生鮮乳中黃曲霉M1膠體金法的推廣研究

文│杜春雷 （河北省張家口市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心）

一、黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一類(lèi)結(jié)構(gòu)包括二呋喃環(huán)和香豆素的化合物。黃曲霉毒素可以在長(zhǎng)波紫外光照射下產(chǎn)生熒光反應(yīng)，依據(jù)其熒光顏色、RF值高低及化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM和毒醇。

黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是一類(lèi)哺乳動(dòng)物因采食黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在其機(jī)體內(nèi)羥基化產(chǎn)生的有毒代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將其列為ⅡB類(lèi)致癌物。黃曲霉毒素M1進(jìn)入人體或其他哺乳動(dòng)物有機(jī)體內(nèi)后顯著抑制肝組織蛋白質(zhì)的正常合成，導(dǎo)致肝中毒，表現(xiàn)為損害肝組織；致癌、致畸、致突變，引發(fā)多種肝病，進(jìn)一步誘發(fā)肝癌等，毒性是砒霜毒性的近70倍。

生鮮乳中黃曲霉毒素超標(biāo)，一是產(chǎn)品長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法不當(dāng)，或原料、產(chǎn)品在二次加工、運(yùn)輸儲(chǔ)存過(guò)程中受到污染所致；二是養(yǎng)殖戶(hù)把那些長(zhǎng)了霉菌的糧谷當(dāng)作動(dòng)物的飼料，其中會(huì)含有極大量的黃曲霉毒素，這些毒素會(huì)在24小時(shí)后代謝富集轉(zhuǎn)移到奶中。黃曲霉毒素被哺乳動(dòng)物直接采食后，一部分會(huì)殘留在動(dòng)物體內(nèi)，另一部分會(huì)釋放到哺乳動(dòng)物的乳汁和尿液中。

黃曲霉毒素M1一旦形成難以消除，因?yàn)辄S曲霉毒素M1對(duì)光熱和酸特別穩(wěn)定，裂解溫度將近300℃，生鮮乳常見(jiàn)的消毒方式均不能將其完全消除。

目前，世界已有很多國(guó)家，包括亞洲、歐洲等均對(duì)黃曲霉毒素M1的含量制定了嚴(yán)格的國(guó)家國(guó)際限量指標(biāo)。我國(guó)發(fā)布的國(guó)標(biāo)《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中明確規(guī)定黃曲霉毒素M1在乳及乳制品中的殘留限量為0.5微克/千克。

二、相關(guān)檢測(cè)技術(shù)

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法一般分為兩類(lèi)：一類(lèi)是基于氣相色譜或液相色譜分離技術(shù)的各種物理化學(xué)分析方法，包括薄層層析法（TLC）、高壓液相色譜法（HPLC）、液相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)法（LC-MS）；另一類(lèi)是免疫化學(xué)分析檢測(cè)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、膠體金法。

1.薄層層析法（TLC）。薄層層析法（TLC）是一項(xiàng)最初用來(lái)測(cè)定黃曲霉毒素的試驗(yàn)方法，基本原理是將待測(cè)樣品提取、層析、洗脫、濃縮和分離，然后在波長(zhǎng)365納米的紫外光下產(chǎn)生特殊熒光，最終即可計(jì)算出黃曲霉毒素的含量，如GB 5009.22-2016的第五法薄層色譜法，檢出限5微克/千克，但存在靈敏度低、污染大、干擾因素多等缺點(diǎn)，更多用于黃曲霉毒素樣品的初步篩查和定性判斷。

2.液相色譜法（HPLC）。液相色譜法（HPLC）的基本原理是樣品中多種化合物在色譜柱的流動(dòng)相和固定相之間有不同程度的吸附，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的分離。再通過(guò)柱后電化學(xué)衍生作用后釋放產(chǎn)生特征熒光，通過(guò)紫外熒光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)行定性和定量。具有高分辨率、分析時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，如GB 5009.22-2016的第三代高效液相色譜-柱后衍生法，檢出限0.003～0.03微克/千克，但需要昂貴的儀器設(shè)備，較高的分析技術(shù)。

3.液相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜法（LCMS）。液相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜法（LCMS）基本原理是將待測(cè)樣品中的M1和M2用甲醇-水溶液進(jìn)行提取，再用水或磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)?jīng)過(guò)免疫親和柱凈化，氮吹濃縮、用流動(dòng)相定容和過(guò)針式濾膜后上液相色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。液相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜法（LCMS）具有前處理操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度響應(yīng)高，能滿(mǎn)足大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)檢測(cè)儀器和操作人員的技術(shù)要求較高。

4.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。

酶聯(lián)免疫法（ELISA）是抗原（或抗體）吸附劑和用酶標(biāo)記的抗體（或抗原）與標(biāo)本中的目標(biāo)物發(fā)生特異的免疫學(xué)結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定相應(yīng)酶活力的方法進(jìn)行定性或定量的技術(shù)方法。主要包括雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法兩種試驗(yàn)方法。酶聯(lián)免疫吸附法具有所用試劑少、操作簡(jiǎn)便、快捷，如GB 5009.22-2016中第五法酶聯(lián)免疫吸附篩查法，檢出限1微克/千克，具有適合大批量樣品篩查的主要優(yōu)點(diǎn)。

5.膠體金法。膠體金法基于競(jìng)爭(zhēng)免疫技術(shù)，將待測(cè)樣品提取液滴加到速測(cè)卡的樣品孔中，提取液中的M1和速測(cè)卡上的抗體結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合抗體化合物，如果提取液中M1濃度比檢測(cè)靈敏度低，沒(méi)有結(jié)合的抗體會(huì)轉(zhuǎn)移到T區(qū)，被膜上相應(yīng)的抗原捕獲，形成一條肉眼可見(jiàn)的T線(xiàn)；如果提取液中M1濃度比檢測(cè)靈敏度高，抗體就不會(huì)和T線(xiàn)處的抗原結(jié)合，T線(xiàn)自然就消失不見(jiàn)。C線(xiàn)是一條質(zhì)控線(xiàn)，出現(xiàn)才能證明速測(cè)卡的有效性。該方法方便快捷，特別適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

孫翠萍等用膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體，獲得了一種靈敏度為0.3納克/毫克的膠體金免疫標(biāo)記快速檢測(cè)試紙條，檢測(cè)時(shí)間僅需l0分鐘，并對(duì)10份牛奶樣品進(jìn)行了黃曲霉毒素M1檢測(cè)，其檢測(cè)值與ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）檢測(cè)值一致，表明在黃曲霉毒素M1快速現(xiàn)場(chǎng)篩中是一種不錯(cuò)的選擇。

三、膠體金法檢測(cè)生鮮乳中黃曲霉M1在張家口地區(qū)的推廣

1.張家口地區(qū)奶業(yè)現(xiàn)狀。張家口市位于內(nèi)蒙古高原的最南端，北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶，總面積3.7萬(wàn)余平方千米，飼草資源較為豐富，畜牧家禽養(yǎng)殖歷史悠久，2003年被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為全國(guó)7個(gè)奶業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)帶，發(fā)展成為河北省四大奶牛優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)之一。特別是近幾年在市委、市政府正確領(lǐng)導(dǎo)下，畜牧養(yǎng)殖業(yè)已成為張家口市調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式和增加農(nóng)民收入的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。至2021年底，年內(nèi)存欄26.59萬(wàn)頭，生鮮乳產(chǎn)量121萬(wàn)噸，存欄和奶產(chǎn)量位居全省第二。全市有蒙牛、伊利、君樂(lè)寶、長(zhǎng)城乳業(yè)等乳品加工企業(yè)11家，年實(shí)際處理生鮮乳95.2萬(wàn)噸左右。

2023年作為張家口市奶業(yè)振興的關(guān)鍵之年，全市奶業(yè)振興的總體思路是以習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義思想為指導(dǎo)，全面貫徹落實(shí)中央、省關(guān)于畜牧業(yè)發(fā)展的決策部署，以奶產(chǎn)業(yè)建設(shè)為主線(xiàn)，立足“首都兩區(qū)”功能定位，圍繞以水定產(chǎn)、以水定畜總要求，以鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略為統(tǒng)領(lǐng)，以特色農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展為依托，應(yīng)變局、開(kāi)新局，堅(jiān)持穩(wěn)中求進(jìn)、整鏈推進(jìn)，強(qiáng)化利益聯(lián)結(jié)、引導(dǎo)乳品消費(fèi)，建設(shè)百億級(jí)奶業(yè)工程，提升全產(chǎn)業(yè)鏈競(jìng)爭(zhēng)力，全市奶牛存欄、生鮮乳產(chǎn)量、乳制品產(chǎn)量分別達(dá)到29萬(wàn)頭、116萬(wàn)噸和77萬(wàn)噸，奶業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值105億元，為群眾乳制品消費(fèi)和鄉(xiāng)村振興提供保障和支撐。

眾多優(yōu)勢(shì)使張家口乳業(yè)前景十分樂(lè)觀，但鮮奶質(zhì)量安全問(wèn)題依舊是重中之重。目前張家口生鮮乳由于受養(yǎng)殖加工方式落后、科學(xué)技術(shù)投入較少等因素的影響，質(zhì)量安全令人擔(dān)憂(yōu)。同時(shí)張家口市缺少大氣、水源、土壤等環(huán)境監(jiān)測(cè)，不能更全面地保證農(nóng)業(yè)及產(chǎn)品的環(huán)境和質(zhì)量安全。

2.采用膠體金法檢測(cè)的必要性。現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)是保障乳制品質(zhì)量安全的核心手段。現(xiàn)有各種大型儀器檢測(cè)技術(shù)卻因?yàn)椴僮鬟^(guò)程復(fù)雜、需要昂貴精密儀器和專(zhuān)業(yè)分析技術(shù)人員難以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，各檢測(cè)方法對(duì)比詳見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)方法對(duì)比表

薄層色譜法的操作過(guò)程煩瑣、污染干擾大、耗時(shí)較長(zhǎng)；液相色譜法和液相質(zhì)譜法結(jié)果雖然可靠準(zhǔn)確，但前處理過(guò)程復(fù)雜，需要大型精密儀器，對(duì)人員操作和分析要求較高；酶聯(lián)免疫法用時(shí)較短，但也需要酶標(biāo)儀和操作熟練的技術(shù)人員，同樣不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；膠體金法檢測(cè)時(shí)間短、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)需其他儀器設(shè)備、結(jié)果直觀容易判別，完美滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。

在張家口市各縣區(qū)推廣生鮮乳中黃曲霉M1快速篩查膠體金法，涉及現(xiàn)代牧場(chǎng)、規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、奶農(nóng)專(zhuān)業(yè)合作社和乳品加工企業(yè)15家以上，覆蓋奶牛3萬(wàn)頭以上，在生產(chǎn)運(yùn)輸環(huán)節(jié)進(jìn)行生鮮乳抽樣檢測(cè)，并形成完善的養(yǎng)殖、抽樣檔案記錄，生鮮乳抽樣檢測(cè)覆蓋在1萬(wàn)噸以上。采用此方法的生產(chǎn)主體可節(jié)省較大的時(shí)間、人力、物力成本。主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

（1）經(jīng)濟(jì)效益。與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相比，企業(yè)、養(yǎng)殖主體采用膠體金免疫層析法可節(jié)省實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀采購(gòu)費(fèi)用約40萬(wàn)元，每批次檢測(cè)可節(jié)省成本約3000元。膠體金免疫層析法對(duì)溫度環(huán)境容忍度較高，相比一般快速檢測(cè)手段可節(jié)省便攜冷藏設(shè)備約2000元。

（2）生產(chǎn)效益。與實(shí)驗(yàn)室液相色譜法相比，膠體金免疫層析法操作簡(jiǎn)單，可極大降低檢測(cè)技術(shù)人員的培訓(xùn)成本，每批次檢測(cè)時(shí)間從2小時(shí)壓縮至10分鐘左右，極大提升了生產(chǎn)、存儲(chǔ)、運(yùn)輸各環(huán)節(jié)的流通效率。

（3）社會(huì)效益。膠體金免疫層析法成本低、靈敏度高、反應(yīng)快速，依托對(duì)該方法的研究與總結(jié)，對(duì)保障生鮮乳和乳制品的質(zhì)量安全以及消費(fèi)者健康安全具有非常重大的意義。

四、結(jié)語(yǔ)

生鮮乳作為一種保鮮期短，不宜長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)氖称罚⑸r乳和乳制品中黃曲霉毒素M1快速檢測(cè)技術(shù)，推廣膠體金法對(duì)保障生鮮乳、乳制品的質(zhì)量安全和消費(fèi)者的健康安全具有非常重大的意義。膠體金法具有靈敏快速、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、不需要使用其他試劑和大型精密儀器等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，大大提高了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)效率，滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)對(duì)快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需求。現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)可以作為行政執(zhí)法依據(jù)，還可以提高行政監(jiān)管的效率和力度。對(duì)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)超標(biāo)有問(wèn)題的樣品進(jìn)一步送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)檢，達(dá)到提高檢測(cè)檢驗(yàn)和監(jiān)督執(zhí)法的效率，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)檢測(cè)的高效互補(bǔ)，對(duì)保障生鮮乳的質(zhì)量安全極為重要。