麗萍,朱立磊,趙祥穎,*,張穎超,韓墨,劉建軍

1(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,山東 濟(jì)南,250013)

2(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南,250013)

3(山東玉兔食品股份有限公司,山東 淄博,255300)

食醋的生產(chǎn)及消費(fèi)在我國(guó)歷史悠久,是一種深受消費(fèi)者青睞的調(diào)味品。我國(guó)傳統(tǒng)食醋生產(chǎn)以固態(tài)發(fā)酵為主[1]。固態(tài)發(fā)酵是一種粗放式發(fā)酵方式,使用的酒曲微生物菌群豐富,酒曲以及環(huán)境中諸多產(chǎn)風(fēng)味化合物的微生物參與了醋的生產(chǎn)過程,所以固態(tài)醋的風(fēng)味較好[2-3]。但固態(tài)工藝存在生產(chǎn)環(huán)境差、發(fā)酵周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、機(jī)械化程度低、產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定、規(guī)模擴(kuò)大受到限制等不足。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,目前液態(tài)食醋工藝已逐步成為主要的食醋生產(chǎn)方式,該工藝糖化、發(fā)酵劑分別采用淀粉酶制劑和釀酒酵母,再接種醋酸菌進(jìn)行深層通風(fēng)醋酸發(fā)酵,基本屬于純種發(fā)酵工藝。與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝相比,盡管克服了固態(tài)工藝的諸多不足,但參與發(fā)酵過程的微生物只有釀酒酵母和醋酸菌,所以使得構(gòu)成產(chǎn)品風(fēng)味的有機(jī)酸和風(fēng)味化合物含量偏低,產(chǎn)品的整體風(fēng)味不足[4]。因此,強(qiáng)化液態(tài)食醋發(fā)酵功能微生物,改善提升液態(tài)食醋風(fēng)味品質(zhì)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本研究旨在分離篩選適應(yīng)于食醋生產(chǎn)環(huán)境的產(chǎn)香微生物,應(yīng)用于液態(tài)食醋生產(chǎn),改善提升液態(tài)發(fā)酵醋的風(fēng)味品質(zhì)。本文從酒曲樣品中,以產(chǎn)酯能力為篩選指標(biāo),分離獲得一株產(chǎn)香酵母菌株-光滑假絲酵母HQ9,研究考察了其在液態(tài)食醋釀造中的應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、酒曲,山東淄博玉兔食品有限公司;有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品、2-辛醇(色譜級(jí)),上海麥克林生化科技有限公司;液化酶、糖化酶,諾維信生物技術(shù)有限公司;其他試劑來自國(guó)藥集團(tuán)。除另有說明,所有試劑均為分析純。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)JM12、醋酸桿菌(Acetobacteraceti)SFC-YT19,實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,118 ℃滅菌20 min。

YPD固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,瓊脂20.0,118 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酯培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖150.0,蛋白胨10.0,酵母提取物10,118 ℃滅菌20 min。

醋酸菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,酵母提取物10.0,118 ℃滅菌20 min,滅菌后加入無水乙醇60.0。

1.3 儀器與設(shè)備

湘儀L530離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;分光光度計(jì),上海尤尼科儀器有限公司;Alphaclean1300潔凈工作臺(tái),力康精密儀器(上海)有限公司;恒溫?fù)u床,上海知楚儀器有限公司;GC7890B氣相色譜儀,CYCLODEX-B色譜柱,美國(guó)Agilent公司;UltiMate 3000液相色譜儀,HPX-87H色譜柱,美國(guó)Thermo Scientific公司;固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)裝置,Supleco公司;Trace130-TraceIS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,賽默飛世爾科技有限公司;FlavourSpec風(fēng)味分析儀,山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)香酵母的分離和篩選

取酒曲樣品加入無菌生理鹽水充分振蕩,稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑取具有典型酵母形態(tài)特征的單菌落,純化后低溫保存?zhèn)溆肹5]。將保存菌株轉(zhuǎn)接活化1次,接種于產(chǎn)酯培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)72 h,發(fā)酵液離心去菌體,上清液通過人工嗅聞、總酯測(cè)定等方法,篩選香氣濃郁和產(chǎn)酯高的菌株。

1.4.2 菌株形態(tài)觀察和鑒定

將篩選獲得的產(chǎn)香酵母菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落和菌體形態(tài)。同時(shí)將活化的菌種接種YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h,離心收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,委托派森諾生物科技公司進(jìn)行ITS rDNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性BLAST比對(duì)。

1.4.3 菌株生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性

將供試菌株的甘油管菌種在YPD液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接活化一次,然后按5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于不同的測(cè)試用YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后600 nm處測(cè)定OD值。通過細(xì)胞生長(zhǎng)情況考察菌株生長(zhǎng)最適溫度和pH以及對(duì)葡萄糖和乙醇耐受性[6]。

1.4.4 菌株HQ9在液態(tài)食醋釀造中的應(yīng)用研究

種子液制備:將HQ9酵母菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心收集菌體,重懸于無菌生理鹽水中,調(diào)整細(xì)胞濃度約1×108cells/mL;釀酒酵母JM12按照相同的方法制備種子液;醋酸桿菌SFC-YT19接入醋酸發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h,制成醋酸菌種子液。

酒精發(fā)酵[7]:將大米和水按照1∶3(g∶mL)的比例混合,室溫浸泡16～18 h,打漿。混合米漿中加入適量中溫α-淀粉酶,88～90 ℃液化30 min,分裝后滅菌,冷卻至60 ℃后加入150 U/g糖化酶,自然冷卻至室溫分別接種5%(體積分?jǐn)?shù))制備的HQ9和JM12種子液,30 ℃下靜置發(fā)酵6～8 d,制得米酒。

醋酸發(fā)酵:酒精發(fā)酵結(jié)束后,取發(fā)酵醪過濾除掉大米殘?jiān)?清液加適量的無菌水調(diào)整酒精度為6%～7%,按10%接種量接入醋酸桿菌SFC-YT19種子液,于30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)至酸度達(dá)到4～8 g/100 mL時(shí),加入2% NaCl終止培養(yǎng),制得米醋。

1.5 分析方法

1.5.1 總酯含量測(cè)定

發(fā)酵液總酯含量測(cè)定參考CHEN等[8]的方法。取1 mL除菌體后的發(fā)酵液加入9 mL去離子水,滴加1～2滴酚酞,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(C)滴定至粉紅色,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(Va)置于30 ℃下皂化過夜,再用0.1 mol/L H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液(C1)反向滴定至紅色剛剛消失。記錄消耗的H2SO4溶液體積Vb,空白培養(yǎng)基作對(duì)照。以乙酸乙酯計(jì),總酯含量的計(jì)算如公式(1)所示:。

(1)

式中:88.12為乙酸乙酯的摩爾質(zhì)量分?jǐn)?shù),g/mol。

1.5.2 總酸含量測(cè)定

總酸參考GAO等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。將除菌體后的醋酸發(fā)酵液適當(dāng)稀釋,用0.01 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,總酸以乙酸計(jì)。

1.5.3 乙醇濃度測(cè)定

發(fā)酵液離心去菌體,取2 mL清液按1∶1比例加入乙酸乙酯萃取,用正丁醇作為內(nèi)標(biāo)。用氣相色譜分析,FID檢測(cè)器,CYCLODEX-B色譜柱;氮?dú)庾鳛檩d氣(1.5 mL/min);進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為220 ℃;柱溫為50 ℃(5 min),以30 ℃/min逐級(jí)增加升溫為240 ℃(3 min)。內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5.4 葡萄糖和有機(jī)酸含量測(cè)定

發(fā)酵液離心去菌體,取上清液適當(dāng)稀釋,采用HPLC分析,色譜柱HPX-87H,流動(dòng)相0.05 mol/L H2SO4。色譜條件:進(jìn)樣量20 μL,流速0.6 mL/min。葡萄糖糖分析采用示差檢測(cè)器(RID-10A),檢測(cè)溫度為65 ℃;有機(jī)酸分析采用UV檢測(cè)器(UltiMateTM3 000 VWD),檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,檢測(cè)溫度為35 ℃。采用外標(biāo)法定量。

1.5.5 米醋中揮發(fā)物分析

參考呂想等[10]的方法,采用頂空-氣相色譜-離子遷移(headspace gas chromatography ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)測(cè)定食醋中揮發(fā)性物質(zhì)。醋酸發(fā)酵液離心去菌體,取5 mL清液加入碳酸氫鈉中和,加入頂空樣品瓶中在60 ℃下500 r/min孵育15 min,在85 ℃下自動(dòng)進(jìn)樣500 μL。MXT-5毛細(xì)管柱(15 m,0.53 mm ID,1 μm FT);柱溫60 ℃;載氣/漂移氣N2(99.999%)。IMS溫度:45 ℃,以正離子模式;載氣體積流量為0～2 min,2 mL/min;2～20 min,2～100 mL/min;20～30 min,100 mL/min;漂移氣流量為150 mL/min。采用正構(gòu)酮C4～C9校準(zhǔn)液計(jì)算各物質(zhì)的保留指數(shù)(retention index, RI),基于NIST的RI和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性。

1.5.6 感官評(píng)價(jià)

所用米醋樣品均由10名專業(yè)評(píng)委組成得小組進(jìn)行評(píng)估(5名女性和5名男性),他們被認(rèn)為對(duì)區(qū)分氣味敏感。在向評(píng)委展示之前,樣品被倒入玻璃杯中,隨機(jī)編號(hào)。所有評(píng)委根據(jù)米醋的味道和香氣,使用0(非常差)～8(優(yōu)秀)等級(jí)評(píng)分[11]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 2023軟件(OriginLab,Northampton)對(duì)數(shù)據(jù)作圖;IMS儀器軟件Gallery Plot插件繪制指紋圖譜;SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差顯著性分析。數(shù)值表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母的分離、篩選及鑒定

從幾種食醋發(fā)酵常用大曲中通過平板分離共篩選到24株酵母菌,隨后對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酯能力進(jìn)行考察。通過感官嗅聞選擇其中6株香氣愉悅且特征鮮明的菌株,對(duì)其發(fā)酵液中總酯和乙醇含量進(jìn)行分析,結(jié)果見表1。由表1看菌株HQ9總酯產(chǎn)量最高,達(dá)到(7.46±0.87) g/L,和文獻(xiàn)報(bào)道的生香酵母相比總酯產(chǎn)量比較高[13-14]。另外,HQ9還具有較好的酒精生產(chǎn)能力,乙醇產(chǎn)量達(dá)到(61.02±0.81) g/L。而菌株JQ6乙醇產(chǎn)量最高,達(dá)(68.24±0.57) g/L,但產(chǎn)總酯僅為(2.69±0.45) g/L,綜合分析,從改善產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)角度,選擇HQ9酵母菌株為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

表1 篩選菌株產(chǎn)酯、產(chǎn)醇和香氣評(píng)價(jià)Table 1 Screening strain ester production, alcohol production and aroma evaluation

菌株HQ9在YPD固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h后,其結(jié)果如圖1所示。菌落呈現(xiàn)圓形、乳白色、表面凸起、光滑,邊緣整齊,菌體細(xì)胞呈圓形或橢圓形,出芽繁殖,通過ITS rDNA序列測(cè)定和分析HQ9菌株初步鑒定為光滑假絲酵母(Candidaglabrata)。

圖1 菌株HQ9的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

2.2 菌株HQ9生長(zhǎng)特性

米醋生產(chǎn)過程酵母的生長(zhǎng)代謝與環(huán)境密切相關(guān)。食醋釀造酒精發(fā)酵階段屬于高糖、高乙醇含量以及偏酸性環(huán)境,用于生產(chǎn)過程強(qiáng)化的微生物菌株需要具有對(duì)生產(chǎn)環(huán)境條件的適應(yīng)和耐受能力。菌株HQ9在不同起始葡萄糖質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)情況如圖2-a所示,在起始糖質(zhì)量濃度150 g/L時(shí),菌體濃度最高,且在300 g/L糖質(zhì)量濃度高滲環(huán)境中仍能生長(zhǎng),說明菌株具有一定高滲透壓耐受性。如圖2-b所示,隨著培養(yǎng)基乙醇濃度增加HQ9生長(zhǎng)雖然逐步受到抑制,但在200 g/L的高質(zhì)量濃度乙醇環(huán)境中仍能生長(zhǎng),表明HQ9能夠很好地適應(yīng)酒精發(fā)酵環(huán)境。菌株HQ9在不同溫度下生長(zhǎng)情況如圖2-c所示,菌株HQ9生長(zhǎng)溫度范圍較寬,最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃,但在40 ℃仍能很好的生長(zhǎng);同時(shí),菌株HQ9 pH值適應(yīng)性考察結(jié)果見圖2-d,pH值適應(yīng)范圍較寬,最適生長(zhǎng)pH為4.0～5.0,當(dāng)pH為2.0～3.0仍然生長(zhǎng)良好,說明菌株HQ9具備良好的耐酸能力。

a-葡萄糖質(zhì)量濃度;b-乙醇質(zhì)量濃度;c-溫度;d-pH值

2.3 菌株HQ9在液態(tài)米醋釀造中的應(yīng)用

2.3.1 米醋的制備

以釀酒酵母JM12為對(duì)照,比較研究考察了菌株HQ9酒精發(fā)酵進(jìn)程,2株菌株發(fā)酵過程葡萄糖消耗和乙醇生產(chǎn)速率分別見圖3-a和圖3-b。結(jié)果顯示,釀酒酵母JM12酒精發(fā)酵能力更強(qiáng)、速度更快,6 d內(nèi)酒精發(fā)酵基本結(jié)束,產(chǎn)率達(dá)到(11.75±1.8)%;HQ9發(fā)酵速度略慢,但仍有較高的乙醇產(chǎn)率,達(dá)到(10.65±2.8)%,并且產(chǎn)酯類物質(zhì)能力較好達(dá)到160.97 μg/kg,能夠滿足醋酸發(fā)酵需求,具有應(yīng)用于液態(tài)米醋生產(chǎn)的良好潛力。酒精發(fā)酵完成后,過濾去除米渣,濾液加入無菌水調(diào)整酒精度為6%～7%,接入醋酸桿菌SFC-YT19搖床培養(yǎng)至酸度達(dá)到4～8 g/100 mL結(jié)束發(fā)酵離心去菌體,然后對(duì)醋酸發(fā)酵液進(jìn)行分析。

2.3.2 米醋有機(jī)酸分析

米醋總酸和有機(jī)酸含量液相色譜分析結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,生香酵母可代謝產(chǎn)生風(fēng)味有機(jī)酸類,有機(jī)酸又可被轉(zhuǎn)化生成酯類、醛類等風(fēng)味物質(zhì),影響食醋整體品質(zhì)。菌株HQ9酒精發(fā)酵獲得的醋酸發(fā)酵液總酸含量和醋酸含量比菌株JM12稍低,但其他有機(jī)酸含量較JM12有所增加。單純醋酸刺激性強(qiáng),檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等不揮發(fā)酸的存在可以緩和醋酸刺激性,使食醋的味道更柔和豐富[15]。

表2 米醋樣品中有機(jī)酸種類和含量 單位:g/LTable 2 Types and contents of organic acids in rice vinegar samples

2.3.3 菌株HQ9對(duì)米醋揮發(fā)性物質(zhì)的影響

采用HS-GC-IMS技術(shù)分析2種食醋樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。將菌株HQ9應(yīng)用發(fā)酵米醋,樣品中共檢測(cè)到55個(gè)共有香氣成分,其中醇類7種、酯類13種、醛類6種、酮類9種、酸類2種,呋喃類2種和其他4種,未定性12種(未定性未列出),結(jié)果見表3。菌株JM12酒精發(fā)酵米醋樣品酯類中除乳酸乙酯含量較高外,其他酯類含量大多都低于HQ9酒精發(fā)酵樣品,7種醇類物質(zhì)只有異丁醇高于HQ9,而醛類和酮類物質(zhì)JM12含量相對(duì)高些,6種醛類化合物有苯甲醛等3種高于HQ9,9種酮類化合物有3-羥基丁酮等6種高于HQ9發(fā)酵,所以釀酒酵母JM12酒精發(fā)酵所制得米醋樣品的醇和酯含量低于HQ9,醛酮類物質(zhì)含量高于HQ9發(fā)酵。醇類和酯類是食醋中占比最大的風(fēng)味物質(zhì),酯類物質(zhì)可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的水果香味和花香味[16],適量高級(jí)醇可以增加食醋香氣濃厚感[17],豐富了食醋香味層次。結(jié)果如圖4、圖5所示,從2種食醋樣品的揮發(fā)物指紋圖譜比較和主成分差異性分析也可以看出2組米醋風(fēng)味差異明顯。

圖4 不同米醋樣品中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜

圖5 不同米醋樣品的主成分分析圖

表3 米醋揮發(fā)性成分種類及含量變化Table 3 The variation of volatile components species and content in rice vinegar

2.3.4 感官品評(píng)

在儀器分析的基礎(chǔ)上,本文對(duì)HQ9菌株發(fā)酵酒精制得的米醋樣品進(jìn)行了感官品評(píng),結(jié)果如圖6所示,2種米醋樣品外觀色澤差異不明顯,而口感和香氣方面,菌株JM12酒精發(fā)酵米醋樣品酸味刺激性較強(qiáng),香氣稍顯單薄。相比之下,以HQ9酒精發(fā)酵米醋樣品具有蘋果果香,花果香更濃郁,口感和味道都優(yōu)于菌株JM12樣品組。

圖6 米醋感官品評(píng)結(jié)果

3 結(jié)論

酒精發(fā)酵是食醋釀造的關(guān)鍵工藝之一,傳統(tǒng)食醋多采用釀酒曲作為發(fā)酵劑,為了簡(jiǎn)化工藝、提高效率,也可以使用釀酒酵母進(jìn)行純種發(fā)酵,采用普通釀酒酵母酒精發(fā)酵速度快,但酒體香氣單薄,嚴(yán)重影響食醋的品質(zhì)。篩選具有優(yōu)秀產(chǎn)酯能力的菌株進(jìn)行酒精發(fā)酵或輔助發(fā)酵是改善食醋風(fēng)味品質(zhì)的重要手段之一[18-20]。本文采用人工嗅聞結(jié)合儀器分析從釀酒曲中篩選到一株光滑假絲酵母菌株HQ9,以含15%葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行搖甁培養(yǎng),菌株HQ9產(chǎn)總酯達(dá)(7.46±0.87) g/L,研究發(fā)現(xiàn)該菌株同時(shí)具有乙醇發(fā)酵能力,乙醇產(chǎn)率達(dá)(61.02±0.81) g/L,對(duì)30%(體積分?jǐn)?shù))葡萄糖濃度的高滲透壓、20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇濃度等環(huán)境具有良好的耐受性,能夠很好地適應(yīng)液態(tài)食醋的生產(chǎn)環(huán)境。以釀酒酵母JM12為對(duì)照,考察了HQ9用于米醋發(fā)酵對(duì)食醋風(fēng)味的影響。有機(jī)酸分析結(jié)果顯示,HQ9酒精發(fā)酵所制米醋樣品醋酸含量略低,但檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等非揮發(fā)性酸含量較高,酸味更柔和。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)JM12酒精發(fā)酵米醋樣品醛酮類物質(zhì)含量高于HQ9發(fā)酵樣品,但醇和酯含量均低于HQ9。感官評(píng)價(jià)顯示HQ9酒精發(fā)酵所制得米醋香氣濃郁、酸味柔和、整體味道愉悅,可以明顯提升液態(tài)米醋的感官品質(zhì)和風(fēng)味。研究結(jié)果表明,產(chǎn)香酵母HQ9菌株具有良好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。