木霉微生物菌肥的制備及對玉米莖腐病的應用評價

郭寧 孫華 馬紅霞 石潔 張海劍 劉樹森 董躍廣 溫佳宇

摘要? 以前期分離鑒定的生防菌株非洲哈茨木霉Tr35為研究對象，通過載體的篩選，制備木霉菌劑和木霉微生物菌肥。通過測定不同含量的木霉菌劑和木霉有機肥的株高、根長和鮮重，篩選促生效果明顯的處理，并通過室內盆栽試驗，評價其對玉米苗期莖腐病的防效。結果顯示，玉米秸稈粉具有吸水性強、對Tr35無毒和高釋放率的優點，與Tr35共同發酵制備木霉菌劑，當土與菌劑為5∶1時，促生效果明顯，并對玉米苗期莖腐病防效達51.77%。菌劑土與腐熟羊糞為7∶1時的木霉有機肥促生效果最好，以該比例制備木霉微生物菌肥，對玉米苗期莖腐病防效達61.31%，該研究結果為Tr35菌劑和菌肥的應用開發提供了一定的前期基礎。

關鍵詞? 玉米；非洲哈茨木霉；木霉菌劑；木霉微生物菌肥；玉米莖腐病

中圖分類號? S435.131? 文獻標識碼 ?A? 文章編號? 0517-6611（2024）09-0121-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Preparation of Trichoderma Microbia-fertilizer and Evaluation of Its Application to Maize Stalk Rot

GUO Ning， SUN Hua， MA Hong-xia et al

（Plant Protection Institute， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Innovation Center of Hebei Province/International Science and Technology Joint Research Center on IPM of Hebei Province， Baoding， Hebei? 071000）

Abstract? In the study， Tichoderma afroharzianum Tr35 obtained in the early stage was selected as the research object. Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer were prepared through carrier screening. By measuring the plant height， root length and fresh weight of Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer with different contents， the treatments with obvious growth promotion effect were screened， and the control effect of Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer on stalk rot of maize seedling was evaluated through indoor pot experiment. The results showed that maize stalk powder had the advantages of strong water absorption， non-toxic to Tr35 and high release rate.and co-fermented with Tr35 to prepare Trichoderma agent， had a significant growth promoting effect when the soil to fertilizer was 5∶1， and achieved 51.77% prevention effect on maize seedling stalk rot. The best growth promotion effect was achieved when the agent soil was 7∶1 with rotted sheep manure， Trichoderma microbial fertilizer was prepared in this proportion and the prevention effect of stalk rot on maize seedling reached 61.31%. The results provided a preliminary basis for the application and development of Tr35 agent and microbial fertilizer.

Key words? Maize;Tichoderma afroharzianum;Trichoderma agent；Trichoderma microbial fertilizer；Maize stalk rot

基金項目? 河北省省級科技計劃（20326516D）。

作者簡介? 郭寧（1983—），女，蒙古族，遼寧本溪人，副研究員，碩士，從事玉米病蟲害研究。*通信作者，研究員，碩士，從事玉米病蟲害研究。

收稿日期? 2023-06-22

玉米是我國重要的糧、飼、經兼用型作物，玉米產業的可持續發展對保障我國糧食安全、促進農業發展起著至關重要的作用。

玉米莖腐病又稱莖基腐病、青枯病，是世界范圍內的一種典型土傳病害，在我國各大玉米種植區均有發生，一般年份田間發病率在5%～10%，重發生年份田間發病率可達20%～30%，一些高感品種的發病率甚至達40%～100%［1-2］。目前，玉米莖腐病主要采用化學防治，但化學防治效果不顯著，同時長期、大量化學藥劑的施用導致的環境污染、農藥殘留以及食品安全等問題也隨之而來。

木霉菌防治玉米莖腐病在國內外已有相關研究［3-8］，但由于生防菌施入環境后往往受土壤、氣候和人為條件等因素的影響，在土壤中難定殖、防效不穩定，很難達到理想效果，大部分仍停留在實驗室研究階段，很難大面積推廣應用，因此，目前國內并沒有在玉米上登記使用的木霉菌菌劑。

研究表明，將生防菌添加到有機物料中是一種促進生防菌定殖并穩定發揮防效的重要方法［9］。微生物菌肥是一種環境友好的新型生物肥料，是將具有促生和抗病特性的微生物菌株，添加到有機物料中進行發酵而形成的一種有機肥料［10］。其中的微生物可以在土壤中大量繁殖，改善土壤環境，激發土壤活力，提高土壤肥力，起到促進植物生長和抑制有害病菌的目的。關于防治玉米莖腐病的玉米菌肥研究較少，因此，創制防治玉米莖腐病的生物菌肥具有重要意義。

筆者以非洲哈茨木霉為主要成分研制木霉菌劑及木霉微生物菌肥，并測試其對玉米莖腐病的防治效果，以期為后續生防菌肥的研發和推廣應用提供依據，并為玉米莖腐病的生物防治提供理論支撐。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 菌株。

玉米莖腐病病原菌禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和非洲哈茨木霉菌（Tichoderma afroharzianum）Tr35均由河北省農林科學院植物保護研究所分離并保存。

1.1.2? 玉米品種。

鄭單958，河南金博士股份有限公司

1.1.3? 供試載體。

生物炭、腐熟雞糞、腐熟羊糞、酒糟、玉米秸稈粉、麥麩、花生殼、泥炭土、腐質酸9種載體均為市購。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 供試菌株孢子發酵液的制備。

將Tr35接種于PDA平板，在28 ℃黑暗條件下培養4～7 d，待菌落充分生長，在其邊緣打取菌餅（直徑0.5 cm）10個，接種于PD液體培養基中（100 mL PD/250 mL三角瓶），于28 ℃、180 r/min振蕩培養5 d。過濾去除菌絲體，得到孢子發酵液。將孢子濃度稀釋成1×106個/mL。

1.2.2? 載體對木霉菌的毒性分析。

分別稱取滅菌后的9種供試載體10 g 裝入盛有100 mL無菌水三角瓶中200 r/min 充分振蕩混勻 2 h 后，用紗布過濾制得母液。母液過0.22 μm微孔濾膜，得到無菌液體。吸5 mL 上述無菌母液與45 mL PDA培養基混勻后倒平板，平板中心接種木霉菌的新鮮菌絲塊（直徑0.5 cm），重復 3 次，以加無菌水為空白對照。28 ℃培養箱中黑暗培養，至對照平板長滿菌絲后，用十字交叉法測量各處理菌落直徑，并計算抑制率。

抑制率＝（對照病原菌的菌落直徑－處理病原菌的菌落直徑）/（對照病原菌的菌落直徑-0.5 cm）×100%

1.2.3? 載體吸水性的測定。

供試載體研磨成粉末過60目篩，使用鼓風干燥箱105 ℃烘干至恒重。無菌條件下，將無菌水與10 g各供試載體材料充分混勻，少量多次加入無菌水，使載體材料保持濕潤、疏松但不結塊。以載體所含的液體量為載體吸水率，測定3次試驗的平均值。

1.2.4? 載體中有效菌體釋放率的測定。

將菌株發酵液稀釋至1×106孢子/mL備用。根據“1.2.3”結果將滅菌的供試載體中加入與無菌水等量的菌株發酵液，室溫晾至干燥。48 h后，精確稱取10 g供試載體，置于含有100 mL無菌水的錐形瓶中200 r/min充分混勻2 h后，用紗布過濾，顯微鏡下計數孢子量，計算載體有效菌體釋放率。有效菌體釋放率=載體中釋放出的活菌數目/接種菌數。

1.2.5? 不同接種量對菌劑中木霉菌生長數量的影響。

將Tr35發酵液分別稀釋至1×107、1×106、1×105、1×104孢子/mL，按“1.2.3”結果分別接種于10 g滅菌的玉米秸稈粉中，置于28 ℃恒溫培養箱中培養10 d，每個濃度重復3次。取1 g培養好的玉米秸稈粉置于含有100 mL無菌水的錐形瓶中，200 r/min充分混勻2 h后，用紗布過濾，顯微鏡下計數孢子量。

1.2.6? 木霉菌劑及木霉微生物菌肥的制備及對玉米促生作用評價。

稱取玉米秸稈粉100 g于滅菌袋中，滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。將滅菌后的玉米秸稈粉置于無菌操作臺上冷卻后，加入1×105孢子/mL的發酵液150 mL混合均勻。置于28 ℃恒溫培養箱中培養7～10 d，得到木霉菌劑。

將無菌土與木霉菌劑按3∶1、4∶1、5∶1混合后種植玉米，每盆播入5粒玉米種子，每個處理重復4次，20 d后調查各處理的株高、鮮重、根長，評價不同含量的木霉菌劑對玉米植株生長的影響，篩選無菌土與木霉菌劑的最優配比。

將無菌土與腐熟的雞糞和羊糞分別按6∶1、7∶1和8∶1的比例混勻后種植玉米，每盆播入5粒玉米種子，每個處理重復4次，20 d后調查各處理的株高、鮮重、根長，評價不同含量的有機肥對玉米植株生長的影響。

按照上述方法制備木霉菌劑，

將土與菌劑按5∶1混合制成菌劑土，制得的菌劑土分別與腐熟的雞糞和羊糞按6∶1、7∶1和8∶1的比例混合均勻，得到簡易木霉有機肥。每盆播入5粒玉米種子，每個處理重復4次，20 d后調查各處理的株高、鮮重、根長，評價不同含量的木霉有機肥對玉米植株生長的影響，篩選木霉菌劑與有機肥的最優配比。

木霉微生物菌肥的制備：向制備的木霉菌劑中分別加入0.9倍的腐熟羊糞和0.8倍的腐熟雞糞及適量復合肥，混勻后分別得到木霉微生物菌肥（羊糞）和木霉微生物菌肥（雞糞）。

1.2.7? 對玉米莖腐病的防治效果。

禾谷鐮孢菌玉米粒接種物的制備：將禾谷鐮孢菌在PDA平板上培養5 d，取邊緣菌絲，接種于150 mL液體產孢培養基中，于28 ℃、180 r/min 振蕩培養 3～5 d 后適量稀釋備用。將玉米粒清洗浸泡12 h，分裝滅菌冷卻后，按1.5%（v/w）比例將禾谷鐮孢菌液接種于玉米粒培養基中，28 ℃，黑暗培養10 d，即為禾谷鐮孢菌玉米粒接種物。

將土121 ℃濕熱滅菌2 h冷卻后，與木霉菌劑或微生物菌肥5∶1的比例混合均勻。挑選大小一致、健康的鄭單958種子，75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水洗滌3次晾干后備用?；ㄅ柚邢确湃肽久咕鷦┩粱蚰久刮⑸锞释?，接著在每盆中分別放入禾谷鐮孢菌玉米粒接種物30～40 g，然后覆蓋3 cm的木霉菌劑土或木霉微生物菌肥土，再播入5粒滅菌的玉米，最后覆土。20 d后調查各處理發病級別，計算防治效果。

苗期莖腐病分級標準［11］：0級，整株生長正常，無病級；1級，玉米地上部地下部生長基本正常，病斑面積占根表總面積1/4以下，根群顏色白中有褐；2級，地上地下生長明顯受阻，葉色變淡，株高僅為對照的3/4，側根少而短，無須根，病斑連片，病斑面積占根表總面積的1/4～1/2，根群顏色白、褐相當；3級，地上地下部生長極不正常，地上部可見青枯、黃枯狀，株高僅為對照的1/2，側根極小，病斑占根表總面積1/2～3/4，根群顏色褐中帶白； 4級，發芽但不出苗，幾乎窒息而死，病斑占根表總面積3/4 以上，根褐色。

病情指數及防效的計算方法：

病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級代表值）×100

防治效果=（空白對照病情指數-處理病情指數）/空白對照病情指數×100%

2? 結果與分析

2.1? 載體對木霉菌株Tr35的毒性分析

9種供試載體對木霉菌株Tr35的毒性分析見圖1，只有腐殖酸對Tr35有抑制作用，其他8種載體對Tr35均沒有抑制作用，具有作為菌肥載體的潛力。

2.2? 載體的吸水率

9種供試載體的吸水率見圖2，玉米秸稈粉的吸水率最高，達150.00%，其次為生物炭和泥炭，吸水率分別為135.00%和109.67%。雞糞的吸水率最低，為12.67%。

2.3? 載體中木霉菌株Tr35的釋放率

9種載體對木霉菌株Tr35的釋放率見圖3，玉米秸稈粉的釋放率最大，達172.78%，其次為羊糞和雞糞，對Tr35的釋放率分別為87.5%和83.33%。

2.4? 不同接種量對菌劑中木霉菌生長數量的影響

Tr35不同接種量對菌劑中木霉菌生長數量的影響見圖4，其中接種量為1×105孢子/mL時，菌肥中木霉菌的數量最多，達4億孢子/g。

2.5? 木霉菌劑效果評價? 經檢測，菌劑中的有效活菌數高于2×108個/g，符合我國制定的農業行業規定。

木霉菌劑不同施用量對玉米促生結果見表1，3個施用比例的株高和鮮重均高于對照，其中土∶菌劑為5∶1時，株高、根長和鮮重均最大，除根長外，均與對照差異顯著。其中，株高增長15.14%，根長增長29.66%，鮮重增長30.51%。3個施用比例對玉米苗期莖腐病都有一定的防治效果，其中土：菌劑為5∶1時，防效最高，達51.77%。因此，將土∶菌劑為 5∶1混合制成菌劑土用于后續試驗。

2.6? 木霉有機肥效果評價

2.6.1? 單獨施用有機肥對玉米的促生效果。

單獨施用有機肥對玉米的促生效果見表2。由表2可知，各處理的株高、根長與鮮重均高于對照，其中無菌土∶羊糞為 8∶1處理的株高和鮮重分別較對照增加41.52%和77.43%；無菌土∶羊糞為7∶1處理的

株高和鮮重分別較對照增加37.81%和57.68%。無菌土∶雞糞為7∶1和6∶1時的鮮重與對照差異顯著，分別較對照增加123.82%和99.69%。

2.6.2? 不同木霉有機肥對玉米的促生效果。

將土換成菌劑土后，各處理對玉米的促生作用均有所改變，結果見表2。由表2可知，所有處理的株高和鮮重均高于對照，當菌劑土∶羊糞為7∶1時，其株高、根長和鮮重分別較對照增加55.74%、4.93%和67.28%，較單獨施用羊糞的效果好。當菌劑土與雞糞8∶1配施時，其株高和鮮重分別較對照提高了50.56%和92.66%。當菌劑土∶雞糞為7∶1時，其株高、根長和鮮重分別較對照增加47.68%、25.07%和58.72%。當菌劑土∶羊糞為6∶1時，其株高和鮮重分別較對照增加了41.60%和39.14%。

綜合分析，菌劑土與羊糞7∶1的促生效果最好，優于單獨施用有機肥和菌劑。其次當菌劑土∶雞糞為8∶1和7∶1，菌劑土∶羊糞為6∶1時，對玉米生長也有較好的促進作用。

2.6.3? 不同微生物菌肥對玉米苗期莖腐病的防治效果。

木霉微生物菌肥（羊糞）和木霉微生物菌肥（雞糞）對玉米莖腐病有一定的防治效果，防效分別為61.31%和54.97%。

3? 結論與討論

該研究通過篩選載體，得到具有吸水性強、對Tr35無毒和高釋放率的玉米秸稈粉，其與Tr35共同發酵制備木霉菌劑，當土與菌劑為5∶1時，促生效果明顯，并對玉米苗期莖腐病防效達51.77%。菌劑土與腐熟羊糞為7∶1時的木霉有機肥促生效果最好，以此比例制備木霉微生物菌肥，對玉米苗期莖腐病防效達61.31%。這2種肥料可根據不同地理環境進行施用，當土壤養分含量較高時可選用木霉菌劑，當養分含量較低時可選擇木霉微生物菌肥，達到節本增效的目的。

微生物肥料中的載體是保證微生物存活免受外界不利因素影響的一類材料［12］，且能夠使微生物利用載體中的養分迅速繁殖。載體的選擇是影響菌肥效果的重要影響因素［13］。Ben Rebah等［14］研究表明，高有機質含量、最佳氮含量、呈中性的酸堿度、高持水能力、對吸附其中的功能微生物生長無抑制作用等因素是優秀載體需具備的性質。玉米秸稈主要由纖維素類物質、可溶性糖類、粗蛋白質、粗脂肪和少量的無機鹽及水組成［15］。玉米秸稈中除含有絕大部分的 C元素外，還含有 K、Si、N、Mg、P、Cl等元素［16］，是生產木霉菌較好的原料［17］。該研究玉米秸稈對木霉菌Tr35生長沒有影響，吸水能力強，在確保Tr35在載體上正常生存的同時，具有較高的釋放率，所以選用玉米秸稈作為生物菌肥的載體。

微生物菌肥中的有益微生物在改土和促生方面具有積極效應，可顯著增強植物的抗逆性［18］。木霉是一種廣泛存在于土壤中的生防微生物，不僅可以用來防治病害，而且能促進植物的生長發育。該研究以非洲哈茨木霉為主要成分研制木霉菌劑，不僅對玉米生長有促生作用，同時對玉米莖腐病有較好的防治效果，最高防效為51.77%。研究指出，非洲哈茨木霉可以通過接觸、纏繞、消解［19］、重寄生［20］、產生揮發性物質［21］等方式達到抑制病原菌的目的，也可以通過產生細胞壁降解酶（β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶等）進而破壞病原菌的細胞壁，使其停止生長或侵染［22］，不同木霉菌也會表現出種內、種間的差異性，防治機理也存在不同，該研究所選非洲哈茨木霉菌株Tr35的作用機制還有待研究。

畜禽糞有機肥含有大量有機質及作物生長所需的各類營養元素，不僅有利于作物生長、增加作物產量、改善農產品品質［23］，還可以改善土壤的物理性狀、增加土壤中的有機質和養分含量、提高土壤保水保肥能力，能降低土壤容重并提高微生物數量［24-25］。羊糞中有機質、氮、磷含量高，不僅是一種優質的土壤改良劑更是一種豐厚的有機肥［26］。雞因為其消化道短的特殊生理結構，雞糞中含有40%～70% 未被吸收代謝的有機質和氮素等［27-28］，也是腐熟有機肥的優質原料。該研究在木霉菌劑的基礎上，加入有機肥，制備木霉微生物菌肥，當菌劑土與羊糞7∶1時，對玉米的促生效果明顯，顯著高于單獨施用羊糞的處理，同時對玉米莖腐病的防效也達60%以上。

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