海三棱藨草及其近緣種的DNA條形碼研究

摘"要： "海三棱藨草 ［× Bolboschoenoplectus mariqueter （Tang amp; F. T. Wang） Tatanov］的分類學(xué)地位至今尚無(wú)定論。為明確海三棱藨草的分類學(xué)地位并探討其與近緣種的關(guān)系，該研究分別利用1個(gè)核基因（ITS）和5個(gè)葉綠體基因（matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF）的DNA條形碼序列對(duì)海三棱藨草及其近緣種的4種21批樣品進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，通過(guò)采用相似性搜索算法對(duì)單一序列和序列組合的物種鑒定效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，并基于貝葉斯推斷方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明：（1）ITS + matK序列組合的物種鑒定效率最高，為71.4%，可實(shí)現(xiàn)海三棱藨草及其近緣種的種間區(qū)分、鑒定。（2）基于ITS + matK序列組合構(gòu)建海三棱藨草及其近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)同一物種的樣品聚集度較好，海三棱藨草與三棱草屬 ［Bolboschoenus （Asch.） Palla］的物種聚為一支，明顯與水蔥屬 ［Schoenoplectus （Rchb.） Palla］物種分開，并且海三棱藨草與海濱三棱草 ［Bolboschoenus maritimus （Linnaeus） Palla］形成單系。綜上所述，ITS + matK序列組合可作為海三棱藨草及其近緣種物種鑒定的最佳條形碼序列，研究結(jié)果不支持海三棱藨草為天然雜交種的觀點(diǎn)，而應(yīng)將其歸入三棱草屬中，海三棱藨草應(yīng)為海濱三棱草的異名。該研究結(jié)果為海三棱藨草及其近緣種的分類學(xué)研究提供了分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 海三棱藨草， 近緣種， DNA條形碼， 物種鑒定， 親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： "Q949.71+4.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A

文章編號(hào)： "1000-3142（2024）04-0699-11

Study on × Bolboschoenoplectus mariqueter and

its related species based on DNA barcoding

ZHANG Shilan1， WANG Yucen1， LIU Wenliang1，2

（ 1. Shanghai Key Lab for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences，

East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of Eco-Chongming， Shanghai 202162， China ）

Abstract： "The taxonomic status of × Bolboschoenoplectus mariqueter （Tang amp; F.T.Wang） Tatanov is still up for debate. To clarify this status and explore its genetic relationship with closely related species， the candidate DNA barcode sequences of one nuclear gene （ITS） and five chloroplast genes （matK， ndhF， rbcL， trnL and trnL-trnF） were used for PCR amplification and sequencing of 21 individuals from four species， including × Bolboschoenoplectus mariqueter and its related species. The basic local alignment search tool was then applied to evaluate the identification efficiency of the screened barcode sequences and sequence combinations. Finally， species identification analyses were performed by constructing a phylogenetic tree using the Bayesian inference method. The results were as follows： （1） The ITS + matK sequence combination showed the highest species-resolving degree of 71.4%， which could achieve interspecific differentiation and identification of × Bolboschoenoplectus mariqueter and its closely related species. （2） According to the phylogenetic tree based on ITS + matK sequence combination， samples of the same species showed better aggregation and were mostly monophyletic， with × Bolboschoenoplectus mariqueter clustered together with all Bolboschoenus （Asch.） Palla individuals， rather than Schoenoplectus （Rchb.） Palla species. All × Bolboschoenoplectus mariqueter and Bolboschoenus maritimus （Linnaeus） Palla samples formed a monophyletic clade. In conclusion， ITS + matK sequence combination appears to be the best barcode sequence for interspecific identification of × Bolboschoenoplectus mariqueter and its related species. Furthermore， × Bolboschoenoplectus mariqueter could be a synonym of Bolboschoenus maritimus rather than a natural hybrid. This study establishes a theoretical foundation for the taxonomic research on × Bolboschoenoplectus mariqueter and its closely related species.

Key words： × Bolboschoenoplectus mariqueter， related species， DNA barcoding， species identification， genetic relationship

海三棱藨草 ［× Bolboschoenoplectus mariqueter （Tang amp; F. T. Wang） Tatanov］屬于莎草科（Cyperaceae），主要分布在長(zhǎng)江河口及杭州灣灘涂，曾被報(bào)道為我國(guó)特有的灘涂濕地先鋒種（唐進(jìn)和王發(fā)瓚，1965），具有維持生物多樣性、消減波浪、固灘護(hù)堤、促進(jìn)泥沙沉降和為遷徙越冬的水鳥提供棲息地等多種生態(tài)功能（朱晶等，2007；陳秀芝和孫瑛，2011）。

海三棱藨草的正名問(wèn)題及其所在屬的分類地位一直未能得到解決。海三棱藨草因其稈為三棱形，花序假側(cè)生等性狀與藨草（Scirpus triqueter L.）相似，而其穗大和小堅(jiān)果表面網(wǎng)紋等性狀又與扁稈藨草（S. planiculmis Fr. Schmidt）相似，被以藨草和扁稈藨草的天然雜交種（Scirpus × mariqueter Tang et F. T. Wang）發(fā)表（唐進(jìn)和王發(fā)瓚，1965）；隨著藨草屬（Scirpus L.）系統(tǒng)學(xué)研究的不斷深入，廣義藨草屬被劃分為若干屬，海三棱藨草的親本藨草和扁稈藨草被劃分到不同的屬，即水蔥屬 ［Schoenoplectus （Rchb.） Palla］和三棱草屬 ［Bolboschoenus （Asch.） Palla］，二者的中文名和學(xué)名變更為三棱水蔥 ［Schoenoplectus triqueter （L.） Palla］和扁稈荊三棱 ［Bolboschoenus planiculmis （F. Schmidt） T. V. Egorova］；Tatanov （2007）承認(rèn)海三棱藨草為屬間雜交種，并以此建立了新的雜交屬 × Bolboschoenoplectus Tatanov，因此海三棱藨草的學(xué)名變更為 ［× Bolboschoenoplectus mariqueter （Tang amp; F. T. Wang） Tatanov］（Dai et al.， 2010）。Koyama （1980）將 Scirpus × mariqueter作為 Bolboschoenus planiculmis的異名，認(rèn)為海三棱藨草只是扁稈荊三棱的單穗變異類型。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，一些分子標(biāo)記被開發(fā)應(yīng)用于海三棱藨草及其近緣種的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析中。Yang 等 （2009，2013）通過(guò)AFLP分子標(biāo)記技術(shù)和種間雜交試驗(yàn)分析了海三棱藨草與其潛在親本扁稈荊三棱和三棱水蔥的親緣關(guān)系，結(jié)果表明海三棱藨草非雜交起源且與扁稈荊三棱的親緣關(guān)系更近，但作者未明確界定二者是否為獨(dú)立的物種。另外，前人還采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)揭示了扁稈荊三棱和海濱三棱草 ［Bolboschoenus maritimus （Linnaeus） Palla］遺傳結(jié)構(gòu)的相似性，并在二者分布的重疊區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的雜交后代，但這些個(gè)體無(wú)法通過(guò)分類函數(shù)進(jìn)行明確的物種界定（Zhou et al.， 2009; Píová et al.， 2017）。有研究表明，三棱草屬植物果實(shí)的橫切面形狀和果皮厚度是重要的種間鑒別特征（Hroudová et al.， 2007; Píová et al.， 2017）。宋晨薇等（2019）通過(guò)觀察比較海三棱藨草及其近緣種的果實(shí)形態(tài)和果皮微結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)海三棱藨草在果實(shí)形態(tài)和果皮厚度上與扁稈荊三棱明顯差異而與海濱三棱草相似，因而推論其為海濱三棱草水濱亞種 ［Bolboschoenus maritimus subsp. paludosus （A. Nelson） T. Koyama］的異名。綜上認(rèn)為，海三棱藨草的分類地位及其與近緣種的親緣關(guān)系仍然需要進(jìn)一步探究。

2003年，Hebert首次提出了DNA條形碼技術(shù)，即利用一段公認(rèn)的、標(biāo)準(zhǔn)的、易于擴(kuò)增的且具有足夠變異的短DNA片段來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速鑒定（Hebert et al.， 2003a， b）。經(jīng)過(guò)20年的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中發(fā)展最迅速的方向之一，在植物物種鑒定及分子系統(tǒng)學(xué)研究領(lǐng)域彰顯出廣闊的應(yīng)用前景（Costion et al.， 2011; Li et al.， 2015; Hu et al.， 2022）。目前，DNA條形碼技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于莎草科植物的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和演化歷史的研究中，并且取得了一定的成果（Yen amp; Olmstead， 2000; Starr et al.， 2009; Clerc-Blain et al.， 2010; Glon et al.， 2017; Léveillé-Bourret et al.， 2020）。但關(guān)于海三棱藨草及其近緣種基于基因片段的分子系統(tǒng)學(xué)研究相對(duì)滯后。準(zhǔn)確的物種鑒定是生物多樣性保護(hù)的基礎(chǔ)和前提（Vane-Wright et al.， 1991）。實(shí)現(xiàn)海三棱藨草的科學(xué)鑒定對(duì)三棱草屬植物系統(tǒng)發(fā)育重建及分類學(xué)研究具有重大的理論意義和實(shí)際價(jià)值。

本研究通過(guò)選用6組候選序列（ITS、matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF）對(duì)海三棱藨草及其3個(gè)近緣種共21個(gè)樣本進(jìn)行DNA條形碼研究，通過(guò)比較分析擴(kuò)增序列的特征、種內(nèi)種間變異率和鑒定效率等指標(biāo)，評(píng)估不同候選序列及其組合的物種分辨能力，擬篩選出適用于海三棱藨草及其近緣種鑒定的最佳DNA條形碼序列，同時(shí)基于建樹法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)一步探討海三棱藨草與其近緣種之間的關(guān)系，以期為海三棱藨草的分類學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1"材料與方法

1.1 材料

本研究選取海三棱藨草 ［× Bolboschoenoplectus mariqueter （Tang amp; F.T.Wang） Tatanov］及其3個(gè)近緣種，包括扁稈荊三棱 ［Bolboschoenus planiculmis （F. Schmidt） T. V. Egorova］、海濱三棱草 ［B. maritimus （Linnaeus） Palla］和荊三棱 ［B. yagara （Ohwi） Y. C. Yang amp; M. Zhan］總共21份樣本作為研究材料（表1），本研究中海三棱藨草及其近緣種的形態(tài)特征及地理分布比較詳見表2和表3。

1.2 方法

1.2.1 植物基因組的提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序"采用植物基因組DNA試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取植物的總DNA。序列擴(kuò)增用到的引物信息及PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序見表4。PCR擴(kuò)增采用100 mL反應(yīng)體系：滅菌后的ddH2O 69.5 mL，TaqBuffer 10 mL，dNTP 8 mL，上、下游引物各4 mL，DNA模板4 mL，EX Taq酶0.5 mL；擴(kuò)增完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，篩選出條帶清晰的樣品送到北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理"利用DNASTAR Lasergene軟件包 （DNASTAR Inc.， Madison， WI， USA）中的SeqMan 軟件對(duì)測(cè)序得到的雙向峰圖進(jìn)行校對(duì)、拼接，去除兩端峰圖雜亂、質(zhì)量較低的序列，采用MEGE 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用DnaSP 6.0 統(tǒng)計(jì)各個(gè)DNA條形碼序列的特征信息和變異位點(diǎn)信息；基于K2P （Kimura 2-parameter model）雙參數(shù)模型計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離，評(píng)價(jià)條形碼在種內(nèi)、種間的變異情況；利用相似性搜索算法（basic local alignment search tool， BLAST）考察分析各條形碼候選序列的鑒定效率，通過(guò)將實(shí)驗(yàn)獲得的全部序列作為查詢序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用NCBI-BLAST相似性比對(duì)工具進(jìn)行批量數(shù)據(jù)分析。當(dāng)返回的比對(duì)結(jié)果中最大的相似物種（identity gt; 95%且E值 lt; 1×10-5）與該查詢序列所屬的物種一致且不包含其他物種時(shí)則視該物種鑒定成功，反之則視為鑒定失敗。對(duì)于聯(lián)合片段物種鑒定效率的計(jì)算，在本研究中只要其中一個(gè)片段能夠成功鑒定出該物種，則組合片段也能鑒定出該物種（Liu et al.， 2015），物種鑒定效率=鑒定成功物種個(gè)體數(shù)/總個(gè)體數(shù)。采用貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行遺傳聚類分析。

2"結(jié)果與分析

2.1 DNA條形碼候選片段的序列特征分析

對(duì)海三棱藨草及其近緣種的6組DNA條形碼候選序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表5）表明，在各條形碼中，rbcL序列最長(zhǎng)，為1 374 bp，trnL-trnF序列最短，為444 bp；ITS序列的GC含量最高，而trnL序列的GC含量最低。6個(gè)DNA條形碼片段的變異位點(diǎn)數(shù)依次排序?yàn)镮TS ＞ ndhF ＞ matK ＞ rbcL ＞ trnL ＞ trnL-trnF。海三棱藨草及其近緣種的核基因ITS序列變異位點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)大于其他5個(gè)葉綠體基因片段的變異位點(diǎn)數(shù)。

2.2 DNA條形碼候選片段的種內(nèi)、種間遺傳變異

理想的DNA條形碼序列種內(nèi)變異水平應(yīng)明顯小于種間變異水平（寧淑萍等，2008）。本研究的種內(nèi)和種間K2P遺傳距離結(jié)果（表6）顯示，6組DNA條形碼候選序列的種內(nèi)變異水平均為0，除ITS序列之外，其余5組DNA條形碼候選序列的種內(nèi)和種間變異均存在不同程度的重疊，各個(gè)條形碼種間的變異大小依次排序?yàn)镮TS ＞ ndhF ＞ matK ＞ trnL ＞ rbcL ＞ trnL-trnF。

2.3 DNA條形碼候選片段的鑒定效率評(píng)價(jià)

本研究采用BLAST法分析6組DNA條形碼候選序列的鑒定效率，結(jié)果（表7）顯示，單一序列的鑒定效率均未達(dá)到100%，matK 鑒定效率最高為52.4%，其次是ndhF和rbcL均為28.6%，ITS的鑒定效率為23.8%，trnL-trnF 和trnL 片段的物種鑒定效率為0。在組合條形碼中，ITS + matK 的鑒定效率最高為71.4%，其次是matK + ndhF 和matK + rbcL的鑒定效率均為61.9%，而ITS + ndhF、ITS + rbcL、ITS + （ trnL-trnF ）和ITS + trnL組合的鑒定效率分別為52.4%、52.4%、23.8%和23.8%。

2.4 遺傳聚類分析

為探究海三棱藨草及其近緣種間的關(guān)系，本研究基于ITS + matK 序列構(gòu)建了海三棱藨草及其近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹，表8列舉了從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的外類群的ITS和matK序列信息。為了評(píng)價(jià)核基因和葉綠體基因序列聯(lián)合數(shù)據(jù)之間的一致性，本研究在PAUP*4.0b10上進(jìn)行了不一致長(zhǎng)度差異檢驗(yàn)（incongruence length difference test， ILD test）（Dolphin et al.， 2000）。P值是用來(lái)衡量?jī)山M數(shù)據(jù)之間是否存在顯著性差異（P＜0.05）。計(jì)算得出P值為1.0，表明核基因ITS和葉綠體基因matK序列數(shù)據(jù)之間沒(méi)有顯著性差異，可以聯(lián)合進(jìn)行分析。本研究通過(guò)采用貝葉斯推斷法（Bayesian inference， BI）來(lái)進(jìn)行多基因聯(lián)合構(gòu)樹，該方法更靈活，考慮更加全面，構(gòu)樹結(jié)果更可靠（Heled amp; Drummond， 2009）。ITS和matK 序列聯(lián)合矩陣總長(zhǎng)度為1 839 bp，變異位點(diǎn)數(shù)為39。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1）表明， 各分支聚集良好，大多表現(xiàn)為單系。外類群兩個(gè)屬的物種位于系統(tǒng)樹基部，水蔥屬 ［Schoenoplectus （Rchb.） Palla］物種類群自成一支，與三棱草屬物種類群 ［Bolboschoenus （Asch.） Palla］明顯分開，后驗(yàn)概率為1。三棱草屬物種類群由海三棱藨草及其近緣種組成，可以分為三個(gè)主支。最大一支包括了所有海三棱藨草（× Bolboschoenoplectus mariqueter）和海濱三棱草（Bolboschoenus maritimus）的樣本。第二支包括了扁稈荊三棱（B. planiculmis）的6個(gè)樣本，第三支則由荊三棱 （B. yagara）的所有個(gè)體組成， 均獲得較高支持率。在ITS + matK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，海三棱藨草與海濱三棱草聚在一起，和扁稈荊三棱的所有樣品聚成的一支構(gòu)成姐妹支，另外，海濱三棱草的一個(gè)個(gè)體與海三棱藨草聚為一支，但自展值很低；荊三棱自成一支，與海三棱藨草的關(guān)系最遠(yuǎn)。

3"討論與結(jié)論

由于植物的進(jìn)化歷史復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)和動(dòng)物COI基因一樣，能夠用作植物通用條形碼的單一片段，因此從植物葉綠體基因組和核基因組中篩選出高效且通用的DNA條形碼候選片段一直是困擾植物學(xué)家的重要難題（李德銖和曾春霞，2015）。本研究應(yīng)用1個(gè)核基因片段（ITS）與5個(gè)葉綠體基因片段（matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF）對(duì)海三棱藨草及其3個(gè)近緣種進(jìn)行DNA條形碼研究，評(píng)估6組候選DNA條形碼序列及其組合片段的物種鑒定能力，同時(shí)探討海三棱藨草與3個(gè)近緣種間的關(guān)系。

3.1 不同DNA條形碼序列在海三棱藨草及其近緣種中的鑒定效率

被子植物的ITS序列具有側(cè)翼高度保守、拷貝數(shù)多、協(xié)同進(jìn)化快、易于擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)等特點(diǎn)（Baldwin et al.， 1995），被廣泛應(yīng)用于莎草科植物的系統(tǒng)發(fā)育研究中（Yano amp; Hoshino， 2005; Shiels et al.， 2014）。本研究用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增得到的ITS序列包含了ITS1序列、5.8S rDNA和ITS2序列3個(gè)部分，長(zhǎng)度為706 bp。Jung和Choi（2010）研究表明，該序列在水蔥屬和螢藺屬（Schoenoplectiella Lye）植物中的擴(kuò)增長(zhǎng)度為636 bp（Shiels et al.， 2014），在藨草屬植物中的擴(kuò)增長(zhǎng)度為712 bp，另外該序列在藨草屬植物中的變異率高達(dá)47.3%，在水蔥屬和螢藺屬植物中的變異率為32.4%，而在海三棱藨草及其近緣種中的變異率僅為4.96%，推測(cè)可能是由研究樣本大小差異所導(dǎo)致的。同時(shí)，這表明了ITS序列在莎草科不同屬中的序列長(zhǎng)度和變異水平均有所差異。

matK基因是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進(jìn)化速率最快的基因之一（Chase et al.， 2007），但其引物通用性還存在較多爭(zhēng)議，不同分類群體之間往往需要更換多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增（Fazekas et al.， 2008）。本研究共采用兩組通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的matK片段長(zhǎng)度為1 188 bp，該結(jié)果與Gilmour 等 （2013）的研究結(jié)果基本一致。本研究中，matK片段在海三棱藨草及其近緣種中的物種鑒定效率為52.4%，而Clerc-Blain 等 （2010）的研究結(jié)果表明matK片段能夠識(shí)別出加拿大北極群島上95%的薹草屬（Carex L.）和嵩草屬（Kobresia Willd.）植物，推測(cè)可能的原因是在上述研究區(qū)域內(nèi)同屬近緣種數(shù)目較少，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)近緣種采樣不充分（Fazekas et al.， 2008）。

ndhF 序列位于葉綠體基因的小單拷貝區(qū)（small single-copy region， SSC），Kim和Jansent（1995）研究表明，該序列5′端較為保守而3′端變異較大，進(jìn)化速率是rbcL 基因的2倍。本研究獲得的ndhF 序列長(zhǎng)度為1 038 bp，與Gilmour等（2013）的研究結(jié)果基本相符，但該序列在海三棱藨草及其近緣種中的變異位點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)不及在水蔥屬和螢藺屬中，物種的鑒定效率僅為28.6%。

rbcL序列相對(duì)保守，種間變異小，因其強(qiáng)大的通用性而被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究中。但Starr 等 （2009）在使用引物rbcL-a_f / rbcL-a_r對(duì)薹草屬植物的rbcL序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)該序列獲得率僅為18%。本研究采用1F/724R對(duì)rbcL 序列進(jìn)行擴(kuò)增，成功獲得了rbcL片段，但序列變異率低（0.15%），遠(yuǎn)小于在韓國(guó)藨草屬植物中的變異水平（Jung amp; Choi， 2010），不能對(duì)海三棱藨草及其近緣種進(jìn)行有效區(qū)分。

葉綠體tRNA基因trnL（UAA）內(nèi)含子具有催化功能且存在二級(jí)結(jié)構(gòu)（Kuhsel et al.， 1990），因此序列變異率較低；而trnL-trnF 間隔區(qū)面臨的選擇壓力小，進(jìn)化速度快，適用于分類階元較低的類群間的系統(tǒng)發(fā)育研究（Taberlet et al.， 1991）。但本研究結(jié)果表明，這兩條序列在海三棱藨草及其近緣種中非常保守，變異率和種間差異極小或?yàn)榱?，不適宜作為海三棱藨草及其近緣種鑒定的候選DNA條形碼。

Starr等 （2009）研究了5個(gè)DNA條形碼片段（matK、rbcL、rpoC1、rpoB、trnH-psbA）在薹草屬下Deweyanae組、Phyllostachyae組和Griseae組植物中的表現(xiàn)，結(jié)果表明，單一的DNA條形碼片段的物種分辨率均不超過(guò)60%。在本研究中，單一片段在海三棱藨草及其近緣種中的鑒定效率最高為52.4%（matK），僅有11個(gè)個(gè)體被成功鑒定。這說(shuō)明采用單一片段均無(wú)法對(duì)海三棱藨草及其近緣種進(jìn)行有效區(qū)分。我們進(jìn)一步分析了DNA條形碼組合片段在海三棱藨草及其近緣種間的物種分辨率。葉綠體基因被認(rèn)為是作為一個(gè)整體（連鎖）遺傳的，所以各區(qū)段的葉綠體序列可以直接進(jìn)行聯(lián)合分析。本研究發(fā)現(xiàn)，將2個(gè)葉綠體基因條形碼序列進(jìn)行組合后，物種的鑒定效率相應(yīng)地提升了。matK + rbcL 和matK + ndhF 的片段組合的物種分辨率分別提升至61.9%和61.9%。這說(shuō)明對(duì)DNA條形碼進(jìn)行聯(lián)合分析能夠提供更多有效信息位點(diǎn)，從而提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性（Fazekas et al.， 2008）。被子植物的遺傳背景復(fù)雜，葉綠體基因序列相對(duì)保守，進(jìn)化緩慢，提供的信息位點(diǎn)數(shù)相對(duì)較少。Wang等（2011）研究表明核基因片段（ITS）可能與植物物種形成聯(lián)系更加緊密，序列的分化速度更快，劉建全（2015）建議將葉綠體基因片段與核基因組DNA條形碼一起用于植物近緣種的分類學(xué)研究。本研究發(fā)現(xiàn)ITS + matK 序列組合的物種鑒定效率為所有組合片段中最高（71.4%），基本上能實(shí)現(xiàn)對(duì)海三棱藨草及其近緣種的鑒別。綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本與收益、條形碼通用性和物種鑒定能力等因素，我們建議將ITS + matK 序列組合作為海三棱藨草及其近緣種鑒定的最佳DNA條形碼。

3.2 海三棱藨草的分類地位

海三棱藨草最初被認(rèn)為是雜交起源（唐進(jìn)和王發(fā)瓚，1965；Tatanov， 2007）；但從形態(tài)特征來(lái)看，其“具球莖；苞片2枚、葉狀、直立或散生”的特征與水蔥屬植物不符，而且小堅(jiān)果表面的網(wǎng)狀紋飾也與水蔥屬小堅(jiān)果的平滑型紋飾不符，應(yīng)將其歸入三棱草屬（Dai et al.， 2010）。本研究基于聯(lián)合的ITS + matK 序列構(gòu)建了海三棱藨草及其近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明海三棱藨草與三棱草屬的其他3個(gè)物種形成一支，明顯與水蔥屬分開，支持率為100%。因此，本研究結(jié)果不支持將海三棱藨草作為水蔥屬和三棱草屬的屬間雜交種，支持將其歸入三棱草屬，這與楊梅 （2010）基于ITS序列對(duì)海三棱藨草進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)論相符合。另外，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果還顯示，海三棱藨草與海濱三棱草形成單系，一方面為海三棱藨草和海濱三棱草是同一個(gè)物種提供了分子證據(jù)，另一方面，本研究中海濱三棱草只有一個(gè)樣品不與同種其他樣品最近而與海三棱藨草最近且后驗(yàn)概率僅為0.09。這意味著該節(jié)點(diǎn)可能不存在，但不排除兩個(gè)種互為單系的可能，即從分子證據(jù)上來(lái)說(shuō)海三棱藨草與海濱三棱草也可能是三棱草屬的兩個(gè)物種。結(jié)合形態(tài)學(xué)研究和二者的生境、分布區(qū)分析可以發(fā)現(xiàn)，海三棱藨草與海濱三棱草在形態(tài)上幾乎一致，唯有在小穗鱗片長(zhǎng)度和下位剛毛長(zhǎng)度上存在細(xì)微差異；二者生境一致，均為沿海沼澤或內(nèi)陸湖濱及河岸；二者分布區(qū)的區(qū)系成分基本一致（吳征鎰等，2010），但具體分布點(diǎn)差異較大，尤其是未見海三棱藨草國(guó)外分布的報(bào)道。這應(yīng)該是海三棱藨草和海濱三棱草兩種名長(zhǎng)期混淆所導(dǎo)致的。綜上認(rèn)為，本研究結(jié)果不支持海三棱藨草源自三棱水蔥和扁稈荊三棱種間雜交的說(shuō)法（Yang et al.， 2009），而應(yīng)將其納入三棱草屬中；不支持Koyama （1980）提出的海三棱藨草為扁桿荊三棱的異名觀點(diǎn)，支持海三棱藨草為海濱三棱草異名的推論（宋晨薇等，2019）。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)海三棱藨草及其近緣種的DNA條形碼研究，一方面篩選并明確了ITS + matK 組合序列為海三棱藨草及其近緣種分辨率最高的DNA條形碼片段組合，另一方面通過(guò)將分子、形態(tài)和植物地理學(xué)證據(jù)相結(jié)合，明確了應(yīng)將海三棱藨草納入三棱草屬中，其應(yīng)為海濱三棱草的異名，為今后海三棱藨草及其近緣種的分類學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)。本研究?jī)H選用了6組DNA條形碼候選序列進(jìn)行研究，有關(guān)三棱草屬植物的DNA條形碼研究有待進(jìn)一步展開。

致謝"感謝云南大學(xué)徐曉副教授、中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心鄧玲麗女士、上海汐言生態(tài)科技有限公司宋晨薇女士在標(biāo)本采集過(guò)程中給予的大力幫助與支持。

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（責(zé)任編輯"鄧斯麗）

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202303037

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張仕蘭等： 海三棱藨草及其近緣種的DNA條形碼研究

收稿日期： "2023-07-13"接受日期： ""2023-08-25

基金項(xiàng)目： "上海市自然科學(xué)基金（20ZR1416900）。

第一作者： 張仕蘭（1997—），碩士研究生，主要從事濕地生態(tài)學(xué)研究，（E-mail）cela_zhangshilan@163.com。

通信作者： "劉文亮， 博士，副研究員，研究方向?yàn)樯锒鄻有耘c系統(tǒng)演化，（E-mail）wlliu@sklec.ecnu.edu.cn。